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MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD8/FITC
Anti-Human CD4/RPE
Anti-Human CD3/APC
Codice TC660
Uso previsto
Per uso diagnostico In Vitro.
Il reagente TC660 è idoneo ad essere utilizzato nei test di citometria a flusso ed è destinato all’identificazione
dei sottogruppi di linfociti T positivi a CD8, CD4 e CD3. L’antigene CD8 è presente nei linfociti T
citotossici/soppressori ed è un utile marcatore per la valutazione dello stato immunologico dei pazienti.
L’antigene CD4 è presente nei linfociti T helper/inducer e costituisce un sottogruppo dei timociti maturi.
L’antigene CD3 è presente in tutti i linfociti T ed è un marcatore dei linfociti T normali e neoplastici.
L'interpretazione dei risultati deve tenere conto dell'anamnesi del paziente e deve basarsi su ulteriori esami
diagnostici eseguiti da un patologo qualificato.
Reagente fornito
Il prodotto TC660 include i tre anticorpi fluorescenti che seguono:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD8, Clone DK25, coniugato con isotiocianato di fluoresceina isomero 1
(FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4, Clone MT310, coniugato con R-ficoeritrina (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD3, Clone UCHT1, coniugato con alloficocianina (APC).
I tre coniugati del TC660 vengono prodotti a partire da anticorpi monoclonali di topo purificati, di isotipo IgG1,
kappa. Il reagente TC660 è fornito in forma liquida in un tampone contenente albumina di siero bovino (BSA)
all’1% e NaN3 15 mmol/L a pH 7,2. Ogni fiala contiene 50 test (20 µL di coniugato per un massimo di 106
leucociti di sangue periferico umano normale).
Specificità
La specificità dell’anti-CD8, DK25, è equivalente a quella degli anticorpi OKT8 e Leu-2a nel cluster CD8 (1).
L’anti-CD4, MT310, è stato introdotto nel Second International Workshop and Conference on Human Leucocyte
Differentiation Antigens (2° gruppo di lavoro e conferenza internazionale sugli antigeni di differenziazione dei
leucociti umani) e la sua reattività all’antigene CD4 è stata confermata da studi svolti in svariati laboratori (2).
L’anti-CD3, UCHT1, è stato introdotto nel First and Third International Workshops and Conferences on Human
Leucocyte Differentiation Antigens (1° e 3° gruppo di lavoro e conferenza internazionale sugli antigeni di
differenziazione dei leucociti umani) e la sua reattività all’antigene CD3 è stata confermata da studi svolti in
svariati laboratori (3). L’anti-CD3, UCHT1, reagisce con la catena  dell’antigene CD3 (4).
Precauzioni
1. Per uso professionale.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura.
Sebbene non sia classificato come prodotto a rischio, il contenuto di NaN 3 alle concentrazioni indicate può
reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo
smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l’eventuale accumulo di azide
metallica.
3. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
Conservazione
Conservare al buio a 2–8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i prodotti sono
conservati in condizioni difformi da quelle specificate, l’uso dei reagenti dovrà essere verificato dall’utente. Non
sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l’instabilità di questo prodotto, pertanto è opportuno
analizzare un controllo positivo e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una
colorazione imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia
dovuta ad un probabile problema dell'anticorpo, contattare l’Assistenza Tecnica.
Procedura per la colorazione 1.
Riempire una provetta per analisi da 12 mm x 75 mm in polistirene con 100 µL di sangue con anticoagulante
(EDTA).
2.
Aggiungere 20 µL di TC660 e miscelare delicatamente in un miscelatore vortex. La quantità (20 µL) è
indicativa: il volume ottimale deve essere determinato dai singoli laboratori.
3.
Il controllo negativo consigliato per il prodotto TC660 è un reagente Dako (codice X0978) coniugato
con FITC, RPE e APC, dello stesso isotipo del TC660. Aggiungere 20 L di X0978 nel campione e miscelare
delicatamente in un miscelatore vortex. La quantità (20 µL) è indicativa: il volume ottimale deve essere
determinato dai singoli laboratori.
(110566-003)
4.
Incubare al buio a 4 °C per 30 minuti o a temperatura ambiente (20–25 °C) per 15–30 minuti.
5.
Aggiungere 100 µL di Reagente A (Dako Uti-Lyse™, codice S3325 o S3350) in ciascun campione e
miscelare delicatamente in un miscelatore vortex. Incubare per 10 minuti al buio, a temperatura
ambiente.
6.
Aggiungere 1 mL di Reagente B (Dako Uti-Lyse™) in ciascun campione e miscelare delicatamente in un
miscelatore vortex. Incubare per 10 minuti al buio, a temperatura ambiente. Se si usa un altro reagente di lisi
nei passaggi 5 e 6, seguire le istruzioni corrispondenti.
TC660/IT/TJA/23.08.04 p. 1/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
7.
Centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Aspirare delicatamente il supernatante ed eliminarlo lasciando circa
50 µL di liquido.
8.
Aggiungere 2 mL di soluzione PBS contenente albumina di siero bovino al 2% e risospendere le cellule
usando un miscelatore vortex.
9.
Ripetere il passaggio 7.
10.
Risospendere il pellet in un liquido adatto alla citometria a flusso, ad esempio 0,3 mL di soluzione PBS
(codice S3024). Se i campioni non vengono analizzati il giorno stesso, la soluzione PBS deve contenere
paraformaldeide all’1% come fissativo.
11.
Analizzare con un citometro a flusso o conservare al buio a 2–8 °C fino al momento dell’analisi.
I campioni possono essere analizzati fino a 24 ore dopo la lisi.
Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato,
pertanto dovranno essere definite autonomamente da ogni laboratorio. Si consiglia di includere un campione di
controllo positivo e un campione di controllo negativo in ogni ciclo di analisi, in modo da verificare il
funzionamento di reagenti e preparati. I coniugati di fluorocromo sono fotosensibili, pertanto i campioni devono
essere protetti dalla luce durante la procedura di colorazione e fino al momento dell’analisi.
In alcuni stati patologici, i risultati potrebbero rivelare un numero anomalo di cellule che esprimono gli antigeni
bersaglio oppure livelli di espressione dell’antigene errati. Ciò potrebbe riflettersi nel pattern di colorazione. Per
eseguire l’analisi in modo corretto, è importante conoscere il normale pattern di espressione degli antigeni e il
modo in cui questi si relazionano all’espressione di altri antigeni pertinenti.
I reagenti policromatici sono da preferirsi all’analisi monocromatica ai fini dell’esame globale delle cellule
neoplastiche di leucemie e linfomi. Il corretto uso della compensazione dei colori assume particolare
importanza nelle analisi policromatiche. La combinazione di FITC, RPE e APC è particolarmente semplice, in
quanto la sovrapposizione degli spettri cromatici è minima durante l’emissione dei colori di questi fluorocromi.
Bibliografia
1.
Miedema F, Terpstra FG, Melief CJM. T cell-dependent immunoglobulin synthesis in the human system.
Studies with T cell-specific monoclonal antibodies. In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID,
editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the 2nd International Workshop on Human Leukocyte
Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston, USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: SpringerVerlag; 1986. Volume I. p. 213-22.
2.
Stein H, Lennert K, Feller AC, Mason DY. Immunohistological analysis of human lymphoma: correlation of
histological and immunological categories. Adv Cancer Res 1984;42:67-147
3.
McMichael AJ, Gotch FM. T-cell antigens: new and previously defined clusters. In: McMichael AJ,
Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch FM, et al., editors. Leucocyte typing III. White
cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd International Workshop and Conference; 1986 Sept
21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1987. p.31-62.
4.
Tunnacliffe A, Olsson C, Traunecker A, Krissansen GW, Karjalainen K, de la Hera A. T3.2. The majority
of CD3 epitopes are conferred by the epsilon chain. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP,
Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leucocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings
of the 4th International Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York,
Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 295-6.
Stein H, Lennert K, Feller AC, Mason DY.
Immunohistological analysis of human lymphoma: correlation of histological and immunological categories.
Adv Cancer Res 1984;42:67-147.
Spiegazione dei simboli
(110566-003)
Numero di catalogo
Limiti di temperatura
Utilizzare entro
Dispositivo medico-diagnostico
in vitro
Tenere al riparo dalla luce del
sole (vedere il paragrafo
Conservazione)
Fabbricante
Consultare le istruzioni per
l’uso
Codice del lotto
TC660/IT/TJA/23.08.04 p. 2/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17