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Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen, Clone Ki-67
Codice N. F 0788 FITC-Conjugated
Codice N. R 0840 RPE-Conjugated
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
F 0788 e R 0840 sono destinati all’uso in citometria a flusso. L’antigene anti Ki-67 è utile per valutare la
proliferazione cellulare nella leucemia acuta, nei disordini linfoproliferativi e nel cancro alla mammella (1-3).
L’interpretazione dei risultati deve essere eseguita da personale certificato in base all’anamnesi del paziente e
agli altri esami diagnostici.
Introduzione
L’antigene Ki-67 è una proteina nucleare definita dalla sua reattività con l’anticorpo monoclonale proveniente
dal clone Ki-67 (4, 5). Durante l’interfase l’antigene può essere rilevato solo nel nucleo, mentre nella mitosi la
maggioranza della proteina è rilocalizzata a livello della superficie dei cromosomi (4). Il loco completo del gene
di Ki-67 è stato sequenziato; misura circa 30.000 paia di basi, organizzate in 15 esoni con dimensione che
variano da 67 a 6845 paia di basi e in 14 introni con dimensioni comprese tra 87 e 3569 paia di basi. Il gene è
localizzato sul cromosoma 10 (6).
La proteina Ki-67 è espressa in tutte le cellule proliferative durante le fasi G1 tardiva, S, M e G2 del ciclo cellulare,
mentre è assente nella fase G0 (cellule non nel ciclo). Le cellule normali non stimolate non esprimono l’antigene Ki67 (4, 5).
Numerosi studi hanno mostrato l’uso dell’anti antigene Ki-67 per la misurazione dell’indice di marcatura del Ki-67 o
della frazione di crescita in vari tumori solidi utilizzando i metodi immunoistochimici (4).
L’analisi della citometria a flusso si è dimostrata un metodo utile per rilevare l’antigene Ki-67 e valutare la
proliferazione cellulare nelle cellule tumorali come alternativa alla determinazione della fase S del ciclo cellulare,
alla marcatura continua con 3H-timidina, arancio di acridina e bromodeossiuridina (7, 8).
Reagente fornito
I coniugati anti antigene Ki-67, F 0788 e R 0840, sono stati prodotti da un anticorpo monoclonale murino
purificato. I coniugati sono forniti in forma liquida in un tampone contenente albumina di siero bovino (BSA) 1%
e NaN3 15 mmol/L, pH 7,2. Ogni fiala contiene 100 test (10 L di coniugato per 106 leucociti da sangue umano
periferico normale).
Isotipo: IgG1, kappa. Concentrazione del coniugato mg/L: vedere l’etichetta sulla fiala.
Anticorpo
codice n.
Fluorocromo
Controllo negativo
codice n.
F 0788
FITC (Isomero fluoresceina-isotiocianato 1)
X 0927
R 0840
RPE (R-ficoeritrina)
X 0928
Immunogeno
Frazione nucleare cruda di cellule L428 (4).
Specificità
L’analisi immunoistochimica e la citometria a flusso hanno mostrato che l’anti antigene Ki-67 reagisce
negativamente o debolmente con le cellule non stimolate provenienti dai donatori sani (1-3, 5).
L’analisi mediante citometria a flusso di campioni di cancro alla mammella hanno dimostrato che l’anti antigene
Ki-67 marcava le cellule del tumore proliferante (2, 3). Uno studio di 438 casi di cancro alla mammella
mostrava livelli variabili di espressione cellulare di Ki-67 (1 – 60% sopra il livello normale) (2). I carcinoma
lobulari infiltranti mostravano un’espressione inferiore dell’antigene Ki-67 rispetto ai carcinoma duttali. I livelli
più alti di antigene Ki-67 si riscontravano nei carcinoma midollari. Un altro studio con 154 casi di cancro alla
mammella mostrava livelli di espressione cellulare dell’antigene Ki-67 totali (tutti le fasi del ciclo cellulare:
G0+G1, S+G2M) e in fase G1 che variavano da 5 a 100% e da 2 a 95% rispettivamente (3). In entrambi i casi vi
era una correlazione positiva tra la frazione e la colorazione di Ki-67 nella fase S o S+G2M (2, 3).
L’antigene anti Ki-67 reagisce anche con le cellule neoplastiche proliferanti della leucemia linfoblastica acuta
(ALL), della leucemia mieloide acuta (AML), della leucemia mieloide cronica (CML), della leucemia mieloide
cronica in crisi blastica (CNL-BC), della leucemia linfocitica cronica a cellule B (B-CLL), della leucemia a cellule
capellute (HCL), della leucemia prolinfocitica (PLL) e dell’immunocitoma (IC). I risultati mostrano livelli cellulari
elevati dell’antigene Ki-67 nei casi della ALL (10 - 65%), dell’IC (10 - 44%), della B-CLL (fino al 20%) e della
CML-BC (10 – 35%). La leucemia prolinfocitica e la leucemia a cellule capellute presentano livelli inferiori
dell’antigene Ki-67 (1).
Precauzioni
1. Per operatori specializzati.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle
concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma la sodio azide potrebbe reagire con
le tubature in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Per lo smaltimento del prodotto è
consigliabile sciacquare abbondantemente per prevenire la formazione di azidi metalliche nelle tubature.
3. Come per ogni prodotto di derivazione biologica, utilizzare procedure di manipolazione adeguate.
Conservazione
Conservare al buio a 2-8 C. Non utilizzare dopo la data di scadenza, stampata sulla fiala. Se i reagenti non
sono conservati secondo le condizioni prescritte, è necessario che l'operatore ne verifichi le condizioni. Non vi
sono segni specifici che possono indicare l’instabilità del prodotto, quindi il controllo positivo e quello negativo
devono essere testati contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Qualora si osservi una colorazione
(104080-003)
F 0788/R 0840/IT/SSA/01.03.03 p 1/2
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inattesa, che non può essere giustificata da variazioni delle procedure di laboratorio, e si sospetti un problema
con l’anticorpo, contattare il nostro Servizio Tecnico.
Procedura di colorazione
1.
2.
Raccogliere le cellule e determinarne il numero totale. Lavare due volte nel tampone di lavaggio. (Se
necessario, si può utilizzare questa procedura anche con i campioni di sangue intero.)
Se richiesto, colorare gli antigeni della superficie cellulare utilizzando gli anticorpi monoclonali coniugati
adeguati direttamente in questa fase. Dopo la colorazione, lavare le cellule una volta in PBS ed eliminare
il supernatante.
N.B: i coniugati con fitoeritrina non sono adatti per la rilevazione degli antigeni della superficie cellulare
utilizzando questo metodo.
3.
Aggiungere il Dako IntraStain Reagent A (Fissazione), codice nr. K2311, utilizzando 50 L per 1 x 106
cellule. Mischiare lievemente con il vortex in modo che le cellule siano in sospensione.
4.
Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
5.
Aggiungere 500 L di metanolo assoluto freddo (-20 C). Mischiare lievemente con il vortex e incubare per
10 minuti a temperatura ambiente.
6.
Aggiungere 2 ml di PBS e mischiare lievemente con il vortex.
7.
Centrifugare a 300 x g x 5 minuti, quindi aspirare il supernatante, lasciando circa 50 l di liquido.
8.
Mischiare abbondantemente con il vortex in modo che le cellule siano in sospensione e aggiungere il
Dako IntraStain Reagent B (Permeabilizzazione), codice nr. K 2311, utilizzando 50L per 1 x 106 cellule.
9.
Aggiungere 10 L di anti antigene Ki-67 coniugato. Mischiare gentilmente con il vortex in modo che le
cellule siano in sospensione.
10. Come controllo negativo, utilizzare un anticorpo monoclonale non reattivo dello stesso isotipo e coniugato con
lo stesso fluorocromo (vedere tabella).
11. Incubare al buio a 4 °C per 30 minuti.
12. Ripetere i passaggi 6 e 7.
13. Risospendere in 0,25 ml di paraformaldeide 0,5% (fissativo) in PBS 0,01 mol/L, pH 7,4.
14. Analizzare mediante citometria a flusso.
Si consiglia di inserire un controllo negativo e un controllo positivo adatti per ogni sessione di analisi per il
reagente e la preparazione di controllo. Notare che i coniugati con il fluorocromo sono fotosensibili e i campioni
devono essere protetti dalla luce durante la procedura di colorazione e per tutta la durata dell’analisi.
Riferimenti bibliografici
1.
Drach J, Gattringer C, Glassl H, Schwarting R, Stein H, Huber H. Simultaneous flow cytometric analysis of
surface markers and nuclear Ki-67 antigen in leukemia and lymphoma. Cytometry 1989;10:743-9.
2.
Gorisse M-C, Venteo L, Pluot M. A method for simultaneous quantification of monoclonal antibody Ki-67
and DNA content by flow cytometry. Application to breast carcinomas. Anal Quant Cytol Histol 1999;21:816.
3.
Steck K, Hunt K, Tucker S, Singletary S, El-Naggar AK. Flow cytometric analysis of Ki-67 in invasive
ductal carcinoma of the breast: correlation with tumor and patient characteristics. Oncology Reports
1999;6:835-8.
4.
Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol 2000;182:31122.
Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a
human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer 1983;31:13-20.
Duchrow M, Schlüter C, Wohlenberg C, Flad H-D, Gerdes J. Molecular characterization of the gene locus
of the human cell proliferation-associated nuclear protein defined by monoclonal antibody Ki-67. Cell
Prolif 1996;29:1-12.
Keng PC, Siemann DW. Measurement of proliferation activities in human tumor models: a comparison of
flow cytometric methods, Radiat Oncol Invest 1998;6:120-7.
5.
6.
7.
8.
Endl E, Hollmann C, Gerdes J. Chapter 18. Antibodies against the Ki-67 Protein: Assesment of the
Growth Fraction and Tools for Cell Cycle Analysis. In: Darzynkiewicz Z, Crissman HA, Robinson JP,
editors. Methods in Cell Biology; Academic Press; 2001 Vol 63 p. 399-415.
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