6) metodo di studio dei batteri

Metodi di studio dei
batteri
Esame microscopico
Microscopia ottica
Campo chiaro
campo scuro
(luce diffratta o diffusa)
contrasto di
fase
(indice di
rifrazione)
Esame microscopico
• Preparazione in sol. Fisiologica
• Metodo della goccia pendente
• Colorazione semplice
• Colorazioni differenziali
Esame allo
stato vivente
Esame previa
fissazione
Preparazione in sol.
Fisiologica
Metodo della goccia
pendente
Preparazione in inchiostro
di china
(colorazione della capsula)
Colorazione di Gram
Colorazioni per l’acido-alcool
resistenza
Colorazione di Kinyoun
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Colorazione con auramina
Colorazioni in fluorescenza
Utilizzo di fluorocromi: una molecola fluorescente emette luce ad
una lunghezza d’onda superiore rispetto a quella della luce su essa
incidente. Es: fluoresceina (verde), propidio (rosso)
Tecniche Colturali
Tecniche di inoculazione
Terreni di coltura
• Isolamento degli agenti patogeni causa
di infezione
• Isolamento e conta dei microgranismi
• Identificazione dei microrganismi
• Mantenimento in coltura
• Test di sensibilità agli antimicrobici
• Studio delle caratteristiche
biochimiche, fisiologiche, ecc…
• Valutazione dell’attività biologica di
preparati farmaceutici
Terreni di coltura (2)
LIQUIDI
•
•
•
•
SOLIDI
(BRODI)
(1-2% Agar)
Terreni universali
Terreni di arricchimento o elettivi: brodi che
favoriscono la crescita più rapida di un particolare
microrganismo che altrimenti verrebbe sopraffatto
da altri batteri presenti in una miscela microbica
Terreni selettivi: contengono particolari sostanze
capaci di inibire la crescita di alcuni batteri favorendo
lo sviluppo di altri
Terreni differenziali: contengono indicatori che
consentono di distinguere tra loro microrganismi
differenti, sfruttando il diverso aspetto delle
colonie, dopo crescita su terreni solidi
Principali componenti dei terreni
di coltura (1)
•
•
•
•
•
Nutrienti: proteine, peptidi, aminoacidi
Energetici: carboidrati (glucosio)
Metalli e minerali essenziali
Agenti tamponanti: fosfati, acetati (pH)
Indicatori di variazione del pH: rosso fenolo,
bromo-cresol porpora, fucsina, ecc. Mettono in
evidenza la fermentazione di specifici carboidrati
in un terreno colturale cambiando di colore in
maniera netta e rapida a valori critici di pH
Principali componenti dei terreni
di coltura (2)
• Agenti selettivi: agenti chimici (sali biliari,
coloranti, ecc.) o antimicrobici (poiché termolabili,
vanno aggiunti dopo sterilizzazione)
• Sostanze gelificanti: agar. Caratteristiche:
inerzia nei confronti dei batteri, particolari
temperature di solidificazione e di fusione (38°C
e 84 °C), scarsa tossicità, trasparenza
• Altri componenti: fattori di crescita per i
microrganismi particolarmente esigenti (Es:
fattori V e X per Haemophilus influenzae),
Condizioni di incubazione
• Temperatura ottimale: i batteri patogeni sono
mesofili con un optimum intorno ai 36°C
• Concentrazione di CO2 : nel caso dei microaerofili
deve essere del 10%
• Presenza di ossigeno per i batteri aerobi
• Eliminazione dell’ossigeno per la coltura degli
anaerobi obbligati: l’aria viene sostituita con un
gas inerte (azoto) o dove l’ossigeno viene
eliminato mediante particolari reazioni chimiche.
SVILUPPO DEI BATTERI IN TERRENI LIQUIDI
-Latenza
-Fase esponenziale o logaritmica (coltura giovane)
-Fase di decelerazione della crescita
-Fase stazionaria (coltura vecchia)
-Fase di morte o fase di declino
Colture continue: Chemostato (sottrazione continua del
terreno invecchiato e continua aggiunta di un’eguale
quantità di terreno fresco)
I microrganismi ad occhio
nudo: crescita in substrati
liquidi
SVILUPPO DEI BATTERI IN
TERRENI SOLIDI
• Inoculati alla superficie di un terreno gelificato con
agar i batteri possono crescere formando una patina o
colonie isolate a seconda della quantità di inoculum
originale.
• Colonie S (da smooth = liscio): sono lisce, di consistenza
cremosa
• Colonie R (da rough = rugoso): sono più secche, con
superficie rugosa e margini frastagliati.
• Colonie mucose: capsula abbondante
COLTURE DI MANTENIMENTO
• Temperature inferiori a quelle ottimali, dopo che lo
sviluppo batterico ha raggiunto l’inizio della fase
stazionaria
• Essiccamento in liquidi ricchi di sostanze proteiche o
liofilizzazione
ESEMPI DEI PIU’
COMUNI TERRENI DI
COLTURA
• Mueller Hinton Agar:
Terreno raccomandato per i test
di sensibilità agli antibiotici
(metodo di Kirby-Bauer)
ESEMPI DEI PIU’
COMUNI TERRENI DI
COLTURA 3
• CLED Medium (Cystine – Lactose –
Electrolyte - Deficient): agar per
colture su piastra di microrganismi
urinari. Per lo scarso contenuto di
elettroliti, impedisce la diffusione
del Proteus.
ESEMPI DEI PIU’ COMUNI
TERRENI DI COLTURA
• Agar sangue: all’agar base [estratto di carne, peptone,
sodio cloruro] può essere aggiunto:
– Sangue defibrinato di cavallo (Haemophilus
– Sangue defibrinato di montone
influenzae)
(Streptococchi beta
emolitici)
– Sangue defibrinato umano (Gardnerella
streptococchi)
– Sangue ossalato di cavallo
(satellitismo)
vaginalis; no
ESEMPI DEI PIU’
COMUNI TERRENI DI
COLTURA (4)
– MacConkey Agar N.3: Terreno selettivo per
differenziare in modo ottimale i coliformi
(color rosso violetto) ed i batteri non
fermentanti il lattosio (incolori). I sali biliari
ed il cristal violetto inibiscono totalmente i
Gram-positivi
– Salmonella Shigella Agar (SS): è un terreno selettivo e
differenziale, indicato per l’isolamento di Salmonella dalle feci
e da altri campioni. Shigella ed altri microrganismi crescono
dando colonie piccole incolori con centro nero per la
precipitazione di solfato di ferro indotta dalla produzione di
idrogeno solforato a partire dal tiosolfato sodico presente nel
terreno.
ESEMPI DEI PIU’
COMUNI TERRENI DI
COLTURA (5)
– Cetrimide Agar:
Terreno selettivo per
l’isolamento e
l’identificazione
presuntiva di
Pseudomonas aeruginosa.
Il cloruro di magnesio e
il solfato di potassio
sono aggiunti per
stimolare la produzione
di pigmento e la
cetrimide inibisce la
crescita della maggior
parte dei microrganismi,
esclusa Pseudomonas
aeruginosa
• Mannitol Salt Agar: E’ un terreno selettivo
preparato secondo i suggerimenti di Chapman
per l’isolamento di stafilococchi presunti
patogeni.
ESEMPI DEI PIU’ COMUNI TERRENI DI COLTURA (6)
Bile Esculina
Agar:[peptone, sali biliari,
citrato ferrino, esculina,
agar] Terreno differenziale
per l’isolamento e
l’identificazione presuntiva
degli Enterococchi.
– Sabouraud Dextrose Agar: [peptone
micologico, destrosio, agar, ev. penicillina,
streptomicina, cicloeximide, cloramfenicolo].
Terreno acido indicato per l’isolamento di
dermatofiti e di altri funghi e lieviti
– Agar cioccolato
Terreno selettivo per
Micobatteri
Lowenstein-Jensen
Identificazione mediante prove
biochimiche
Antibiogramma
Microbiologia molecolare
Disinfezione
Sterilizzazione
Disinfezione e Sterilizzazione
• DISINFEZIONE
Qualsiasi procedimento che si prefigga la
uccisione di microrganismi patogeni
presenti nell’ambiente
• STERILIZZAZIONE
Qualsiasi procedimento che si prefigga la
distruzione di tutti i microrganismi
(patogeni e non) presenti in un
determinato materiale
• DISINFEZIONE
MECCANISMI dei DISINFETTANTI
Denaturazione delle proteine
(formaldeide, glutaraldeide, ossido di
etilene)
Ossidazione di enzimi
(perossidi, cloro, ipocloriti, iodio)
Alterazione delle membrane
(alcooli, fenoli, composti dell’ammonio
quaternario, clorexidina)
• DISINFEZIONE
SCELTA dei DISINFETTANTI
Concentrazione attiva
Tossicità
Danneggiamento del substrato da
disinfettare
Presenza nel substrato di inibitori del
disinfettante
Tempo minimo di applicazione
Sterilizzare materiali e
substrati
La sterilizzazione (eliminazione di tutti gli organismi viventi)
può essere ottenuta:
• con metodi fisici
• calore
• secco
• umido
• radiazioni
• UV
• raggi g
• filtrazione
• con metodi chimici
• ossido di etilene
La scelta del metodo di sterilizzazione dipende dal materiale
da trattare
La sterilizzazione con calore.
• Il calore è da sempre uno dei mezzi più utilizzati per
la sterilizzazione. E’ possibile usare:
• calore secco (per vetreria, strumenti in metallo): in
stufa a circolazione d’aria, con il materiale avvolto in
fogli di alluminio, carta speciale o in contenitori:
170°C, 90 min o 180°C, 60 min.
• calore umido (per substrati, vetreria, materiali in
plastica): in autoclavi verticali o orizzontali: 121,1°C
(1 atm. Di pressione) per 15-20 min.
• Tempi e temperature di trattamento sono più ridotti
nella sterilizzazione con calore umido perché:
• i microrganismi in forma essiccata sono più
resistenti
• la trasmissione del calore è più efficace in vapore
d’acqua
Le autoclavi da laboratorio
coperchio
termostato
manometro
termometro
cestello
La sterilizzazione per
filtrazione
Un filtro di profondità (a), un
filtro in acetato di cellulosa
tradizionale (b) e un filtro
Nucleopore
Microrganismi
immobilizzati sulla
superficie di un filtro
La sterilizzazione per
filtrazione
Supporto di
filtrazione
riutilizzabile in
policarbonato
Unità di filtrazione
in linea in acciaio
Filtri da siringa
Membrane in
acetato di
cellulosa
Unità di filtrazione
in linea in
policarbonato