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4 4.1. LLA COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI FINALITÀ DELLE COLTURE MICROBICHE Le coltivazioni dei microrganismi sono attività che hanno la finalità di rendere disponibili elevate quantità di materiale microbico per sviluppare adeguatamente le indagini di laboratorio e consentire quelle applicazioni pratiche, in cui i microrganismi sono coinvolti. Le colture (figg. 4.2 e 4.3) sono allestite per diversi scopi, come ad esempio per: • evidenziare la presenza di specie patogene in un campione di provenienza umana, animale ed ambientale; • studiare i microrganismi dal punto di vista fisiologico, biochimico, molecolare e genetico; • studiare le interazioni microbiche con gli altri organismi e l’ambiente circostante; • valutare l’attività antimicrobica di sostanze come antibiotici e disinfettanti; • determinare in un prodotto la concentrazione di sostanze essenziali, come vitamine ed aminoacidi; • determinare la concentrazione microbica in un determinato campione; • controllare la sterilità dei prodotti farmaceutici. FIGURA 4.2 ◗ Colture microbiche in piastra. 4.2. TERRENI DI COLTURA 4.2.1. Aspetti generali I substrati in cui è possibile far riprodurre i microrganismi vengono definiti terreni di coltura. Se si esamina l’evoluzio- FIGURA 4.1 ◗ Colture pure di alcuni batteri del genere Bacillus. ne dei sistemi adottati nella coltivazione dei microrganismi nel corso del tempo, si può evidenziare la stretta relazione tra i miglioramenti apportati ai substrati nutrizionali e il progresso delle conoscenze fisiologiche e nutrizionali. Così, se i primi terreni impiegati nelle coltivazioni microbiche erano costituiti da terreni naturali o empirici (i cui ingredienti erano costituiti da semplici materiali presenti in FIGURA 4.3 ◗ Colture microbiche in provetta. 1 2 Le basi microbiologiche della Biochimica natura), ora per le indagini biochimiche e genetiche, è possibile utilizzare terreni di cui sono note tutte le componenti e di ognuna di esse la relativa concentrazione (terreni sintetici). A completamento di quanto descritto, deve essere evidenziato che, nella maggior parte dei casi, i terreni impiegati sono i cosiddetti terreni semisintetici; in essi, alcune componenti sono naturali, mentre altre sono a concentrazione nota. In laboratorio i terreni di coltura erano ottenuti partendo dai singoli ingredienti, attraverso un complesso procedimento di preparazione. Ora in commercio sono disponibili terreni di coltura disidratati prodotti da numerose ditte specializzate (Oxoid, Biolife, Difco, Merck, Biomerieux, ecc.) e terreni pronti all’uso in piastra, in provetta o in altri contenitori. Per la comune routine, l’impiego dei terreni disidratati è vantaggioso in quanto permette il contenimento dei costi e un’agevole preparazione di terreni standardizzati (fig. 4.4) che, per la composizione costante e bilanciata, consentono una soddisfacente ripetitività dei risultati. Inoltre, con alcune semplici accortezze possono essere conservati in laboratorio (fig. 4.5) per tempi piuttosto lunghi (anche alcuni anni). In generale tutti i terreni di coltura devono essere dotati di due caratteristiche fondamentali: • devono fornire tutte le componenti nutrizionali ed i fattori chimico-fisici adatti alla crescita delle specie microbiche ricercate. Le componenti nutrizionali devono essere caratterizzate da un giusto apporto di: carbonio, azoto, zolfo, oltre che dei fattori di crescita essenziali, sali minerali e acqua. Per quanto riguarda i fattori chimico-fisici, i valori del pH, della pressione osmotica e del potenziale redox devono essere su livelli idonei al tipo di flora ricercata; FIGURA 4.5 ◗ Terreni di coltura disidratati e ingredienti per la loro costituzione, conservati in armadio. • devono essere assolutamente privi di qualsiasi contaminazione. Anche la minima presenza di agenti microbici, comporta l’inevitabile alterazione delle componenti costitutive del terreno, oltre che interferenza con le specie microbiche studiate e conseguente inattendibilità dei risultati. Per tutto ciò i terreni contaminati sono del tutto inidonei a qualsiasi tipo di impiego. 4.2.2. Classificazione I terreni di coltura possono essere classificati in base: • alla composizione, in naturali, sintetici e semisintetici; • alle caratteristiche colturali, in elettivi o di arricchimento, selettivi, differenziali e ad uso generale; • allo stato fisico, in liquidi, solidi e semisolidi. 4.2.2.1. FIGURA 4.4 ◗ Agar nutriente a becco di clarino ottenuto da terreno disidratato. Terreni naturali I primi microbiologi impiegavano terreni di coltura suggeriti dall’esperienza fondata sull’osservazione; tali substrati nutrizionali erano costituiti da prodotti naturali (come il latte, il sangue diluito, gli infusi di carne e di vegetali), per riprodurre in laboratorio le condizioni constatate in natura. I terreni preparati con queste caratteristiche erano definiti naturali o empirici. La maggior parte dei terreni naturali impiegati oggi, contiene circa il 2% di proteine parzialmente digerite con enzimi peptici o pancreatici o mediante idrolisi acida. I prodotti della digestione delle proteine sono definiti peptoni. Tra questi, i peptoni pancreatici sono quelli maggiormente idrolizzati e, quindi, con un elevato contenuto di oligopeptidi e aminoacidi liberi. L’idrolisi acida comporta la presenza di aminoacidi liberi con possibile racemizzazione e alterazione di alcune proprietà. I peptoni sono distinti in Capitolo 4. La coltivazione dei microrganismi Brodo nutriente Estratto di carne NaCl Acqua distillata pH = 7,1 ± 0,2 g 3 g 5 ml 1000 È un terreno liquido a uso generale impiegato per la coltura di microrganismi poco esigenti. Agar nutriente Peptone Estratto di carne NaCl Agar-agar Acqua distillata pH = 7,1 ± 0,2 g 10 g 3 g 5 g 15 ml 1000 È un terreno solido a uso generale impiegato per la coltura di microrganismi poco esigenti. rapporto al prodotto di partenza in: peptoni di carne, di soia, di caseina, di pesce. Poiché non sempre riescono a fornire un giusto apporto di nutrienti, si ricorre spesso all’impiego di estratti di carne e di lievito e all’aggiunta di fattori di crescita e di prodotti naturali, come il siero e il sangue. 4.2.2.2. Terreni sintetici e semisintetici A differenza dei terreni empirici, la cui composizione non risulta mai costante, i terreni sintetici sono delle soluzioni di componenti chimiche pure, a concentrazioni definite, in acqua distillata. Questi terreni, presentano una diversa composizione in rapporto alle specifiche esigenze nutrizionali dei microrganismi coltivati; vengono impiegati per studi sulla nutrizione, sul metabolismo e sul dosaggio microbiologico delle vitamine e degli aminoacidi. In questi terreni la fonte di carbonio può essere costituita da glucidi, come glucosio, lattosio o da acidi organici, come il citrato, il lattato o il tartrato. La fonte d’azoto più comune è rappresentata da aminoacidi o, per i poco esigenti, da sali ammoniacali o nitrati. È sempre necessaria un’ampia disponibilità di cationi (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Fe2+, Cu+, ecc.) e di anioni (SO42–, PO43–, ecc.). Com’è stato indicato in precedenza, gran parte dei terreni di coltura utilizzati in laboratorio per la routine, è costituita da terreni semisintetici in cui sono presenti, oltre a quelle naturali, componenti a concentrazioni note. 4.2.2.3. Brodo sangue Peptone Estratto di carne NaCl Sangue defibrinato Acqua distillata pH = 7,1 ± 0,2 g 10 g 3 g 5 ml 100 ml 1000 Terreno liquido idoneo alla crescita di microrganismi moderatamente esigenti o per rivitalizzare microrganismi stressati. Agar sangue Peptone Estratto di carne NaCl Sangue defibrinato Agar-agar Acqua distillata pH = 7,1 ± 0,2 g 10 g 3 g 5 ml 100 g 15 ml 1000 Terreno agarizzato adatto alla crescita di microrganismi moderatamente esigenti o per rivitalizzare microrganismi stressati. 4.2.2.4. Terreni elettivi o d’arricchimento I terreni elettivi contengono sostanze in grado di facilitare lo sviluppo delle specie particolarmente esigenti, che trovano difficoltà a crescere sui terreni a uso generale. Sono impiegati spesso anche nell’allestimento di subculture, con cui si rivitalizzano i microrganismi “stressati” da trattamenti chimico-fisici intensi (ad esempio alta temperatura), o da colture selettive. Sono ottenuti aggiungendo ai terreni nutritivi di base prodotti ad alto valore nutrizionale, come il sangue e il siero. 4.2.2.5. Terreni selettivi Sono terreni in grado di selezionare un determinato gruppo microbico inibendo, al contempo, la crescita di specie indesiderate. Sono largamente utilizzati nelle colture d’isolamento di molte specie microbiche. L’azione selettiva dei terreni è resa possibile dall’impiego di sostanze inibenti come gli antibiotici, i sali ad alta concentrazione e alcuni coloranti. 4.2.2.6. Terreni differenziali I terreni differenziali sono largamente impiegati nelle prove d’identificazione; consentono il riconoscimento delle Terreni a uso generale Sono terreni in grado di permettere la crescita di un’ampia gamma di microrganismi; non esiste, tuttavia, un terreno universale capace di far crescere tutte le specie microbiche. Terreno di Lowenstein per micobatteri (un classico terreno elettivo) Potassio fosfato monobasico g 2,4 Magnesio solfato · 7H2O g 0,24 Magnesio citrato g 0,6 Asparagina g 3,6 Glicerina g 12 Acqua distillata ml 600 Fecola di patate g 30 Uova intere omogeneizzate ml 1000 Verde malachite, sol. acquosa ml 20 3 Brodo di Sabouraud Peptone Estratto di carne Destrosio Sodio cloruro Acqua distillata pH = 5,7 g 10 g 3 g 40 g 7,5 ml 1000 È un terreno liquido moderatamente selettivo impiegato per la coltura di micromiceti quali i lieviti e le muffe. L’attività selettiva è dovuta al pH acido e all’alta concentrazione di D-glucosio, che si dimostrano inibenti nei confronti di gran parte della flora batterica. Agar di Sabouraud con CAF (Cloramfenicolo) Peptone g 10 Estratto di carne g 3 Destrosio g 40 Sodio cloruro g 7,5 CAF mg 50-500 Agar-agar g 20-25 Acqua distillata ml 1000 pH = 5,7 È un terreno solido selettivo impiegato per la coltura dei micromiceti. L’azione selettiva è prodotta dal Cloramfenicolo (un antibiotico termostabile attivo nei confronti della flora batterica), dal pH acido e dall’alta concentrazione di glucosio, attivi nei confronti di gran parte della flora batterica. 4 Le basi microbiologiche della Biochimica FIGURA 4.6 ◗ FIGURA 4.7 ◗ Colonie di batteri fermentanti il lattosio (rosse). producono metaboliti acidi che abbassano il pH; tale diminuzione è messa in luce da un indicatore di pH come il rosso neutro che, incolore a pH neutro, diviene rosso a pH acido. Ne consegue che le colonie dei batteri fermentanti il lattosio (come Escherichia e Klebsiella, fig. 4.6), si presentano rosse, mentre le colonie dei non fermentanti il lattosio, (come Salmonella e Shigella, fig. 4.7), appaiono incolori. Nell’MSA (Mannitol Salt Agar) il sistema differenziale opera con lo stesso principio, ma impiega come sostanza differenziante il mannitolo e, come rivelatore, il rosso fenolo. specie isolate, attraverso la dimostrazione di particolari proprietà possedute dalle colture microbiche. Molti terreni possiedono un sistema differenziale costituito da: • una sostanza differenziante, di cui viene esaminata l’utilizzazione o meno da parte delle specie isolate; • un componente rivelatore, in grado di evidenziare l’utilizzazione o meno della sostanza differenziante. Nel terreno come l’agar Mac Conkey, adatto alla crescita degli enterobatteri, tale sistema differenziale è costituito dal lattosio (differenziante) e dal rosso neutro (rivelatore). Nel caso in cui le specie microbiche fermentino il lattosio, si Lattosio fermentanti Escherichia Klebsiella Generi Modificazioni del sistema differenziale pH acido rosso Effetti prodotti Fermentazione + Lattosio non fermentanti Shigella Salmonella Lattosio Fermentazione – Rosso neutro Colonie rosse Brodo Mac Conkey Peptone Sali biliari Lattosio Rosso neutro Acqua distillata pH = 7,1 ± 0,2 Colonie di batteri non fermentanti il lattosio (incolori). g g g g ml 20 5 10 0,035 1000 È un terreno liquido selettivo e differenziale per coltivare enterobatteri di cui evidenzia i lattosio fermentanti (viraggio del brodo al rosso) dai lattosio non fermentanti (brodocoltura incolore). pH neutro incolore Colonie incolori Agar Mac Conkey Peptone Sali biliari Lattosio NaCl Rosso neutro Cristalvioletto Agar-agar Acqua distillata pH = 7,1 ± 0,2 g g g g g g g ml 20 5 10 5 0,035 0,001 15 1000 È un terreno solido selettivo e differenziale per l’isolamento degli enterobatteri tra cui evidenzia i lattosio fermentanti (colonie di colore rosso) dai lattosio non fermentanti (colonie incolori). Capitolo 4. La coltivazione dei microrganismi FIGURA 4.8 ◗ 5 Terreni di coltura in provetta: Mannitol Salt Broth (MSB). Spesso i terreni oltre che differenziali sono anche selettivi; questo tipo di combinazione consente di pervenire rapidamente a un’identificazione presuntiva in quanto permette: • l’isolamento di un gruppo di specie microbiche; • la dimostrazione di proprietà utili al riconoscimento di alcune specie tra quelle isolate. La fermentazione o meno del lattosio, ad esempio, è un utile elemento di diagnosi presuntiva, in quanto già al momento dell’isolamento fornisce dati circa la presenza o meno di importanti enterobatteri patogeni (Salmonella e Shigella). Combinando opportunamente tra loro diverse prove metaboliche, possono essere strutturati veri e propri sistemi di identificazione; se il numero delle prove effettuate è sufficientemente elevato, è possibile giungere a una corretta identificazione dei microrganismi isolati. FIGURA 4.9 ◗ Semina su un terreno solido a becco di clarino. FIGURA 4.10 ◗ Coltura di lieviti su terreno di Sabouraud reso selettivo con antibiotici (Cloramfenicolo 50 mg/l). 4.2.2.7. Terreni liquidi e solidi In rapporto allo stato fisico, i terreni possono essere classificati in: liquidi, solidi e semisolidi. I terreni liquidi, definiti comunemente brodi, sono costituiti da una soluzione di varie componenti in acqua distillata; sono contenuti normalmente in provetta (fig. 4.8). I terreni solidi contengono, oltre alle componenti nutrizionali, selettive e differenziali specifiche, agenti solidificanti come l’agar-agar all’1,2-1,5%. Possono essere contenuti in provetta (fig. 4.9) o in piastra (figg. 4.10 e 4.11). I terreni semisolidi sono dotati di una scarsa fluidità per l’aggiunta di una concentrazione di agar-agar inferiore all’1%. 4.2.2.8. Componenti dei terreni di coltura Mentre i primi terreni di coltura erano costituiti da prodotti in gran parte naturali, quelli attualmente disponibili sono FIGURA 4.11 ◗ Coltura superficiale su terreno differenziale (Mac Con- key agar). 6 Le basi microbiologiche della Biochimica TABELLA 4.1. Agenti selettivi, microrganismi inibiti e selezionati e terreni di coltura Principali agenti selettivi Gruppi microbici inibiti Gruppi microbici selezionati Esempi di terreni in cui sono presenti NaCl 75-100 g/litro Batteri non aloresistenti Stafilococchi Mannitol salt agar Mannitol salt broth Azide sodica Gram negativi Streptococchi Agar azide sodica Cristalvioletto Gram positivi Enterobatteri Mac Conkey agar Verde brillante Gram positivi, Shigella Coliformi Brilliant green bile 2% broth Sali biliari Gram positivi Enterobatteri Mac Conkey Antibiotici (CAF, gentamicina, tetraciclina, ecc.) Batteri Micromiceti (lieviti e muffe) Sabouraud agar Glucosio 20-40 g/l Batteri non osmoresistenti Micromiceti (lieviti e muffe) Sabouraud agar Sabouraud broth messi a punto impiegando diverse componenti; in particolare tra queste possono essere individuati: • peptoni. Sono costituiti da miscele di aminoacidi liberi e peptidi facilmente utilizzabili dalle cellule microbiche. Sono ottenuti dall’idrolisi di proteine ad alto valore biologico d’origine animale (carne e caseina) o vegetale (soia). I peptoni sono prodotti impiegando proteasi come pepsina, tripsina o chimotripsina. Sono un’importante fonte d’azoto e di carbonio organico, oltre che di energia. In alternativa, o in aggiunta ai peptoni, spesso sono impiegati infusi ed estratti ottenuti per macerazione ed ebollizione di sostanze naturali quali l’estratto di carne e l’estratto di lievito; • glucidi. Costituiscono la fondamentale fonte di carbonio organico per alcuni gruppi microbici. In rapporto al differente impiego da parte delle diverse specie microbiche, possono essere utilizzati per differenziare i diversi gruppi microbici e nelle prove di identificazione. I carboidrati più comunemente usati nei terreni di coltura sono il glucosio, il maltosio, il lattosio e il saccarosio; • ioni inorganici. Hanno la funzione di garantire alle cellule un’adeguata osmolarità con cui regolare lo sviluppo dei processi biologici. In alcuni casi sono aggiunti in concentrazioni elevate ad alcuni terreni di coltura, in modo da renderli selettivi (75 g/litro di NaCl). Alcuni sali vengono aggiunti per tamponare il pH del terreno (KH2PO4, K2HPO4); • indicatori. Sono sostanze in grado di rivelare le attività svolte dai microrganismi. Gli indicatori più comunemente utilizzati sono quelli di pH, che rivelano la produzione di acidi e di basi nella degradazione dei carboidrati o delle sostanze azotate; • agenti solidificanti. L’agar-agar è il solidificante più importante per i terreni di coltura. È costituito da polimeri polisaccaridici del galattosio e dell’acido galatturonico; è estratto da alghe rosse dell’ordine Gelidiales. È trasparente e, in pratica, non è utilizzato dalla gran parte dei microrganismi. Fluidifica intorno ai 90-95 °C, mentre solidifica a valori prossimi ai 42-45 °C. Una volta addensatosi si mantiene compatto nell’intervallo di crescita di quasi tutti i microrganismi. Queste caratteristiche lo rendono insostituibile nella preparazione dei terreni di coltura di isolamento; • agenti selettivi. Sono sostanze tossiche per alcune specie, ma tollerate da altre. Per questo motivo gli agenti selet- • tivi sono impiegati per inibire la crescita di alcuni gruppi microbici e permettere, al contempo, la crescita di altre specie. Entrano pertanto nella composizione dei terreni di coltura selettivi. Tra gli agenti selettivi possono essere ricordati alcuni coloranti come il cristalvioletto e il verde brillante. sostanze di arricchimento. Sono costituite da prodotti naturali come il sangue, il siero, l’albumina o da miscele di vitamine e aminoacidi. Vengono aggiunte come fattori di crescita per le specie particolarmente esigenti. 4.3. PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA La preparazione dei terreni di coltura è una parte fondamentale delle attività microbiologiche. Se vengono impie- FIGURA 4.12 ◗ reni di coltura. Alcuni strumenti impiegati nella preparazione dei ter- Capitolo 4. La coltivazione dei microrganismi 7 gati terreni disidratati (fig. 4.12), le operazioni connesse alla loro preparazione sono semplici e rapide; tuttavia è necessario che siano effettuate correttamente per evitare che nei terreni si manifestino alterazioni delle componenti e contaminazioni microbiche. Le fasi necessarie alla preparazione dei terreni colturali sono: il calcolo del volume del terreno, la pesata degli ingredienti con la determinazione del volume dell’acqua distillata, la dissoluzione in acqua distillata, la sterilizzazione, la distribuzione nei contenitori, la prova di sterilità e la conservazione. 4.3.1. Calcolo del volume di terreno Si calcola partendo dal volume occorrente per ogni singolo contenitore del terreno di coltura. Approssimativamente il volume da aggiungere a ogni contenitore è il seguente: • 25-30 ml nei terreni agarizzati in piastra Petri da 90 mm; • 7-8 ml nei terreni di coltura liquidi in provetta; • 7-8 ml nei terreni a becco di clarino in provetta; • 7-8 ml nei terreni semisolidi in provetta. Per alcune ricerche è necessario predisporre terreni di coltura in contenitori con dimensioni particolari; ad esempio nella determinazione dell’efficacia degli antibiotici (antibiogramma) si impiegano terreni di coltura in piastre con diametro di 140 mm. Il volume complessivo è calcolato moltiplicando il volume unitario per il numero dei contenitori che si desidera impiegare. Se, ad esempio è necessaria la preparazione di 100 provette di un terreno di coltura liquido occorrono: • V. complessivo = V. unitario × N. contenitori • V. complessivo = 8 ml × 100 • V. complessivo = 800 ml Una volta calcolato il volume complessivo del terreno liquido, si passa alla determinazione del quantitativo di terreno disidratato occorrente. I dati sono forniti della ditta produttrice e riferiti in genere al litro di terreno. Se il volume complessivo richiesto è diverso dal litro, la quantità di terreno disidratato è calcolata mediante una semplice proporzione. Se, ad esempio, nella preparazione di un terreno di coltura occorrono 20 g/1000 ml e il volume complessivo richiesto è di 800 ml, il quantitativo di terreno disidratato occorrente si calcola in modo piuttosto semplice: 1000 : 20 = 800 : x da cui x = 20 · 800/1000 x = 16 g Il quantitativo di terreno disidratato necessario per la preparazione di 800 ml di terreno liquido è quindi di 16 g. 4.3.2. Pesata degli ingredienti Deve essere impiegata esclusivamente acqua distillata; il volume complessivo è determinato in cilindro graduato; per quanto riguarda il terreno disidratato, sia in polvere, sia granulare, la determinazione del peso occorrente si effettua ricorrendo alla bilancia tecnica (figg. 4.13 e 4.14). 4.3.3. Dissoluzione degli ingredienti La dissoluzione dei terreni liquidi avviene a temperatura ambientale utilizzando becker o beute d’idonea capienza. FIGURA 4.13 ◗ Bilancia tecnica. FIGURA 4.14 ◗ Pesata degli ingredienti con la bilancia tecnica. Dopo aver versato l’acqua distillata nel contenitore si versa la polvere delicatamente (fig. 4.15); si prosegue con un leggero riscaldamento su piastra agitante e riscaldante e si ottiene rapidamente una completa dissoluzione degli ingredienti. Mentre la dissoluzione dei terreni di coltura liquidi (fig. 4.16) si ha in pratica a freddo, nel caso di terreni contenenti agar-agar occorre procedere a un riscaldamento, fino al raggiungimento di temperature elevate, in quanto l’agar-agar fonde intorno ai 90-95 °C. Per i terreni agarizzati occorre raggiungere l’ebollizione e mantenerla per pochi minuti (fig. 4.17). Il raggiungimento di una perfetta limpidezza del terreno di coltura conferma la completa dissoluzione dell’agar-agar (figg. 4.18 e 4.19). Il riscaldamento non deve essere prolungato, per evitare l’alterazione delle componenti termolabili. Dopo la completa dissoluzione 8 Le basi microbiologiche della Biochimica FIGURA 4.15 ◗ Dissoluzione degli ingredienti nella preparazione di un terreno di coltura liquido. e riscaldante FIGURA 4.16 ◗ La dissoluzione degli ingredienti dei terreni di coltura liquidi si ha a freddo. riscaldamento. degli ingredienti, il terreno deve essere introdotto in contenitori in grado di resistere a un ciclo di sterilizzazione in autoclave. Normalmente vengono usati recipienti in vetro Pirex o Duran. FIGURA 4.17 ◗ FIGURA 4.18 ◗ I terreni agarizzati sono preparati in piastra agitante La torbidità dei terreni agarizzati diminuisce con il 4.3.4. Controllo del pH Viene eseguito mediante pHmetro ad una temperatura prossima a quella di utilizzo (35-45 °C); l’aggiustamento dei valori è ottenuto con HCl o NaOH, aggiungendo al ter- Capitolo 4. La coltivazione dei microrganismi 9 ze termolabili devono essere sterilizzati per filtrazione. Le componenti non sterilizzabili né in autoclave, né per filtrazione (come il sangue), se sterili, possono essere aggiunte al terreno sterilizzato adeguatamente raffreddato. I terreni agarizzati, prima dell’aggiunta di tali componenti, devono essere mantenuti fluidi in bagnomaria termostatico a temperature intorno ai 44-46 °C. 4.3.6. Distribuzione nei contenitori FIGURA 4.19 ◗ La completa dissoluzione degli ingredienti è rivelata dalla perfettamente limpidezza del terreno. reno la soluzione goccia a goccia, mescolando e controllando il pH. 4.3.5. Sterilizzazione Nella preparazione dei terreni di coltura la sterilizzazione è una fase strategica; è finalizzata all’eliminazione di tutte le forme microbiche vegetative e sporali, che possono alterare le normali componenti del terreno e interferire con i risultati. Tutti i terreni non contenenti sostanze termolabili, sono sterilizzati in autoclave (fig. 4.20) alle temperature indicate dalla ditta produttrice. Utilizzando contenitori di media capienza (inferiore al litro), occorre una temperatura di 121 °C per 15-20 minuti. Se è possibile, i terreni contenenti sostan- Completata la preparazione, i terreni di coltura devono essere distribuiti in contenitori sterili. Quelli agarizzati, in genere sono posti in piastre, mentre quelli liquidi in provette. La distribuzione dei terreni di coltura deve essere sempre eseguita sotto cappa a flusso laminare, in modo da garantire un’adeguata asepsi. In tale operazione deve essere considerata la composizione del terreno e la natura dei contenitori. In particolare: i terreni agarizzati devono essere aggiunti ai contenitori a una temperatura superiore ai 44-46 °C, prima che si determini l’addensamento dell’agar. Inoltre se i contenitori sono in polistirene (di scarsa termoresistenza), la distribuzione deve avvenire a temperature inferiori a 60-65 °C. Se s’impiegano piastre, dopo la distribuzione del terreno è necessario tenere i coperchi parzialmente aperti sotto la cappa a flusso laminare, per evitare la condensazione del vapore d’acqua al di sotto dei coperchi stessi. Terminata la distribuzione e a equilibrio termico raggiunto, i contenitori devono essere sempre chiusi e predisposti per la conservazione o l’utilizzo. 4.3.7. Prova di sterilità Sui terreni così preparati, devono essere eseguiti test di sterilità che hanno lo scopo di mettere in luce un’eventuale contaminazione microbica. La prova consiste nel porre in termostato a 37 °C un’aliquota dei contenitori con il terreno preparato per un tempo di 24-48 h. Nel caso sia conservata la limpidezza dei brodi o l’assenza di colonie microbiche nei terreni agarizzati, la sterilità è garantita. 4.3.8. Conservazione I terreni disidratati mantengono le proprie caratteristiche per tempi piuttosto lunghi, mentre quelli pronti all’uso si alterano rapidamente (fig. 4.21). I terreni chiusi ermeticamente in provetta, si conservano per due o tre mesi, invece quelli agarizzati, per la rapida evaporazione dell’acqua contenuta, devono essere conservati sigillati e utilizzati entro una o due settimane. Il rapido essiccamento, le alterazioni delle componenti e la possibile contaminazione da parte di microrganismi ambientali, sconsigliano l’impiego dei terreni di coltura oltre questi termini. 4.4. FIGURA 4.20 ◗ Il terreno di coltura è posto in autoclave per un ciclo di sterilizzazione a 121 °C per 15-20 minuti. PRINCIPALI TECNICHE COLTURALI Al momento dell’allestimento delle colture, devono essere presi in considerazione principalmente due aspetti: • tutti i campioni e tutte le colture microbiche costituiscono un rischio biologico, per cui, devono essere manipolati rispettando tutte le norme di sicurezza, onde evitare la contaminazione del personale e dell’ambiente; • affinché il lavoro sia significativo occorre conservare le caratteristiche della flora microbica in esame, perciò va posta particolare attenzione al trattamento dei campioni e delle colture, di cui va evitata ogni contaminazione. 10 Le basi microbiologiche della Biochimica delle sostanze impiegate nei confronti dei microrganismi ricercati. Dopo il prelievo, il campione deve essere posto in contenitori sterili da chiudere in seguito ermeticamente. 4.4.2. Trasporto del campione L’esame microbiologico è significativo solo se la composizione della flora microbica originaria è inalterata. Per questo motivo il campione deve essere conservato a basse temperature (4-6°C) e, nel caso di microrganismi labili, in terreni di mantenimento; inoltre il trasporto in laboratorio e l’allestimento delle colture devono avvenire in tempi piuttosto rapidi. 4.4.3. Trattamento del campione Giunto in laboratorio, il campione deve essere trattato per facilitare la ricerca delle specie microbiche. Nella coltivazione dei bacilli tubercolari, ad esempio, è utile un pretrattamento con acidi o basi in modo da eliminare la flora microbica concomitante, senza danneggiare i batteri ricercati. Nella ricerca di bacilli sporigeni, invece, la coltivazione deve essere preceduta da una pastorizzazione alta di laboratorio; questo trattamento elimina tutte le forme vegetative e le forme di resistenza non batteriche, ma mantiene inalterate le spore batteriche. FIGURA 4.21 ◗ Anche in cella refrigerante i terreni di coltura pronti all’uso possono essere conservati per tempi molto limitati. I procedimenti colturali assumono itinerari quanto mai diversi in rapporto al fatto che: • ogni tipo di prodotto esaminato richiede un trattamento che dipende dalla sua natura; • possono avere diverse finalità, ad esempio la ricerca della carica microbica o di una particolare specie patogena; • ogni specie microbica ricercata possiede un’esigenza colturale specifica. Nei campioni costituiti da materiale polimicrobico, le tecniche colturali nella prima fase del lavoro, in genere, sono finalizzate all’isolamento delle specie microbiche dotate di un rilevante interesse e, in seguito, all’allestimento delle colture pure (cloni in grandi quantità dei microrganismi isolati) sulle quali possono essere eseguite tutte le indagini necessarie. 4.4.1. 4.4.4. Allestimento delle colture Le colture microbiche sono ottenute con idonei procedimenti di lavoro e l’impiego di terreni di coltura adatti alla crescita delle specie ricercate. In genere le tecniche colturali prevedono il trasferimento di un’aliquota del campione in Prelievo del campione Gli strumenti e le tecniche di prelievo dipendono dalla natura dei campioni esaminati che, com’è stato evidenziato in precedenza, possono essere alquanto diversi. Tutti i campioni prelevati devono essere rappresentativi del materiale da cui sono stati ottenuti ed esenti dalla contaminazione da parte dei microrganismi provenienti dall’ambiente circostante. Così, ad esempio, prima del prelievo di acqua di fonte, destinata a uso potabile, è necessario passare la fiamma sul rubinetto, al fine di eliminare tutti i microrganismi presenti sulla superficie esterna, e far scorrere l’acqua per almeno un minuto. Nel caso si prelevino campioni biologici (ematici, urinari o di altri distretti dell’organismo) occorre evitare accuratamente la contaminazione da parte della flora microbica commensale; pertanto la zona interessata deve essere sottoposta a un’attenta disinfezione impedendo, al contempo, l’azione tossica FIGURA 4.22 ◗ L’ansa di platino: uno strumento essenziale nell’allestimento delle colture. Capitolo 4. La coltivazione dei microrganismi FIGURA 4.25 ◗ 11 Semina su terreno di coltura agarizzato: Sabouraud agar. FIGURA 4.23 ◗ L’arroventamento dell’ansa sul becco Bunsen è una classica e importante operazione che si esegue prima dell’allestimento e dei trapianti delle colture. esame in terreni di coltura liquidi o solidi, con l’impiego di ansa (figg. 4.22 e 4.23), spatola o pipetta. Se i microrganismi trovano le condizioni chimiche, fisiche e nutrizionali adatte, FIGURA 4.26 ◗ Semina per coltura su vetrino. FIGURA 4.24 ◗ Semina in terreno selettivo liquido: Sabouraud broth. in genere proliferano in tempi piuttosto rapidi. Le operazioni che permettono l’allestimento delle colture sono eseguite con modalità diverse in base agli strumenti, ai terreni impiegati e alle finalità che ci si propone di raggiungere. Indipendentemente dalle modalità con cui le specifiche operazioni sono eseguite (figg. 4.24, 4.25 e 4.26) e dall’itinerario di lavoro percorso, nell’allestimento delle colture microbiche devono essere tenute in considerazione alcune norme di carattere generale. In particolare: • deve essere impiegata la fiamma del becco Bunsen ben alta ed areata; • devono essere evitati i movimenti che facilitino l’entrata dell’aria all’interno delle piastre e delle provette; • gli strumenti impiegati come l’ago, l’ansa e la spatola devono essere passati alla fiamma prima e dopo la propria utilizzazione; 12 Le basi microbiologiche della Biochimica • gli strumenti, dopo il passaggio alla fiamma e prima del loro impiego, devono essere adeguatamente raffreddati, onde evitare danni al materiale microbico manipolato; • si deve pescare il materiale da una sola colonia e, se necessario, ricorrere all’uso dell’ago; • occorre evitare contaminazioni delle colture da parte dei microrganismi ambientali e da parte dell’operatore; • i contenitori in cui sono presenti i microrganismi devono essere mantenuti costantemente chiusi ed aperti giusto il tempo del prelievo del campione, mentre nel caso dei terreni di coltura, per il tempo occorrente alla semina; • tutti i campioni devono essere considerati pericolosi, per cui occorre porre particolare attenzione ad evitare accidentali e pericolose contaminazioni delle persone e dell’ambiente; • occorre impiegare i dispositivi di protezione individuale e collettiva, per ridurre al minimo il rischio biologico; • tutti i materiali e gli strumenti impiegati (fig. 4.27) devono essere sottoposti a decontaminazione al termine dei lavori. Se non più riutilizzabili, devono essere sterilizzati in autoclave e smaltiti secondo la normativa vigente. Com’è stato evidenziato in precedenza, le colture microbiche richiedono strumenti e procedimenti diversi in rapporto alle finalità che si prefiggono. Comunemente nelle semine d’isolamento viene impiegata l’ansa di platino o, in alternativa, quella al nikel-cromo o monouso. Nelle semine in cui è richiesta una crescita omogenea, si usano tamponi sterili, che permettono il trasferimento di elevate quantità di microrganismi. Nella semina delle provette con agar inclinato per infissione, si utilizza l’ago. Colture d’isolamento. In genere lo studio delle caratteristiche fenotipiche di un microrganismo richiede un’elevata quantità di materiale microbico, che si può ottenere solo con l’allestimento di colture d’isolamento e, da queste, di colture pure. È fondamentale, pertanto, la conoscenza delle tecniche d’isolamento delle specie microbiche contenute in un determinato campione. Tra le tecniche che permettono l’allestimento di colture d’isolamento, quelle più efficaci e più comunemente usate, prevedono l’uso di terreni agarizzati in piastra Petri. L’isolamento delle singole specie microbiche si ottiene con la semina del materiale su un terreno idoneo, con una tecnica in cui i singoli microrganismi sono adeguatamente distanziati gli uni dagli altri. Dopo la semina i terreni vengono posti in condizioni ambientali adatte alla proliferazione delle specie ricercate. In genere dopo 24-48 ore sono prodotti milioni o miliardi di discendenti, che nel terreno restano ammassati intorno al microrganismo originario (colonia). Le colonie, essendo derivate da un processo di proliferazione agamica, sono costituite da popolazioni di microrganismi identici e quindi formano un clone. Le colture, ottenute dalle singole colonie trapiantate in seguito in altri terreni liquidi o solidi, si definiscono colture pure. Su queste ultime possono essere sviluppate tutte le ricerche necessarie. L’isolamento dei microrganismi sui terreni solidi è stato introdotto da Robert Koch. Può essere eseguito attraverso la disseminazione del campione nella massa del terreno o per semina in superficie. Quest’ultima metodologia è piuttosto agevole e può essere eseguita con diverse tecniche. Una delle più semplici e delle più rispondenti allo scopo è illustrata nella pagina successiva (fig. 4.28b e fig. 4.29). L’isolamento in piastra può essere eseguito anche con altre modalità di distribuzione in superficie del materiale microbico; se l’esecuzione è stata tecnicamente corretta, i risultati finali ottenuti in genere sono soddisfacenti. Altre tecniche d’isolamento si basano sull’impiego dell’agar fuso o delle diluizioni progressive del materiale microbico in sospensione. Anche con l’adozione di queste tecniche l’isolamento è soddisfacente, indipendentemente dalla concentrazione microbica del campione. Trapianto. Permette il trasferimento di una popolazione microbica da un terreno di coltura a un altro. Questa operazione è eseguita per diverse finalità come, ad esempio per rivitalizzare una popolazione microbica “stressata” dai trattamenti impiegati, per rifornire i nutrienti in quantità idonee, per amplificare una popolazione microbica, per ottenere una coltura pura. Il trapianto può essere eseguito su terreno solido o liquido. In seguito, dalle colture ottenute, possono essere eseguiti ulteriori trapianti su altri terreni. Secondo le necessità, possono essere utilizzati l’ago, l’ansa o la spatola. L’ago è utilizzato per il trasporto di piccole quantità di materiale; in particolare è impiegato se le colonie sono piccole o eccessivamente ravvicinate e nei trapianti per infissione. L’ansa di platino o al nikel-cromo serve per trasportare discrete quantità di materiale microbico o per passaggi di materiale liquido. La spatola, infine, è impiegata per il trasporto se le quantità sono elevate o per favorire il distacco delle colonie fortemente aderenti al terreno. 4.4.5. FIGURA 4.27 ◗ Le operazioni devono concludersi sempre con la sterilizzazione degli strumenti riutilizzabili. Incubazione delle colture La proliferazione dei microrganismi nei terreni di coltura è ottenuta mediante incubazione in bagnomaria o in celle Capitolo 4. La coltivazione dei microrganismi 13 a FIGURA 4.29 ◗ Isolamento in piastra ottenuto con lo schema b della fig. 4.28. b c FIGURA 4.28 ◗ Alcune modalità di semina sulla superficie di terreni agarizzati. termostatiche, al cui interno sono fornite le condizioni di temperatura più vicine alle esigenze delle specie ricercate. È bene ricordare che la coltivazione degli aerobi facoltativi e degli aerotolleranti non richiede particolari attenzioni, in quanto possono adattarsi alle diverse condizioni ambientali. Diverso è il caso degli aerobi stretti e degli anaerobi obbligati. Gli aerobi stretti richiedono un alto potenziale redox; pertanto crescono bene sulla superficie dei terreni solidi, ma con difficoltà in quelli liquidi per la scarsa solubilità dell’ossigeno e per il rapido consumo operato dall’attività metabolica prodotta. In questo caso sono necessari una continua areazione delle colture e il frequente trapianto in terreni freschi. Opposte sono le esigenze degli anaerobi obbligati. Essendo inibiti dall’alto potenziale redox, richiedono la completa eliminazione dall’ambiente di crescita dell’ossigeno molecolare. Questo può essere ottenuto in diversi modi: • creando un’atmosfera strettamente anaerobica (atmosfera riducente). Una possibilità è costituita dall’impiego simultaneo di bicarbonato di sodio, sodio boroidruro e acido tartarico che, posti a contatto con un certo volume d’acqua, formano anidride carbonica e idrogeno molecolare. In presenza di platino o palladio, l’idrogeno prodotto reagisce con l’ossigeno molecolare formando acqua. Se la reazione avviene in contenitori ermeticamente chiusi (fig. 4.30), l’ossigeno presente è rapidamente consumato e sostituito dall’anidride carbonica. Le raggiunte condizioni di stretta anaerobiosi sono rivelate da appositi indicatori. Questa tecnica è largamente impiegata nella coltura dei batteri appartenenti al genere Clostridium e di altri anaerobi stretti; • introducendo nei terreni di coltura sostanze in grado di abbassarne il potenziale redox. In alcuni casi a questo scopo è impiegata la cisteina; • impiegando terreni semisolidi in cui l’ossigeno è eliminato mediante riscaldamento. Per impedire il passaggio dell’ossigeno dall’aria, dopo la semina devono essere ricoperti con olio di vaselina. L’incubazione delle colture deve essere protratta impiegando le temperature e i tempi idonei alle specie ricercate; se è prolungata in modo eccessivo, possono essere prodotte importanti alterazioni morfologiche e metaboliche. 14 Le basi microbiologiche della Biochimica FIGURA 4.30 ◗ L’incubazione in giara permette di creare un ambiente idoneo alla crescita di microrganismi anaerobi. 4.4.6. Esame colturale Al termine dell’incubazione, segue l’esame dei caratteri colturali. Osservando le colture è possibile esprimere un giudizio, che seppure presuntivo sul tipo di microrganismo presente, è essenziale per la diagnosi microbiologica, in quanto è attraverso l’esame colturale che le indagini possono essere indirizzate in un determinato itinerario, piuttosto che in un altro. Lo studio dei caratteri colturali può essere effettuato in vario modo. Spesso, per avere un maggior numero di dati, è opportuno condurre le ricerche associando diverse tecniche. Nei terreni liquidi i parametri esaminati sono la torbidità uniforme o meno, la formazione di filamenti o di fiocchi sospesi, il cambiamento del colore (fig. 4.31), l’odore, la FIGURA 4.31 ◗ L’esame colturale consente di ricavare informazioni sulle caratteristiche della flora microbica presente. FIGURA 4.32 ◗ L’esame colturale si esegue, oltre che a occhio nudo, utilizzando lenti di ingrandimento e stereoscopio. formazione di schiuma, di precipitati e di patine superficiali. Nei terreni solidi sono esaminate le colonie derivate dalla semina di isolamento o le patine delle colture pure. Delle colonie possono essere presi in considerazione diversi parametri, che si rivelano piuttosto interessanti e utili nell’individuazione delle specie isolate. L’esame delle colonie è effettuato con l’osservazione diretta, con le lenti d’ingrandimento e con lo stereoscopio (fig. 4.32). I caratteri presi in considerazione sono essenzialmente (figg. 4.33 e 4.34): • forma. Rotonda, lenticolare, rizoide, filamentosa, irregolare, puntiforme; • diametro. In millimetri; • margine. Regolare, ondulato, lobato, crenato, dentellato; • rilievo. Piatto, basso-convesso, alto-convesso, sopraelevato, cupoliforme, ombelicato; • colore. Incolore, bianco, giallastro, nero, rosa ecc; • consistenza. Cremosa, compatta, polverosa; • trasparenza. Trasparente, traslucida, opaca; • superficie. Liscia, ruvida; • azione sul terreno. Emolisi, precipitazione di sali biliari. Le colture microbiche sugli agar a becco di clarino evidenziano la presenza di veli e di patine più o meno pigmentate, con consistenza secca o cremosa; morfologicamente possono essere distinte in: filiformi, diffuse, arborescenti o rizoidi (figg. 4.35 e 4.36). La crescita per infissione in agar o gelatina avviene lungo il canale di infissione o può espandersi da questo. La crescita può essere filiforme, crateriforme, a sacco, imbutiforme o stratificata (fig. 4.37). Nel caso di semina in gelatina può essere apprezzata anche l’attività proteolitica, legata alla presenza di specifici enzimi. Questo tipo di attività si evidenzia con la liquefazione della gelatina in modo diffuso o su zone limitate. Capitolo 4. La coltivazione dei microrganismi Rilievo Margine Regolare Lobato Crenato 15 Alto-convesso Basso-convesso Piatto Sopraelevato Umbonato Cupoliforme Ondulato Rizoide Dentellato Concavo FIGURA 4.33 ◗ Principali morfologie delle colonie batteriche e dei micromiceti. 4.4.7. Conservazione delle colture Spesso è necessario conservare per tempi lunghi i microrganismi isolati e identificati. Il metodo di conservazione ideale deve bloccare i processi metabolici e riproduttivi dei microrganismi, mantenendone inalterate le potenzialità biologiche; oltre a ciò, deve evitare ogni contaminazione delle colture e ridurre al minimo la possibilità che compaiano mutazioni. I trattamenti privilegiati prevedono l’impiego a b c d FIGURA 4.34 ◗ Colonie di lieviti e batteri con diversa morfologia. 16 Le basi microbiologiche della Biochimica Arborescente Rizoide Diffusa Filiforme FIGURA 4.36 ◗ Coltura su agar inclinato. FIGURA 4.35 ◗ Coltura di enterobatteri su terreno a becco di clarino. delle basse temperature e della liofilizzazione. Un metodo di conservazione usuale, ma di scarsa efficacia, è rappresentato dalla refrigerazione. Prevede il mantenimento delle colture intorno a +4 °C, ma la sua durata è limitata a poche settimane; al termine, richiede il trapianto su nuovi terreni di coltura. Un problema insito in questo tipo di conservazione è la possibile comparsa di mutanti. Il congelamento presenta un’efficacia sicuramente superiore; prevede l’impiego di una brodocoltura, che è rapidamente raffreddata a temperature tra i –20 e i –60 °C. Per ridurre gli effetti prodotti dal ghiaccio sono aggiunti agenti protettivi. Una metodica che garantisce una conservazione dei ceppi microbici per tempi molto lunghi è la liofilizzazione. Questo trattamento è preceduto da una fase di surgelamento, che abbassa la temperatura senza alterare in modo significativo le cellule microbiche. In seguito le colture sono poste sottovuoto con conseguente sublimazione dell’acqua, che passa direttamente dallo stato solido (ghiaccio) a quello aeriforme (vapore). In conclusione le tecniche di congelamento e di liofilizzazione, bloccando la riproduzione cellulare, impediscono la comparsa di mutanti; inoltre, garantiscono tempi più lunghi di conservazione e si dimostrano più sicure per il mantenimento delle caratteristiche presenti al momento dell’isolamento. A sacco Imbutiforme Filiforme Crateriforme FIGURA 4.37 ◗ Coltura per infissione. Capitolo 4. La coltivazione dei microrganismi 17 QUESITI DEL CAPITOLO 4 1) Quali finalità ci si propone con l’allestimento delle colture microbiche? 2) Quali sono le fondamentali caratteristiche che devono possedere i terreni di coltura? 3) Che cosa s’intende con il termine peptone? In che modo sono ottenuti i peptoni? 4) Per quale motivo nella composizione dei terreni di coltura trovano posto i peptoni piuttosto che le proteine? 5) Si illustrino le modalità di classificazione dei terreni di coltura in base alla composizione chimica. 6) Che cosa s’intende per terreni di coltura solidi, semisolidi e liquidi? 7) Si illustrino le modalità classificative dei terreni di coltura in base alle caratteristiche colturali. 8) Che tipo di terreno deve essere utilizzato per coltivare microrganismi che abbiano subito in precedenza trattamenti chimico-fisici energici? 9) Che tipo di terreno deve essere impiegato per coltivare enterobatteri partendo da un materiale polimicrobico? 10) Per quale motivo nel Sabouraud agar sono aggiunti antibiotici come il CAF? 11) Si illustri il meccanismo che permette di differenziare le colonie lattosio fermentanti da quelle non lattosio fermentanti in un terreno come il Mac Conkey agar. 12) Si evidenzi il procedimento di lavoro seguito per la preparazione dei terreni di coltura liquidi. 13) Si illustri il procedimento di lavoro seguito per la preparazione dei terreni di colturali solidi. 14) In che modo e per quanto tempo possono essere conservati in laboratorio i terreni di coltura pronti all’uso posti in provetta ed in piastra? 15) Quali accorgimenti devono essere presi in considerazione durante il prelievo di un campione da sottoporre ad esame microbiologico? 16) Quali accorgimenti devono essere adottati durante il trasporto dei campioni in laboratorio? 17) Quali elementi di carattere generale devono essere curati durante l’allestimento delle colture? 18) Che cosa s’intende per coltura d’isolamento? 19) In che modo sono ottenute le colture d’isolamento? 20) Si definisca il concetto di colonia. 21) Che cosa s’intende per clone? 22) Quali finalità si propongono i trapianti delle colture? 23) Quale strumento è impiegato nel trasporto di elevate quantità di materiale microbico? 24) In quale situazione è impiegato l’ago? 25) Quali parametri sono presi in considerazione nell’esame colturale dei terreni liquidi? 26) Quali parametri vengono esaminati nell’esame colturale dei terreni solidi? 27) Si evidenzino gli accorgimenti che devono essere adottati per la coltivazione dei microrganismi strettamente anaerobici. 28) In che modo i microrganismi isolati possono essere conservati per lungo tempo, evitando la comparsa di mutanti?
