Diagnostica microbiologica

Premessa
• Il Laboratorio fornisce supporto indispensabile alla pratica
clinica.
• Il ricorso ad esso deve essere comunque e sempre ragionato.
• Nella pratica clinica è in particolare indispensabile procedere
alla preliminare formulazione del sospetto diagnostico.
• La limitazione delle risorse economiche già condiziona e
condizionerà sempre più in futuro gli interventi medici.
• La valutazione del rapporto costo-beneficio dovrà essere tenuta
in sempre maggiore considerazione dal medico in ogni sua scelta
ivi inclusa quella concernente il ricorso all’ ausilio
laboratoristico.
• I criteri di valutazione dei rapporti costo-beneficio non possono
tuttavia essere miopi.
Microbiologia Medica
Il laboratorio di Microbiologia fornisce sostanziale
supporto alla diagnosi, al trattamento ed alla prevenzione
della
PATOLOGIA DA INFEZIONE
sia quella sostenuta da patogeni primari - in soggetti
normoreattivi [Patologia Infettiva pr.detta]
sia quella sostenuta da patogeni opportunisti o condizionati
- in soggetti con difese compromesse (ospiti compromessi)
Lo studio della Microbiologia Clinica deve
essere pertanto finalizzato alla:
• acquisizione di conoscenze sulle complessive potenzialità
diagnostiche del laboratorio di microbiologia e sulla possibilità che
esso fornisca indicazioni per la realizzazione di una terapia mirata
delle malattie da infezione e per la messa a punto di adeguate
strategie di prevenzione.
• valutazione del ruolo e della incidenza dei singoli microrganismi
nella etio-patogenesi delle diverse malattie da infezione, della loro
circolazione in situazioni ambientali differenti, della loro capacità di
esibire resistenze ai farmaci antimicrobici, della circolazione, nelle
popolazioni microbiche, dei determinanti genetici di resistenza, con
acquisizione, in questo caso, di indicazioni per la realizzazione di una
terapia ragionata che eviti, quando non richiesto, il ricorso al
laboratorio diagnostico di microbiologia, o che comunque possa
essere adottata in attesa delle sue risposte.
Lo studio della Microbiologia Clinica deve
essere pertanto effettuato:
Con procedure convenzionali
• Osservazione della crescita nei terreni di isolamento (morfologia delle colonie e loro
caratteri in terreni differenziali, odore, capacità di crescita in presenza o meno di
ossigeno, richiesta di atmosfera arricchita in CO2, ecc.);
• Osservazione di reazioni chimiche generate in colture in tubi;
• Evidenziazione di specifiche attività enzimatiche;
• Risultati della colorazione di Gram;
• Saggi di agglutinazione;
• Profili si sensibilità.
Con metodi miniaturizzati di esecuzione di reazioni biochimiche convenzionali.
Con sistemi basati sul profilo di utilizzazione di substrati opportunamente
selezionati al fine di consentire l’acquisizione di un insieme di reazioni
positivo/negative.
Gli accertamenti microbiologici in corso di malattia da
infezione si fondano sulla:
• evidenziazione (con varie metodiche) della presenza di un
microrganismo potenzialmente responsabile ed
accertamento del suo ruolo patogeno;
• valutazione della risposta immune, specifica nei confronti
di microrganismi ritenuti potenzialmente responsabili,
Diagnosi batteriologica
• Ricerca microscopica nel campione clinico
• Ricerca di antigeni (o di acidi nucleici) nel
campione clinico
• Coltivazione (amplificazione biologica)
• Identificazione.
Diagnostica microbiologica
Isolamento
L’isolamento dell’agente ha un valore che va oltre la diagnosi
etiologica in quanto permette di valutare:
• caratteristiche infraspecifiche (interesse epidemiologico e
preventivo)
•Fattori di virulenza e di patogenicità
•Suscettibilità agli antibiotici
E necessario ipotizzare su base clinica una gamma di ipotesi
etiologiche
• per ogni ipotesi richiamare lo schema patogenetico
corrispondente per decidere quale materiale prelevare, in quale
momento ed in quali condizioni
• inviare il materiale in laboratorio informandolo delle ipotesi da
perseguire
PRELIEVO DEL CAMPIONE
ZONE NORMALMENTE STERILI
•
•
•
•
•
•
Sangue e midollo
Liquido cefalo rachidiano (LCR)
Liquido articolare o della cavità pleurica
Tessuti profondi
Vie respiratorie inferiori
Urine (se il campione è opportunamente raccolto)
ZONE CON POPOLAZIONE BATTERICA
RESIDENTE
•
•
•
•
•
Bocca, naso, vie respiratorie superiori
Cute
Tratto gastrointestinale
Tratto genitale femminile
Uretra
MODALITA’ DI RACCOLTA DEL
CAMPIONE
Raccogliere il campione in quantità sufficiente
Scegliere un campione rappresentativo del processo
morboso facendo in modo che esso contenga il patogeno
da identificare
Raccogliere il campione nella fase acuta di malattia e
comunque prima dell’inizio del trattamento antibiotico
Se il trattamento antibiotico è invece già stato iniziato
segnalare al laboratorio quale terapia è stata somministrata
Evitare contaminazioni da parte di microrganismi esterni
MODALITA’ DI TRASPORTO DEL
CAMPIONE
Usare contenitori idonei e opportuni terreni di trasporto
Etichettare adeguatamente i campioni
Completare la richiesta di esame con la diagnosi presunta
Inviare rapidamente il campione al laboratorio in
appropriate condizioni di temperatura (+4°C o al massimo a
temperatura ambiente, mai a 37°C).
DISTRIBUZIONE DEI MICRORGANISMI
NEL CORPO UMANO
ESAME MICROSCOPICO DIRETTO
Il campione colorato può fornire indicazioni
relativamente a:
Presenza o assenza di batteri
quantità assoluta di batteri presenti
percentuale relativa di Gram+ e Gram localizzazione dei batteri intra o extra-cellulare
ESAME MICROSCOPICO DIRETTO
L’esame microscopico può fornire precise indicazioni
diagnostiche:
quando si esamini un materiale normalmente sterile o
comunque proveniente da zone non in comunicazione con
l’esterno (liquido cefalo-rachidiano, essudato pleurico o
peritoneale, materiale purulento proveniente da raccolte
chiuse)
quando si esamini un materiale nella cui popolazione
batterica normale non siano compresi batteri con i caratteri
morfologici e/o tintoriali del batterio osservato
ESAME MICROSCOPICO A FRESCO
Tale sistema consente di osservare microscopicamente:
Forma e disposizione microbica
Vitalità del microrganismo
Mobilità del microrganismo
Osservazione dei batteri difficili da colorare come gli
spirilli
Tecniche:
• Osservazione a fresco con comune portaoggetto
• Esame a goccia pendente (cellula di Kock)
• Celletta di Ranvier
ESAME MICROSCOPICO A FRESCO
Evidenziazione di Treponema pallidum in materiale
patologico proveniente da una lesione mucosa.
Il materiale, non fissato, è osservato in campo oscuro
Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica
R. Cevenini, V.Sambri
Piccin
COLORAZIONI SEMPLICI
Sono quelle che prevedono l’impiego di un solo
colorante:
• cristalvioletto
• fucsina basica
• blu di metilene
Tutti i batteri assumono lo stesso colore e permetted i individuare
la morfologia microbica.
COLORAZIONI DIFFERENZIALI
Sono quelle che prevedono l’impiego di più di un
colorante:
Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Colorazione di Kinyoun
Colorazione di Giemsa
Colorazione con fluorocromi
Colorazione di GRAM
COLORAZIONE DI GRAM
COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN
Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica
R. Cevenini, V.Sambri
Piccin
ESAME COLTURALE
I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico in:
• liquidi (brodo)
• solidi (brodo normale solidificato con agar)
BRODO NORMALE o BRODO NUTRITIVO
• peptone (composto derivato dalla digestione parziale di
proteine animali) 0,5%
• estratto di carne 0,3%
• NaCl (per renderla isotonica)
• tampone fosfato (pH 7,0)
• H20
COMPOSIZIONE CHIMICA DEI TERRENI
Chimicamente definita
molto costosi ed utilizzati esclusivamente per l’identificazione di
batteri con particolari esigenze nutrizionali
Indefinita
contenenti sostanze naturali quali peptone, siero, liquido ascitico,
sangue, estratto di lievito etc.
AGAR
• polisaccaride acido estratto da alghe rosse del genere Gelidium, frequenti
nei mari tropicali
• formato per il 70% da agarosio e per il 30% da agaropectina
• non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri
• liquido a temperatura > 80°C
• addizionato ad un terreno di coltura nella proporzione dell’1,5 - 2%
• gelifica a temperatura compresa tra 42-47°C.
TERRENI
Terreni minimi
Contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto forma di sali
inorganici, aggiunti in concentrazione nota
Terreni di arricchimento
Sono addizionati di:
• sangue
• siero
• estratto di lievito
• infusi di cuore e cervello
• carboidrati
• amminoacidi
Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni
particolarmente esigenti
TERRENI
Terreni non selettivi: permettono la crescita di molte specie microbiche
Terreni selettivi:
• coloranti (cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica)
• antibiotici con attività batteriostatica nei confronti dei microrganismi
contaminanti.
Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni che si trovino
frammisti alla flora microbica residente (campioni provenienti da pelle, gola,
naso, intestino, vagina)
Terreni di trasporto
Sono semisolidi non posseggono alcun carattere nutrizionale, ma hanno lo
scopo di rendere compatibile il trasporto di un campione contenente un agente
microbico inibendo le attività enzimatiche e le reazioni di ossidazione
TERRENI
Terreni differenziali
Contengono carboidrati (zuccheri) ed indicatori di pH, che consentono di
distinguere tra microrganismi in grado di fermentare specifici carboidrati,
in base alla colorazione delle colonie e alla loro morfologia.
Indicatori di pH sono:
rosso fenolo
blu di bromofenolo
Agar-sangue
Terreno allestito con l’aggiunta di 5% di sangue (di montone o di cavallo)
utilizzato per evidenziare la capacità di emolisi dei batteri
α-emolisi = emolisi parziale che dà luogo alla formazione di un alone
verde intorno alla colonia per degradazione della bilirubina a biliverdina
ß-emolisi = emolisi completa che dà luogo alla formazione di un alone
trasparente intorno alla colonia
γ-emolisi = mancanza di emolisi
β-EMOLISI
Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica
R. Cevenini, V.Sambri
Piccin
Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica
R. Cevenini, V.Sambri
Piccin
TEMPO DI DUPLICAZIONE DEI BATTERI
• Escherichia coli
(in condizione di coltura ottimali)
20-30 min
• Escherichia coli
(nell’intestino umano)
12 ore
• Mycobacterium tuberculosis
18 ore
• Treponema pallidum
33 ore
FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA
TEMPERATURA
• Psicrofili
• Mesofili
• Termofili
15-20°C (Listeria monocytogenes anche <10°C)
20-45°C
45-60°C
OSSIGENO
Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico
Anaerobi facoltativi:
crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie
Anaerobi obbligati:
crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico
Microaerofili:
crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di ossigeno;
pH
Acidofili pH 2-4
Neutrofili pH 5-8
Alcalofili pH 8-11
crescono bene in atmosfera addizionata di CO2
Il valore ottimale di pH è compreso tra 6,5 e 7,5
PRESSIONE OSMOTICA
I microrganismi replicano generalmente meglio in un terreno con concentrazione
osmotica più bassa della propria, in quanto questa condizione permette la penetrazione
dell’acqua all’interno della cellula. La pressione osmotica del terreno può essere
modificata in base alla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio
I batteri aerobi tendono a formare una patina sulla superficie del terreno di
coltura liquido. Quando vengono fatti crescere in terreno liquido vengono
mantenuti in continua agitazione, perché possano avere sempre disponibile
ossigeno atmosferico
I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido,
depositandosi sul fondo come sedimento.
Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali
Terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici (tioglicolato
di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno atmosferico fino ad
esaurirlo
Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche (bicarbonato
di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono umidificate, producono CO2 e
H2 e successivamente H2O con scomparsa dell’ossigeno.
I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido,
depositandosi sul fondo come sedimento
Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali
Terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici (tioglicolato
di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno atmosferico fino ad
esaurirlo
Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche (bicarbonato di
sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono umidificate, producono CO2 e H2
e successivamente H2O con scomparsa dell’ossigeno.
ISOLAMENTO BATTERICO
E’ necessario tenere conto del sito di provenienza del campione:
• pus
• liquido cefalo rachidiano
• sangue
generalmente contengono un solo tipo di microrganismo
• materiale fecale
• tamponi oro-faringei
• altri materiali biologici
generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al
patogeno o ai patogeni responsabili dell’infezione
SEMINA PER ISOLAMENTO
ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE TECNICA DELLA
DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE
• Utilizzare terreni solidi in piastre di Petri del diametro di 12 cm.
• Deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminare al
margine della piastra (se il materiale è molto denso stemperarlo con
soluzione fisiologica o brodo sterile)
• Utilizzando una spatola distribuire il materiale sulla superficie del terreno
in modo da avere la formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di
semina e colonie isolate nell’ultimo tratto
• Successivamente prelevare sterilmente i batteri di una colonia isolata
(formata cioè da una sola cellula batterica iniziale) ed allestire una coltura
pura
PRINCIPI D’ IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI
CARATTERISTICHE NEI TERRENI LIQUIDI
Morfologia delle colonie
Sistema automatizzato per l’identificazione di microrganismi
Diagnosi eziologica delle malattie infettive (approcci)
Dimostrazione nel materiale patologico dell’agente infettivo o di suoi
componenti
Diagnosi diretta
Dimostrazione nell’organismo infettato di una risposta anticorpale
specifica recente
Diagnosi indiretta