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Metodi di dosaggio delle proteine
totali e specifiche
Arialdo Vernocchi
Servizio di Medicina di Laboratorio
IRCCS MultiMedica- Milano
In condizioni fisiologiche le proteine
urinarie non superano il valore di
0.15 g/24h ( 150 mg/24h)
INDICAZIONI per una
CORRETTA FASE
PREANALITICA
TIPOLOGIA DI CAMPIONE:
 urina delle 24 h che rappresenta il gold standard.
unità di misura: g/24h (si tiene presente la diuresi)
 urina spot sulla quale la proteinuria è espressa come rapporto
tra proteine e creatinina urinaria, la cui escrezione è da
considerarsi costante. Metodo utile per i pazienti pediatrici.
Unità di misura di PrU/CrU: mg/mmol < 15
CONTROINDICAZIONI:
 evitare l’uso del campione con ematuria
 l’esame non va eseguito in caso di IVU
 Se vi sono stati febbrili o flogistici in atto
 Se il paziente ha svolto intensa attività fisica nei due o tre
giorni precedenti la raccolta
Variabilità Analitica

Il contesto clinico richiede la minima variabilità
totale (VT) del risultato biochimico


Il contributo di VI a VT è “incomprimibile”
Il contributo della variabilità analitica (VA) alla
VT deve essere pertanto minimizzato
Differenza critica: il concetto
La differenza tra due misure consecutive
in un paziente (col medesimo metodo) è
dovuta alla combinazione di VA e VI
 La differenza massima dovuta all’effetto
di tali variabilità è la “differenza critica”

(CD)
Kidney may undergo damages and/or dysfunction
Markers of
Damages
Markers of
dysfunction



Total Proteinuria
Specific Proteins







Albuminuria
Alpha-1-Microglobulin
Alpha-2- Macroglobulin
Transferrin
IgG
Beta-2-Microglobulin





Urea
Creatinine
Creatinine Clearance
Cystatin C
Iothalamate Clearance
Neutrophil Gelatinase
– associated Lipocalin
(NGAL)
BJ protein
6
Proteine Urinarie: profilo isoelettroforetico
7
8
Ha ancora senso dosare
la proteinuria totale?
9
Il dosaggio della proteinuria totale con
un metodo robusto può rivelarsi un
formidabile strumento di screening.
In diverse situazioni cliniche
(Ipertensione arteriosa, Diabete,
Mieloma, Preeclampsia, ecc) può
mostrare un elevatissimo valore
predittivo negativo.
10
Le strisce reattive misurano la
proteinuria totale?
11
Le strisce reattive misurano (quasi) unicamente
l’albumina, con il metodo all’errore dell’indicatore.
Sono di recente introduzione in commercio strisce reattive
che sono sensibili anche ad alcune proteine tubulari, ma
mai alla proteina di Bence Jones.
Purtroppo questi metodi perdono di specificità in svariate
circostanze, la più frequente delle quali è rappresentata
dalle urine alcaline.
12
Complessivamente in letteratura
emerge uno scarso ruolo delle
strisce reattive per l’identificazione
della proteinuria.
LIMITI DEL
DIPSTICK
Dipstick test (semiquantitativo) si basa sulla reazione
dell’albumina con un colorante,il tetrabromofenolo
Limitazioni:
 valuta la sola presenza dell’albumina
 è poco o per nulla sensibile alle proteine
tubulari
 falsi positivi se le urine sono concentrate , a
pH >8.0,
in caso di macroematuria,piuria, batteriuria,muco
ed uso di farmaci antisettici
 falsi negativi se le urine sono diluite o in
presenza di valori di pH < 4.5
Quali sono i metodi per il dosaggio
della proteinuria totale?
15
I metodi di dosaggio delle proteine totali urinarie
Tra i più noti e talvolta famigerati, si ricordano:
1)Metodi per precipitazione (da dimenticare!)
2)Metodi ai coloranti (Blu di Comassie o Rosso di Pirogallolo)
senza Sodio Dodecil Solfato (SDS)
3)Metodi ai coloranti - Blu di Comassie o Rosso di Pirogallolo
(SDS)
4)Metodi ai coloranti (Eritrosina B)
5)Metodi che utilizzano derivati dell’Ammonio quaternario
Proteine Totali Urine / 24 h
Traguardi analitici





V intra
V inter
Imprecisione desider.
ET ammissibile
CD
Ricos C. - 2012
39.6 %
17.8 %
19.8 %
43.5 %
122.6 %
Clinical Chemistry 46:3
392–398 (2000)
Total Protein Determination in Urine:
Elimination of a Differential Response
between the Coomassie Blue and
Pyrogallol Red ProteinDye-binding
Assays
Thomas Marshall and Katherine M. Williams
Esiste un metodo di riferimento per il
dosaggio della proteinuria totale?
19
Esiste un proposed selected method pubblicato negli
anni ’70 su Clinical Chemistry da Doetsch e Gadsden.
Le reazioni di base combinano quella di lowry (ottima
per sensiblità) con quella del biureto (ottima per
specificità).
La sensibilità complessiva è esaltata da una doppia
cromatografia su colonna, che consente una
concentrazione del misurando.
I metodi del commercio dovrebbero essere riferiti a
questo di riferimento.
20
Esiste un calibratore di riferimento per il
dosaggio della proteinuria totale?
21
Purtroppo non esiste un materiale di
riferimento per il dosaggio della
proteinuria totale, contrariamente a quanto
accade per le proteine specifiche (CRM
470 e IFCC 470K).
22
Proteinuria:
principio dei metodi colorimetrici
 Blu
di Comassie / Rosso di Pirogallolo
 Lettura al “punto finale” dopo 300’
 λ 600 nm
 Sodio Dodecil Solfato [30 mg/l]
 Iso risposta dell’albumina, “globuline” e
proteina di Bence Jones
 Variabilità Analitica < 6%
 Standard a matrice umana (urina liofila)
 Rapporto
reagente/campione:
unico
strumento per governare la linearità e la
sensibilità del metodo
23
Sodio Dodecil Solfato
SDS interviene
rompendo i legami
della struttura
terziaria e quaternaria
delle proteine
L’ utilizzo del SDS consente il dosaggio delle diverse
proteine presenti nella matrice urina.
Effetto del detergente SDS
Il reagente PTU SDS dà risposte di assorbanza equivalenti solo per valori più
bassi di proteine presenti nel campione (400 mg/dL) ma non per valori più
alti delle stesse.
Effetto dell'SDS sulle varie classi di proteine a diversa concentrazione
Assorbanza (600 nm)
1
0,8
Albumina
Gamma-globuline
0,6
Emoglobina
0,4
Catene K
0,2
Catene L
0
0
400
800
1200
1600
2000
Conce ntra zione ca m pione (m g/L)
25
26
Clinical Chemistry 59:4
675–683 (2013)
Albuminuria Prevalence in First
Morning Void Compared with
Previous Random Urine from
Adults in the National Health
and Nutrition Examination
Survey, 2009–2010
Sharon H. Saydah et al.
CONCLUSIONS: ACR measured on
random urine samples appears to
overestimate the prevalence of
albuminuria compared to first
morning urine collections.
ALBUMINURIA : ASPETTI
ANALITICI
Metodiche immunochimiche
- Caratteristiche analitiche •Sensibilità di 2mg/L
•Antisieri policlonali (frammenti, parziali
degradazioni, forme glicate)
•Imprecisione del 13% che diventa del 6%
(A.Mosca) per ACR
•CV < 15%
biochimica clinica, 2011, vol. 35, n 2
Albuminuria ACR – Traguardi analitici





V intra
V inter
Imprecisione desider.
ET ammissibile
CD
Ricos C. - 2012
30.5 %
32.5 %
15.3 %
36.3 %
94.5 %
IMPRECISIONE SMEL MM
CQI
CV= 3.71 %
VEQ Albuminuria
REFERTAZIONE
E’ FORTEMENTE SCONSIGLIATO REFERTARE
L’ALBUMINURIA IN mg/L PER LA FORTE INFLUENZA DELLO
STATO DI IDRATAZIONE DEL SOGGETTO
LA RACCOMANDAZIONE E’ QUELLA DI
ESPRIMERE LA CONCENTRAZIONE DI
ALBUMINURIA COME
ACR
OVVERO IL RAPPORTO TRA L’ALBUMINURIA E LA
CONCENTRAZIONE DELLA CREATININURIA NEL
CAMPIONE DI URINE FRESCHE
L’ ACR ,per bassi livelli di proteinuria, va preferito all’ PCR
la cui sensibilità è minore
Microproteine

Alfa1 microglobulina

RBP

Beta2 microglobulina (pH dipendente)

Proteina di BJ
Alfa1 microglobulina - Metodi
Quantitativi
Nefelometrici
Turbidimetrici
(TIA)
Qualitativi

IFE (sensibilità al cut off )
Alfa1 Microglobulina
traguardi analitici





V intra
33 %
V inter
58 %
Imprecisione desiderabile 16.5 %
ET ammissibile
43.4 %
CD
102.2 %
La Proteina di Bence Jones





Mieloma multiplo - micromolecolare
Macroglobulinemia di Waldenström
Amiloidosi
Malattia da deposito di catene leggere
Meno frequente è la presenza di
proteinuria di BJ nei linfomi e nelle
leucemie linfatiche. Raramente si
manifesta in associazione con neoplasie
non linfoproliferative.
38
Sensibilità desiderata: < 10 mg/L
IgD
IgE
IFE - Alfa1 microglobulina
G
A
M
K
L
K
L
IFE SIERO
G
A
A1m
IFE URINE
Proteina di BJ
Un nuovo metodo IFE - HS
Anticorpo “bivalente” anti k e λ
ad elevata avidità
Urine non concentrate
Sensibilità ≤ 6 mg/L
( In pubblicazione )
Prove di Sensibilità
Agarosio SEBIA con anticorpi BIOCI anti CLL
Kappa e Lambda
Kappa
100 mg/L
6.25 mg/L
Lambda
100 mg/L
6.25 mg/L
Prove di Sensibilità
Agarosio Interlab con anticorpi BIOCI anti
CLL Kappa e Lambda
100 mg/L
Lambda
Kappa
100 mg/L
Una pericolosissima “insidia” :
la scelta della lisciatura…
Conclusione


Le strisce reattive non misurano la
proteinuria
Utilizzo di metodi ai coloranti con
SDS per proteinuria totale
Grazie per l’attenzione