B-HCG IE160 - delta chemie biotechnology

DETERMINAZIONE IMMUNOENZIMATICA DIRETTA
DELLA hCG NEL SIERO O PLASMA UMANO
Ref. IE160
96 det.
USO DEL KIT
Metodo immunoenzimatico per la determinazione quantitativa della hCG nel siero o plasma umano.
INTRODUZIONE
La gonadotropina corionica (hCG) è un ormone glicoproteico secreto dalle cellule trofoblasti che della placenta. La
molecola di hCG consiste di due subunità legate con legame non covalente : la subunità alfa e quella beta . La
subunità beta è specifica per l’ormone hCG.
La determinazione dell'hCG è largamente utilizzata per la diagnosi precoce della gravidanza. Elevati valori sierici di
hCG si hanno in corrispondenza con gravidanze multiple, mentre una gravidanza ectopica e placentare può causare
una diminuzione dei livelli di hCG. La determinazione dell'hCG sierica è un utile strumento di monitoraggio della
gravidanza durante il secondo trimestre, specialmente nello screening della Sindrome di Down, insieme ad altri test di
laboratorio (AFP, Estriolo).
La hCG sierica è anche un marker per tumori trofoblastici-corionepiteliomi, alcuni seminomi e teratomi. La
determinazione seriale dell'hCG sierica può essere utilizzata nel monitoraggio di questi tumori in pazienti in terapia. Il
presente sistema di dosaggio utilizza un metodo di cattura tramite un anticorpo monoclonale specifico per la catena
beta (β), e come tracciante un anticorpo monoclonale specifico per la catena alfa (α); pertanto viene rilevata solo
l'intera molecola intatta di hCG.
PRINCIPIO DEL METODO
La hCG è un dosaggio immunoenzimatico one-step ,basato sul principio del metodo “sandwich” . Il sistema utilizza
anticorpi monoclonali ad alta affinità e specificità (uno coniugato ed uno immobilizzato) diretti contro uno specifico
determinante antigenico della sub unità beta della molecola di hCG. Il campione reagisce contemporaneamente con i
due anticorpi.di modo che la molecola di FSH viene legata tra l’anticorpo della fase solida ed il coniugato. Dopo
l’incubazione i pozzetti vengono lavati per rimuovere gli anticorpi marcati che non si sono legati. Viene poi aggiunto il
TMB-Substrato con conseguente sviluppo del colore blu che viene bloccato aggiungendo la soluzione di Stop che
cambia il colore in giallo. La concentrazione di hCG del campione è direttamente proporzionale all’intensità del colore.
L‘assorbanza viene misurata con lo spettrofotometro a 450 nm.
CONTENUTO DEL KIT
1
Micropiastra
12х8 pozzetti
2
Calibratori
3
Controllo
4
Coniugato
5
Diluente del Campione
96 pozzetti separabili trattati con anticorpi monoclonali anti-hCG.
Dopo l’apertura,usare entro 1 mese. Conservare a 2-8 ºC.
Cinque flaconcini contenenti hCG in tampone a base proteica con
concentrazioni di circa *: 0 , 25 , 100 , 250, 500 mIU/ml.
* I valori esatti sono riportati sulle etichette e sui certificati di analisi dei
lotti specifici.
I calibratori sono calibrati sullo standard WHO 4th IS 75/589.
Liquido trasparente o leggermente opalescente di colore giallo chiaro.
Conservanti: 0.1% Proclin 300, 0.004% gentamicina solfato, 0.1% fenolo.
Dopo l’apertura,usare entro 1 mese. Conservare a 2-8 ºC. nei flaconi ben
chiusi
1
5 flaconcini da
0.5 ml
(Calibratore
0 mIU/ml –
2.0 ml)
Controllo, a base di siero umano.L’etichetta riporta il range di accettabilità.
Liquido trasparente o opalescente,di colore giallo chiaro. Conservanti: 0.1%
Proclin 300, 0.004% gentamicina solfato, 0.1% fenolo. Dopo l’apertura,usare
entro
1 mese. Conservare a 2-8 ºC. nel flacone ben chiuso.
0.5 ml
Anticorpi Monoclonali anti-hCG coniugati a Perossidasi da rafano. Liquido
trasparente o lievemente opalescente di color rosa. Conservanti: 0.1% Proclin
300, 0.004% gentamicina solfato, 0.1% fenolo. Dopo l’apertura,usare entro 1
mese.
Conservare a 2-8 ºC. nel flacone ben chiuso.
12 ml
Liquido blu trasparente o leggermente opalescente.
Conservante: 0.1% Proclin 300.
15 ml
Conservare a 2-8°C fino alla scadenza nel flacone ben chiuso.
1
12 ml
6
TMBSubstrato
7
Soluzione di Lavaggio
(concentrata x 25 )
Tetrametilbenzidina in tampone contenente acido citrico. Contiene H2O2.
Liquido trasparente incolore. Dopo l’apertura,usare entro 1 mese. Conservare
a 2-8 ºC. nel flacone ben chiuso.
Liquido trasparente o lievemente opalescente, incolore o giallo chiaro.
Conservare a 2-8 ºC fino alla data di scadenza nel flacone ben chiuso
50 ml
15 ml
8
Soluzione stoppante
PRECAUZIONI PER L’USO
L'affidabilità dei risultati dipende dall'esecuzione corretta delle seguenti buone pratiche di laboratorio:
Non usare reagenti scaduti.
Non mescolare i reagenti di lotti differenti.
Prima dell'uso, aspettare 30 minuti, tutti i reagenti devono stabilizzarsi a temperatura ambiente
(18-24 º C).
Ricostituire con attenzione i reagenti evitando eventuali contaminazioni.
Non effettuare il test in presenza di vapori reattivi (vapori alcalini, acidi e di aldeidi) o di polvere che
potrebbe alterare l'attività enzimatica dei coniugati. Usare
cristalleria lavata e risciacquata
completamente con acqua deionizzata o preferibilmente, materiale usa e getta.
Non lasciare che la micropiastra si asciughi fra la conclusione delle operazioni di lavaggio e la
distribuzione del reagente.
La reazione enzimatica è molto sensibile agli ioni metallici. Di conseguenza, non lasciare che alcun
elemento metallico entri in contatto con le varie soluzioni del substrato o del coniugato.
Utilizzare un puntale nuovo per ogni campione.
La procedura di lavaggio è una tappa critica in questa procedura: rispettare il numero suggerito di cicli di
lavaggio e assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente riempiti e poi siano completamente
svuotati.
Un lavaggio errato può condurre a risultati inesatti.
Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo di colore.
Controllare le pipette e le altre attrezzature per verificare il corretto funzionamento.
Non cambiare la procedura di analisi.
Usare acqua di alta qualità.
Durante la conservazione evitare l'esposizione dei reagenti all'eccessivo calore o alla luce solare
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
●
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Acido solforico 0.2 M . Liquido trasparente incolore. Conservare a 2-8 ºC fino
alla data di scadenza nel flacone ben chiuso
ISTRUZIONI DI SICUREZZA
Tutti i reagenti inclusi nel kit sono intesi per “uso diagnostico in vitro „.
Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione del siero di controllo è stato testato e trovato
negativo per l’ HBsAg, anticorpi del virus dell’ epatite C e gli anticorpi del virus dell’ immunodeficenza
umana (HIV-1 e HIV-2) e l'antigene p24 HIV-1.
Comunque,nessun metodo può completamente assicurare l’assenza di questi agenti infettivi. Pertanto,come
tutti i prodotti provenienti da sangue umano,inclusi i sieri dei campioni, devono esser considerati come
potenzialmente infettivi. Manipolare,perciò, i reagenti secondo i normali comportamenti previsti dalle
normative vigenti che disciplinano tale materia,se esistenti.
Non mangiare, non bere, non fumare, o non utilizzare cosmetici negli ambienti dove avvengono i
dosaggi.
Non pipettare per via orale.
Tutta l'apparecchiatura direttamente in contatto con i campioni e i reagenti così come le soluzioni di
lavaggio, dovrebbero essere considerati come prodotti contaminati ed essere trattati come tale.
Portare camici da laboratorio e guanti usa e getta durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti
e lavarsi le mani dopo il loro utilizzo..
Evitare di rovesciare i campioni o le soluzioni che contengono i campioni.
Evitare il contatto di pelle e mucose con il substrato cromogeno, il tampone di lavaggio e la soluzione
d'arresto
Fornire una sufficiente ventilazione.
MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO DAL KIT
–
–
–
–
–
Acqua distillata o deionizzata ;
micropipetta multicanale automatica o semi-automatica, 100-250 µl;
micropipette calibrabile per volume variabili, 25-250 µl;
Termostato a secco per 37 °С ± 0.1 °C;
Fotometro per micropiastre con una lunghezza d’onda di 450 nm e un intervallo di misurazione di 0-3.0 OD.
Conservazione e stabilità del Kit
Conservare da 2 a 8 °C fino alla data di scadenza. Per minimizzare gli effetti dell’umidità,dopo l’apertura
conservare la micropiastra nel sacchetto chiuso ermeticamente.
RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
La raccolta dei campioni di sangue va fatta secondo le norme in uso . Può essere usato solo siero. Separare il siero al
più presto possibile per evitare emolisi. Un’emolisi massiva può alterare il risultato . Campioni che presentano
materiale corpuscolato vanno chiarificati per centrifugazione prima della prova. Fibrina in sospensione o in aggregati
2
può dare risultati falsamente positivi. Non riscaldare i campioni. Per risultati accurati confrontabili con i range di
normalità utilizzare campioni prelevati al mattino a digiuno. Il sangue va raccolto con provette per prelievo venoso
senza additivi e separatore in gel.I campioni possono essere conservati a 2-8 ºC per non più di 72 ore; possono essere
congelati a -20 ºC. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Non usare campioni che siano stati congelati
e scongelati per più di una volta . Non utilizzare campioni con franca emolisi,iperlipidemia o conservati con sodio azide.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
1. Reagenti pronti all‘uso:
1
.
micropiastra rivestita con anti-hCG
2
.
Calibratori
3
.
Siero di Controllo
4
.
Diluente del Campione
5
.
Coniugato
6
.
TMB-Substrato
7
.
Soluzione di Stop
2. Reagenti da preparare:
Soluzione di Lavaggio. Agitare bene la Soluzione di Lavaggio concentrata. Per preparare la soluzione di Lavaggio
pronta all’uso prendere la quantità necessaria di concentrato e miscelarla con acqua purificata (in rapporto di 1:25)in
un flacone separato. Miscelare bene. La soluzione di Lavaggio 1x così preparata è stabile per almeno 14 giorni a 18-24
ºC se utilizzata secondo la Buona Prassi di Laboratorio.
DILUIZIONE DEI CAMPIONI
Se ad un primo dosaggio un campione risulta avere una concentrazione superiore a quella del Calibratore più
alto,diluire il campione con l’apposito Diluente e ripetere la prova .Tener conto del fattore di diluizione nel calcolare la
concentrazione.
Esempio:
a) diluizione 1:20:
b) diluizione 1:400:
c) diluizione 1:2000:
10 µl Siero + 190 µl Diluente del Campione (miscelare bene)
10 µl diluizione a) 1:20 + 190 µl Diluente del Campione (miscelare bene)
20 µl diluizione b) 1:400 + 80 µl Diluente del Campione (miscelare bene)
PRINCIPIO DEL METODO
Procedura di dosaggio
1
Fissare il numero necessario di microstrisce; Riporre tutti i pozzetti inutilizzati nuovamente dentro il sacchetto.
2
Se la concentrazione del campione è elevata, diluire con il tampone di diluizione.
3
4
Pipettare 25 µl dei calibratori CAL 1 - 5, controllo e campioni nei pozzetti.
Dispensare 100 µl di coniugato in ogni pozzetto.
5
6
Incubare per 60 minuti a 37 °C. Coprire la piastra con la pellicola adesiva.
Preparare la soluzione di lavaggio concentrata 25x diluendola con acqua distillata. Effettuare 5 lavaggi.
7
8
9
10
Dispensare 100 µl di substrato in ogni pozzetto.
Incubare per 20-30 minuti a 18-25 °C al buio.
Dispensare 150 µl di soluzione stoppante in ogni pozzetto.
Misurare le OD (densità ottiche) a 450 nm entro 20 minuti dalla dispensazione della soluzione stoppante.
CALCOLO DEI RISULTATI
1. Calcolare la Densità Ottica media per ciascun Calibratore .
2. Calcolare la Densità Ottica media per ciascun Campione.
3. Sottrarre l’assorbanza media del bianco da ciascuna assorbanza media calcolata.
4. Tracciare il grafico della curva dei calibratori mettendo la DO sull’asse delle Y e la concentrazione dei Calibratori su
quella delle X .
5. Leggere i valori dei campioni direttamente sulla curva dei Calibratori.
6. Se un campione ha più di 500 mIU/ml diluirlo con il Diluente del Campione come descritto nel capitolo DILUIZIONE
DEL CAMPIONE. Moltiplicare il risultato ottenuto per il fattore di diluizione.
3
Esempio
Calibratore
0
DO1
DO2
OD media -bianco
Valore
( mIU/ml )
0.047
0.045
0
0
0.178
0.185
0.136
25
0.572
0.589
0.535
100
1.313
1.413
1.317
250
2.234
2.266
2.204
500
0.384
0.372
0.332
1
2
3
4
Campione
63
Questa tabella è solo a scopo esemplificativo, e non va usata per il calcolo dei campioni. Ciascun utilizzatore deve
ottenere i propri risultare e tracciare la propria curva standard .
Validazione della prova
Perché la prova sia valida i risultati devono soddisfare i seguenti criteri . In caso contrario la prova non è valida e deve
essere ripetuta.
1. DO del bianco: deve essere < di 0.1 a 450 nm.
2. L’assorbanza (DO) del Calibratore 4 (500mIU/ml) deve essere > di 1.3.
3. Il valore del Controllo deve rientrare nel range stabilito.
CARATTERISTICHE DEL KIT hCG
1. Intervallo dinamico del test
L’intervallo della prova è compreso tra 0 e 500 mIU/ml.
2. Sensibilità Analitica
Il limite di determinazione è stato calcolato sulla curva standard determinando la concentrazione media del Calibratore
0 (basata su 10 replicati ) più 2 DS.
La sensibilità del kit HCG è 1 mIU/ml.
3. Specificità (reattività crociata)
Sono state testate le seguenti sostanze per studiare la reattività crociata del kit:
Sostanza
cross reazione, %
hCG
100%
FSH
0.1%
TSH
0.0000%
LH
0.9%
4. Precisione
Precisione nella prova
La tavola seguente mostra i risultati:
Campione
n
Media, mIU/ml
DS
CV,%
1
32
2.0
0.07
3.5
2
32
217.8
3.84
1.76
4
Precisione tra prove
La tavola seguente mostra i risultati:
Campione
Media, mIU/ml
1
1.9
0.1
5.3
2
217.8
5.0
2.3
DS
CV,%
5. Recovery
E’ stato valutato aggiungendo quantità note di hCG ai campioni dei pazienti. I risultati sono riportati nella tabella
sottostante:
Conc.aggiunta,
mIU/ml
Conc. misurata , mIU/ml
Conc.attesa mIU/ml
Recovery,%
-
132.4
250
191.2
183.3
95.8
100
116.2
117.1
100.8
6. Linearità
Il Calibratore 4 (500mIU/ml) è stato diluito con il calibratore 0. I risultati sono riportati nella tabella sottostante:
Campione
Conc. Misurata ,
mIU/ml
Conc.attesa
mIU/ml
Recovery,%
t.q.
500
1:2
250
256.4
102.6
1:4
125
124.4
99.5
1 : 10
50
48.5
96.9
7. Intervallo di Normalità
E’ raccomandabile che ogni Laboratorio stabilisca il proprio intervallo di normalità.
E’ stato condotto uno studio su una popolazione normale di adulti usando il kit hCG e sono stati osservati i seguenti
risultati:
Popolazione
Età
N
hCG, mIU/mL
uomini
21-40
100
<10
donne
21-40
100
<10
LIVELLI DI hCG NEL SIERO IN GRAVIDANZA
settimana
Concentrazione mIU/mL
Diluizione del siero consigliata
1-3
50 – 15 000
3-4
1200 – 30 000
1:20 e 1:400
4-5
2500 – 85 000
1:400
5-6
8 500 – 155 000
1:400
6-7
12 000 – 215 000
1:400 e 1:2000
7-8
35 000 – 255 000
1:400 e 1:2000
8-9
40 000 – 280 000
1:400 e 1:2000
9-10
35 000 – 250 000
1:400 e 1:2000
10-11
30 000 – 205 000
1:400 e 1:2000
11-12
16 000 – 195 000
1:400
5
Nessuna diluizione e 1:20
13-14
16 000 – 165 000
1:400
15-16
9 500 – 100 000
1:400
17-21
7 000 – 75 000
1:400
8. Accuratezza
Il kit hCG è stato confrontato con un test di riferimento in Chemiluminescenza su micro particelle. Il numero totale di
campioni è stato di 942.I valori erano compresi tra 0.1 e 150 mIU/ml. L’equazione di regressione dei minimi quadrati
ed il coefficiente di correlazione sono stati calcolati per il kit hCG in confronto con il kit di riferimento. L’equazione è :
y=-0.532+1.056(x) con un coefficiente di correlazione di 0.96.
XIV. LIMITI DEL TEST
1. Tutti i reagenti contenuti nel kit sono indicati per la determinazione diretta dell’ hCG nel siero umano. Il kit non è
indicato per la determinazione dell’hCG nella saliva, nel plasma o altri campioni di provenienza umana o animale.
2. Un utilizzo improprio dei campioni o cambiamenti della procedura del test possono alterare i risultati.
3. La dispensazione dei campioni non deve richiedere più di dieci (10) minuti per evitare fenomeni di drift.
4. Solo il Diluente del Campione può essere usato per diluire campioni ad alta concentrazione. L’uso di qualunque altro
reagente può dare falsi risultati .
5. I risultati ottenuti con il kit non vanno mai usati come unica base per la diagnosi clinica. Qualunque risultato è solo
una parte del quadro clinico complessivo del paziente .
6. Alcuni individui possono avere anticorpi eterofili verso proteine di topo o altri animali che possono interferire con il
test.Perciò i risultati di pazienti che abbiano ricevuto anticorpi di topo per diagnosi o terapia vanno interpretati con
cautela.
7. In questo test non è stato evidenziati alcun effetto gancio fino a 400 000 mIU/ml.
BIBLIOGRAFIA
1. Krieg, A.F. Pregrancy Tests and Evaluation of Placental Function. Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods, 16th ed. Henry, J.B. editor, W.B. Saunders Co. Philadelphia. app. 680, 1979.
2. Brody, S., and Carlstrom, G., Immunoassay of Human Chorionic Gonadotropin in
Normal and Pathologic Pregnancy. J. Clin. Endocrinol. Metab., 22: 564, 1962.
3. Braunstein, G.D., Rasor, J., Adleer, D., et al: Serum Human Chorionic Gonadotropin
Levels Throughout Normal Pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol., 126: 678, 1976.
4. Skinner, M.S., Seckinger, D., Evaluation of Beta-Subunit Chorionic Gonadotropin as an Aid in Diagnosis of
Trophoblastic Disease. Ann. Clin. Lab. Sci., 9 (4): 347-52,
1979.
5. Braunstein, G.D., Vaitukaitis, J.L., Carbone, P.P., and Ross, G.T., Ectopic Production of Human Chorionic
Gonadotropin by Neoplasms. Ann. Intern. Med., 78: 39-45, 1973.
Prodotto conforme alla direttiva 98/79 CE
Rev. 2013.01
Delta Chemie Biotechnology SaS
Via Nuova Poggioreale, 157 – 80143 NA
TEL/FAX: +39 081 787 1577
E-MAIL: [email protected]
WWW.deltachemie.it
6