Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

Transcript

Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard
del Regno Unito
Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e
Microrganismi Morfologicamente Simili
Emesso da the Standards Unit, Microbiology Services Division,PHE
Batteriologia - Identificazione | ID 4 | Emissione no: 3 | Data emissione: 28.10.14 | Pagina 1 di 36
© Crown copyright 2014
Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e Microrganismi Morfologicamente Simili
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del
Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web
https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinicallaboratories. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono
supervisionati da un comitato direttivo (consultare https://www.gov.uk/government/groups/standards-formicrobiology-investigations-steering-committee).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di
riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si
ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services
Public Health Englad
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website: https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-inclinical-laboratories
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
Loghi corretti al momento della pubblicazione
Batteriologia – Identificazione I ID 4 I Emissione 3 I Data di emissione 28.10.14 I Pagina 2 di 36
UK Standards for MIcrobiology Investigations I Emesso da Standards Unit, Health Protection Agency
Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL RU: SCOPO E OBIETTIVO ...................6
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................9
INTRODUZIONE .........................................................................................................................9
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................17
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .......................................................................19
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO .....................................................................................19
3
IDENTIFICAZIONE ..........................................................................................................21
4
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E DI
MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE SIMILI .......................................................27
5
REFERTAZIONE ............................................................................................................28
6
INVIO .............................................................................................................................29
7
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE .......................................................................30
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................31
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la l:
[email protected]
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema
locale di gestione della qualità.
Revisione No/Data
10/28.10.14
Emissione eliminata. no
2.3
Emissione inserita no.
3
Sezione(i) interessate/Pagina no. Modifica.
Scopo del documento .
Il campo di applicazione è stato aggiornato con l'aggiunta di
metodi molecolari come mezzo di identificazione di specie
Streptococcus e Enterococcus isolate da materiale clinico.
La tassonomia di Streptococcus ed Enterococcus è stata
aggiornata.
Introduzione
Maggiori informazioni sono state aggiunte alla sezione
Caratteristiche. Sono menzionate le specie clinicamente
importanti. Sono pure menzionati altri organismi
morfologicamente simili e clinicamente importanti e sono
descritte le loro caratteristiche.
La Sezione sui Principi d’Identificazione è stata riorganizzata
Informazione Tecnica/Limitazioni
Aggiunta di informazioni per quanto riguarda il test della
catalasi, sistemi di identificazione commerciali e
differenziazione tra i gruppi Streptococcus con metodi rapidi
Considerazioni sulla sicurezza
Questa sezione è stata aggiornata per quanto riguarda il
personale di laboratorio
Microrganismi target
La sezione sugli organismi bersaglio è stata aggiornata e
presentata in modo chiaro.
Gli aggiornamenti sono stati fatti su 3.2, 3.3 e 3.4 per
riflettere standard nella pratica. Questo include anche tutti i
microrganismi morfologicamente simili a parte le specie
Enterococcus e Streptococcus.
Identificazione
La tabella in 3.4 e la nota in calce è stato aggiornato con i
riferimenti.
Punto 3.5, è stato aggiornato per includere i Metodi
Molecolari Rapidi.
Diagramma di Flusso
La modifica del diagramma di flusso per l'identificazione di
specie Enterococcus e Streptococcus è stato fatto per
facilitare l’orientamento.
Refertazione
Sottosezione 5.1 è stata aggiornata per riflettere la pratica di
di refertazione..
Invio
Aggiornati gli indirizzi dei laboratori di riferimento
Intero documento
Documento presentato in nuovo formato.
Bibliografia
Bibliografia In parte aggiornata.
Ricerche Microbiologiche Standard del RU#: Scopo e
Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
• Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai
professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive.
• Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio
riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni
forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati.
• Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della
sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la
salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione.
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del
processo diagstico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di
laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).
Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi
differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono
metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della
prova,
La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una condizione
essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le attività di ricerca e
di sviluppo.
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS, Royal
College of Pathologists e le organizzazioni professionali.
L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito https://www.gov.uk/uk-standardsfor-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-in-clinical-laboratories.
L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo
di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del
comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono
non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a
quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale
per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione.
Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione.
#
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General Medical
Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai
Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte
dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.
Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere
per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le
SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto
livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori
dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le
SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell’accreditamento con la promozione di procedure
d’elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo
sviluppo del metodo
Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle
attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli
messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono
partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo
di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei
pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e
organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le
esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al
pubblico con l’accesso libero al nostro sito web
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile
precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le
informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/equality-and-diversity. I
Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con
gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di
sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità
per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con
qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza
dove e da chi sono state effettuate tali modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso
della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni
dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2014). Identification of Streptococcus species, Enterococcus species and
Morphologically Similar Organisms. UK Standards for Microbiology Investigations. ID 4 Emissione 3.
https://www.gov.uk/uk-standards-for-microbiology-investigations-smi-quality-and-consistency-inclinical-laboratories
Scopo del Documento
Questa SMI descrive l’identificazione con metodi fenotipici e molecolari di generi o specie
Streptococcus ed Enterococcus isolati da materiale clinico. Sono inclusi microrganismi delle specie
morfologicamente simili agli streptococchi che possono essere riscontrati in questi campioni.
A causa della costante evoluzione della classificazione tassonomica di questo gruppo di microrganismi
il ricorso ai soli metodi fenotipici può non essere sufficiente all’identificazione a livello di specie. Per la
classificazione questa SMI adotta un approccio semplificato raggruppando i microrganismi con
caratteristiche fenotipiche simili1. Su indicazione clinica od epidemiologica può essere
successivamente richiesta una identificazione più specifica.
Questa SMI deve essere usata congiuimalintamente con le altre SMI.
Introduzione
Tassonomia
Negli ultimi anni la tassonomia degli streptococchi e dei microrganismi correlati ha subito una
sostanziale revisione, in gran parte dovuta all’utilizzo dei metodi molecolari d’identificazione. Inoltre, i
sistemi d’identificazione americani ed anglosassoni adottano terminologie di tipo diverso per definire
alcuni streptococchi. Ora sono conosciute 99 specie di Streptococcus, molte delle quali sono associate
a malattie dell’uomo e degli animali2
Il nome del genere Enterococcus, suggerito nel 1903 per batteri in precedenza definiti Streptococcus
faecalis e Streptococcus faecium, è stato modificato nel 1984, quando in questo genere sono stati
inclusi altri microrganismi1,3. Ora i componenti del genere Enterococcus presenti in letteratura sono 48.
Enterococcus faecalis ed Enterococcus faecium sono quelli di più frequente riscontro nelle infezioni
umane4.
Caratteristiche
Gli Streptococchi sono cocchi Gram positivi (sferici od ovoidali) spesso disposti in coppie o in
catenelle. Gli Streptococchi sono anaerobi facoltativi e catalasi negativi1. I carboidrati sono
metabolizzati per via fermentativa; l’acido lattico è il metabolita principale. Gli Streptococchi producono
l’enzima leucina amino peptidasi (LAP) noto anche come leucina arilamidasi.
Sull’agar sangue le specie presentano emolisi di vario tipo, utilizzata come prima fase per
l’identificazione clinica degli isolati. Per l’identificazione preliminare sono importanti il tipo di emolisi su
agar sangue e la classificazione sierologica di Lancefield.
Emolisi su agar sangue:
•
α-emolisi – determina lisi parziale dei globuli rossi che circondano una colonia ed una
colorazione verdastra del terreno
•
β-emolisi – determina lisi completa dei globuli rossi che circondano una colonia causando un
alone di chiarificazione del sangue presente nel terreno
•
non-emolisi o in precedenza γ-emolisi ) – nessun cambiamento di colore o chiarificazione del
terreno
•
α‘-prima (α‘) o “ampia area α“ di emolisi – ristretta area con globuli rossi integri in prossimità
della colonia circondata da alone di emolisi completa. Questo tipo di emolisi può essere
confusa con la β-emolisi
Classificazione di Lancefield
Gli Streptococchi beta-hemolitici sono ulteriormente caratterizzati con la sierotipizzazione di
Lancefield, che riconosce i carboidrati presenti sul parete della cellula batterica5. Sono descritti 20
sierotipi, definiti gruppi Lancefield dalla A alla V (esclusa la I e J)
Gruppo A di Lancefield
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes è un cocco Gram positivo disposto in catenelle. Dopo 18 - 24 ore di
incubazione a 35°C - 37°C su agar sangue le colonie sono circa di 0.5 mm, cupuliformi, con bordo
continuo. Alcuni ceppi possono produrre colonie mucose. L’emolisi è più evidente nella coltura
incubata in condizioni anaerobiche perché le emolisine sono più stabili in assenza di ossigeno6
Gli streptococchi del gruppo A di Lancefield non si sviluppano su terreni che contengono bile.
Le colonie puntiformi del gruppo S. anginosus possono reagire in modo crociato con gli anticorpi del
7
gruppo A di Lancefield e possono crescere su terreni contenenti bile .
La sensibilità alla bacitracina è stata utilizzata preliminarmente come metodo di screening, ma i risultati
8-12
non sono stati attendibili perché non ad elevata specificità e i metodi variano nei diversi laborator .
Non è stata segnalata resistenza alla benzilpenicillina, fino alla stesura di questo documento.
La prova della pyrrolidonyl arylamidasi (o pyrrolinodyl-aminopeptidasi o PYR) è positiva per gli
streptococchi di Gruppo A e negativa per la maggior parte degli altri streptococchi classificabili,
sebbene alcuni ceppi dei gruppi C e G isolati dall’uomo siano positivi. Anche gli Enterococchi sono
PYR positivi7,9.
Gruppo B di Lancefield
Streptococcus agalactiae
Gli Streptococcus agalactiae si presenta i cocchi Gram-positivi, disposti in catenelle. Dopo 18 - 24 ore
di incubazione a 35°C - 37°C le colonie si sviluppano in modo lievemente maggiore rispetto agli altri
streptococchi (circa 1 mm) e producono un alone di β-emolisi meno evidente. Alcuni ceppi non sono
emolitici13.
Gli streptococchi del gruppo B di Lancefield non crescono su terreni che contengono bile.
Il terreno di Islam può essere utile per il rilievo della produzione di pigmento arancio nella coltura di
isolamento primario e per l’identificazione preliminare, ma non è raccomandato in questa SM13I.
Gruppi di Lancefield A, C, G e L
Streptococcus dysgalactiae sottospecie equisimilis (gruppi di Lancefield A,C,G e L)
Streptococcus equi sottospecie zooepidemicus1 (groppo C di Lancefield)
Stretococcus canis (gruppo G di Lancefield)14.
All’osservazione microscopica queste specie sono rappresentate da cocchi Gram positivi disposti in
catenelle. Gli streptococchi dei gruppi C e G di Lancefield sviluppano colonie di grandi dimensioni
(≥0.5 mm) simili a quelle degli streptococchi di Gruppo A15. Nelle infezioni umane i ceppi S.
dysgalactiae di Gruppo C e G, sottospecie equisimilis, sono identificati più frequentemente di quelli
dotati di antigene di Gruppo A (o L) 5.
Gli streptococchi del gruppo C e G di Lancefield non crescono su terreni che contengono bile. Colonie
puntiformi del gruppo S. anginosus possono reagire in modo crociato con anticorpi dei gruppi C e G di
Lancefield10 e crescere su terreni contenenti bile9
Gruppi di Lancefield A, C, F o G
Gruppo Streptococcus anginosus:
Streptococcus anginosus, Streptococcus anginosus subspecie whileyi, Streptococcus
constellatus subspecie constellatus, Streptococcus constellatus subspecie pharyngis,
Streptococcus constellatus subspecie viborgensis, Streptococcus intermedius (in
precedenza gruppo “Streptococcus milleri”)16
All’osservazione microscopica queste specie sono rappresentate da cocchi Gram positivi disposti in
catenelle. Sull’agar sangue le colonie sono piccole (≤0.5 mm) dopo 16 - 24 ore a 35°C - 37°C
possono presentare emolisi α, β o assenza d’emolisi. Nell’identificazione preliminare del gruppo S.
anginosus le condizioni d’incubazione possono assumere una certa importanza perché la crescita può
essere favorita da una bassa concentrazione di ossigeno e dall’aumento della CO217.
I microrganismi di questo gruppo possono avere antigene di Lancefield di gruppo A, C, F o G o non
essere classificabili in gruppi17. S. intermedius non possiede l’antigene di gruppo. S. constellatus può
esprimere antigene di gruppo C, o F, e S. anginosus antigeni di gruppo A, C, F o G. Gli streptococchi
isolati dall’uomo che esprimono antigene di gruppo F appartengono con elevata probabilità al gruppo
anginosus. Gli streptococchi di questo gruppo crescono su terreni contenenti bile, sebbene non siano
alotolleranti.
La Resistenza ai sulfamidici e alla bacitracina può essere utilizzata come prova di screening per
microrganismi del gruppo anginosus18.
L’identificazione di un isolato da campione clinico appartenente a questo gruppo ha potenzialmente
importanza clinica, dovuta alla propensione di questo gruppo ad essere associato a infezioni
piogeniche invasive.
Gruppo D di Lancefield
Specie Enterococcus, gruppo Streptococcus bovis
Il genere Enterococcus ed i microrganismi del gruppo S. bovis possiedono l’antigene del gruppo D di
Lancefield. Gli streptococchi del gruppo D di Lancefield non crescono sui terreni contenente bile e
possono essere differenziati dagli altri streptococchi per la rapida idrolisi dell’esculina in presenza del
40% di bile.
All’osservazione microscopica gli enterococchi appaiono come cocchi Gram positivi, di aspetto sferico
od ovoidale (0.6 - 2.5 µm), di solito in brodocoltura si presentano a copie o in corte catenelle. Dopo 18
– 24 ore d’incubazione su agar sangue a 35° - 37°C le colonie sono di 1 - 2 mm e su agar sangue di
cavallo presentano emolisi di tipo α, β o assenza di emolisi. La maggior parte delle specie si sviluppa
su agar nutriente a 45°C. Un numero ridotto si sviluppa a 50°C, pH 9.6 e NaCl 6.5%. Questi possono
inoltre sopravvivere ad esposizione termica di 60°C per 30 minuti e sono PYR positivi e ciò li
differenzia da S. bovis eS. gallolyticus.
Gli enterococchi sono anaerobi facoltativi. Due specie del genere, Enterococcus cassiflavus ed
Enterococcus gallinarum, sono mobili. Gli enterococchi sono ossidasi negativi e fermentano i
carboidrati. La maggior parte delle specie è catalasi negativa, alcuni ceppi producono una
pseudocatalasi.
La maggior parte degli enterococchi possiede l’antigene di gruppo D, sebbene alcuni ceppi possano
reagire in modo crociato con l’antisiero del gruppo G di Lancefield19
Raramente E. faecalis sono resistenti all’ampicillina18. Gli enterococchi resistenti alla vancomicina o al
glicopeptide (V/GRE) sono comunque in progressivo aumento e la diffusione della resistenza si ritiene
sia causata da trasposoni e plasmidi che diffondono fra le specie batteriche20. La resistenza alla
vancomicina negli enterococchi è mediata da geni van che codificano enzimi per la sintesi di precursori
a bassa affinità che modificano il bersaglio cui si lega la vancomicina. Ora, sono noti otto fenotipi
resistenti alla vancomicina: vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG, vanL, e vanM. Sono noti 2 tipi di
resistenza ai glicopeptidi negli enterococchi, intrinseco e acquisito. I ceppi con resistenza acquisita
sono gli unici a richiedere di essere controllati e segnalati nei programmi di sorveglianza VRE.
La resistenza acquisita si trova principalmente in Enterococcus faecium ed Enterococcus faecalis ed è
di solito codificata dai geni vanA e vanB. I ceppi che ospitano il gene vanA presentano elevati livelli di
resistenza a vancomicina e teicoplanina, mentre i ceppi che ospitano il gene vanB hanno livelli variabili
di resistenza solo alla vancomicina21.
Nel gruppo S. bovis, sono presenti sei specie che comprendono: S. bovis, S. equinus, S. gallolyticus
(già S. bovis biotipo I), S. infantarius (già S. bovis biotipo II/2) e S. lutetiensis5. Microscopicamente
queste specie sono costituite da cocchi Gram-positivi, che si presentano in catene. Dopo 18-24 ore
d’incubazione a 35 ° C-37 ° C in CO2 o in anaerobiosi, le colonie non sono solitamente emolitiche su
agar sangue e di 1-2mm di diametro. I componenti del gruppo S. bovis possono essere erroneamente
identificati come enterococchi in quanto molti ceppi condividono l'antigene del gruppo D. E 'importante
identificare nel materiale clinico i microrganismi del gruppo S. bovis, in particolare nei casi di
batteriemia, perché S. gallolyticus e S. pasteurianus sono associati a malattie intestinali croniche,
soprattutto all’adenocarcinoma del colon22. Il gruppo S. bovis può essere differenziato dagli
enterococchi per la reazione negativa in entrambe le prove PYR e del test dell’arginina, mentre gli
enterococchi sono generalmente positivi per entrambe.
Streptococcus suis
S. suis è β-emolitico su agar sangue di cavallo, resistente all’optochina e PYR negativo. Questi
microrganismi sono di solito membri dei gruppi R, S e T di Lancefield. S. suis I è associato al gruppo S
e S. suis II al gruppo R. Non si sviluppano in brodo contenente NaCl al 6.5%. Alcuni ceppi sono in
grado di crescere in soluzione contenente bile al 40% e tutti idrolizzano l’esculina.
Gruppi non-Lancefield
Streptococcus pneumoniae
Gli Streptococcus pneumoniae (“pneumococchi”) sono cellule che si presentano in coppie, Grampositive, tipicamente a forma lanceolata, possono essere capsulati. Le colonie sono α-emolitiche, di 1 –
2mm, con aspetto a ‘pedina di dama’ conseguente all’emolisi dei microrganismi dopo incubazione in 5 10% di CO2 a 35°C - 37°C per 16 - 24 ore. In condizioni anaerobiche le colonie possono apparire più
larghe e mucose
Gli S. pneumoniae sono di solito sensibili all’optochina (cloridrato di etilidrocupreina); ciò consente
un’identificazione rapida dei microrganismi, ma è stata segnalata una loro resistenza. S. pneumoniae
sono solubili in soluzioni di sali biliari.
Gli S. pneumoniae possono essere identificati con metodi sierologici. Per la tipizzazione di S.
pneumoniae si può utilizzare la prova microscopica, nota come ‘reazione di Quellung' (rigonfiamento
capsulare) 17,18. L’a ricerca rapida dell’antigene pneumococcico può essere eseguita anche con
confezioni commerciali per agglutinazione, ma queste devono essere usate con cautela per possibili
reazioni crociate con i gruppi di S. oralis e S. mitis.
Streptococchi viridans
"Viridans" deriva dal latino viridis, che significa verde. Queste specie sono costituite da cocchi Gram
positivi disposti in catenelle, alla colorazione Gram non sono distinguibili dai ceppi di streptococchi βemolitici. Le colonie sono di 0.5 - 1.0 mm e su agar sangue, dopo incubazione anaerobica a 35°C –
37°C in CO2 per 16 – 24 ore. Non sono dotati di antigeni di Lancefield e sono resistenti all’optochina.
Non sono pure solubili nella bile.
Nel sottogruppo Streptococcus mitis, Streptococcus pseudopneumoniae è stato scambiato per S.
pneumoniae, ma ha una serie di caratteristiche che permette di distinguerlo da S. pneumoniae:
• Non è dotato di capsula pneumococcica (e pertanto non è tipizzabile)
• Non è solubile nella bile
• E 'sensibile all'optochina quando incubato in ambiente aerobio, ma sembra resistente o avere
sensibilità indeterminata, se incubato in 5% di anidride carbonica
•
I test di ibridazione con sonda DNA commerciale sono falsamente positivi23
Di solito questi streptococchi, non richiedono successiva identificazione, se non come streptococchi α
o non emolitici, da isoali da sedi nelle quali fanno parte della flora residente. Nei casi di sospetta
endocardite la loro identificazione assume valore nel confermare la diagnosi e pure a fini
epidemiologici. Alcune specie di streptococchi, quali Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis
(in precedenza mitior), possono essere responsabili fino all’80% di tutti i casi di endocardite
streptococcica24.
Varianti Nutrizionali di Streptococchi (VNS)
Le VNS sono state recentemente classificate come Granulicatella adiacens, Granulicatella elegans e
Abiotrophia defectiva25. Per la loro crescita le VNS richiedono terreni arricchiti di piridossale o
cisteina26,27.
Le colonie NVS sono piccole, 0.2-0.5mm di diametro e la zona del bordo esterno si ingrossa dopo 24
ore a causa delle sostanze nutrienti presenti nel mezzo circostante. Possono essere non-emolitici o αemolitici. Le NVS sono catalasi negative, ossidasi negative e anaerobie facoltative. Le NVS devono
essere sospettate quando cocchi Gram-positivi simili a streptococchi sono riscontrati in emocolture
positive, che poi non si sviluppano in sottocultura. La ripetizione della sottocultura del brodo sospetto
dovrebbe includere una piastra di agar sangue con una semina strisciata di Staphylococcus aureus poi
esaminata per satellitismo delle NVS attorno allo stafilococco. In alternativa, i terreni possono essere
addizionati con 10mg / L piridossal cloridrato.
Il riconoscimento di queste specie è importante nei casi di infezioni profonde per garantire la terapia
antimicrobica più appropriata (specialmente nei casi di endocardite) per fornire la terapia antimicrobica
più appropriata, ma questi microrganismi sono spesso associati a emocolture negative27-29.
Specie Streptococcus insolite
Sterptococcus acidominimus
Streptococcus acidominimus appartiene al gruppo Streptococcus viridans e al microscopio, si
osservano corte catene. Sono α-emolitici e catalasi negativi. Non idrolizzano l'esculina o l’arginina, ma
fermentano saccarosio e glucosio. Non possiedono antigeni di Lancefield e sono insolubili nella bile e
resistenti all'optochina.
Sono stati segnalati alcuni casi di infezioni umane profonde da S. acidominimus30,31. In genere sono
molto sensibili agli antibiotici β-lattamici.
Generi strettamente correlati agli streptococchi
Specie Aerococcus
Sono note sette specie di Aerococcus, di cui cinque sono patogene e causano infezione sia del tratto
urinario sia di tipo invasivo (tra queste l’'endocardite infettiva nell’uomo) 32-34. Questi sono Aerococcus
christensenii, Aerococcus sanguinicola, Aerococcus urinae, Aerococcus urinaehominis e Aerococcus
viridans.
In coltura gli Aerococci assomigliano agli streptococchi "viridans", ma al microscopio differiscono in
quanto sono tipicamente presenti in coppie, tetradi o a in formazioni a grappolo, simili agli
stafilococchi. A volte producono una debole reazione della catalasi o della pseudocatalasi. Questi
microorganismi a crescita relativamente lenta, producono colonie piccole su agar sangue, ben
delineate, traslucide, alfa-emolitiche. Alcuni ceppi di Aerococcus viridans sono bile esculina positivi e
PYR positivi. Aerococcus urinae è bile esculina negativo e PYR negativo. La crescita si manifesta in
condizioni aerobiche e anaerobiche.
In alcuni sistemi commerciali d’identificazione , Helcococcus kunzii può essere erroneamente
identificato come A. viridans. I sistemi l'API e'Vitek riconoscono A. sanguinicola come A. viridans. In
questo modo i referti d’infezioni causate da A. viridans divengono problematiche quando
l'identificazione si avvale di questi metodi35.
La maggior parte degli aerococci sono sensibili ai beta-lattamici, ed anche a diversi altri gruppi di
antibiotici. Le spècie Aerococcus sono sensibili alla vancomicina, sebbene siano state segnalate MIC
elevate35.
Specie Facklamia
Sono note sei specie delle quali quattro di origine umana (Facklamia hominis, Facklamia languida,
Facklamia sourekii Facklamia ignava). La specie umana più comune è Facklamia hominis. In coltura,
le specie Facklamia assomigliano agli streptococchi "viridans". Sono Gram positive e si presentano in
coppie, gruppi o catene. Le specie Facklamia sono anaerobie facoltative e crescono meglio in
un'atmosfera arricchita di anidride carbonica. Esse sono debolmente α-emolitiche e di solito
idrolizzano l'urea e non aesculin36. Sono catalasi e ossidasi negative, ma positive per pirrolidonil
arilamidasi e leucina aminopeptidasi. Crescono bene in 6.5% NaCl a 37°C ma non riescono a crescere
a 10 o 45°C. Facklamia languida non idrolizza ippurato, diversamente da tutte le altre specie, e questa
è una caratteristica differenziale fra loro37. Non è prodotto acido dal glucosio e altri zuccheri e i nitrati
non sono ridotti38.
Tutte le specie Facklamia sono sensibili all’amoxicillina e alcuni ceppi della specie sono risultati
resistenti a cefotaxime e cefuroxime36.
Specie Gemella
Attualmente sono riconosciute cinque specie isolate da fonti umane: Gemella haemolysans, Gemella
morbillorum (ex Streptococcus morbillorum), Gemella bergeriae, Gemella sanguinis e Gemella
asaccharolytica specie nov39-42.
Le specie Gemella sono catalasi negative, anaerobie facoltative, cocchi a Gram-variabile, disposti a
coppie, tetradi, in grappoli e in catenelle a volte brevi. Alcuni ceppi sono facilmente decolorati alla
colorazione Gram, assumendo aspetto di Gram negativi. Inoltre, alcuni ceppi possono esigere
condizioni rigorosamente anaerobiche per isolamento primario e diventare aerotolleranti dopo il
trasferimento in terreni di laboratorio43. Su agar sangue sono α-emolitici o non-emolitici e assomigliano
alle colonie degli streptococchi viridans. Le colonie sono piccole e da grigiastre a incolori.
In alcuni sistemi d’identificazione commerciali,gli streptococchi "viridans" possono essere
erroneamente identificati come specie Gemella. L'unica differenza tra gli streptococch “viridans " e le
specie Gemella è la disposizione delle cellule e la richiesta per la crescita di piridossale degli
streptococchi ”viridans" 43.
Specie Globicatella
Sono note due specie Globicatella, ma quella implicata nei casi di infezione umana è la Globicatella
sanguinis44-46.
Su agar sangue le specie Globicatella formano piccole colonie simili a quelle degli streptococchi
viridans e producono una debole reazione α-emolitica. Al microscopio appaiono come cocchi Grampositivi isolati, in coppie o in corte catenelle. Sono anaerobie facoltative e catalasi negative. Tuttavia
non producono leucina aminopeptidase44. Sono sensibili alla vancomicina.
Le specie Globicatella possono essere distinte dagli aerococci per la morfologia cellulare. Gli
Aerococci formano coppie e tetradi mentre le specie Globicatella formano corte catene di cocchi.
Specie Helcococcus
Attualmente sono note tre specie di specie Helcococcus isolate da esseri umani. Sono Helcococcus
kunzii, pyogenes Helcococcus e Helcococcus sueciensis47-49.
Le specie Helcococcus sono costituite da cocchi Gram-positivi, catalasi negativi e anaerobi facoltativi.
Questi sono disposti in coppie, tetradi e a grappolo. Sono a lenta crescita e sulla piastra di agar
sangue appaiono come streptococchi viridans. Di solito non sono emolitici a differenza degli aerococci
che formano, dopo l'incubazione, grandi colonie circondate da un’ampia zona di α-emolisi. Da glucosio
e altri zuccheri è prodotto acido ma non gas. Non si manifesta crescita su agar bile-esculina. Queste
specie sono sensibili alla vancomicina.
H. kunzii produce colonie piccole grigie, non-emolitiche;la crescita è stimolata dall'aggiunta al terreno
di base di siero o Tween 80. In alcuni sistemi di identificazione commerciali, Aerococcus viridans può
essere erroneamente identificato come Helcococcus kunzii43.
H. pyogenes produce colonie puntiformi grigio bianche non emolitiche e non idrolizza l’esculina.
Questo pone in evidenza una relativa resistenza alla vancomicina come la specie Pediococcus48.
H. sueciensis produce colonie piccole grigie non-emolitiche dopo 48 ore d‘incubazione anaerobica.
Questa specie è stata identificata utilizzando la confezione biochimica commerciale API49.
Specie Lactococcus
Attualmente sono note sette specie Lactococcusi. Le specie Lactococcus sono fisiologicamente simili
agli Enterococchi e sono state erroneamente identificate perché possiedono molte delle caratteristiche
degli streptococchi e degli enterococchi. Sono anaerobie facoltative, α o non-emolitiche, cocchi Grampositivi che si presentano isolati, in coppia o in catene. Sono bile esculina positive, ma non possiedono
l’antigene di gruppo D43.
Specie Leuconostoc
Il genere Leuconostoc è composto dalle seguenti specie (comprese le specie ri-classificate e
sinonimi): Leuconostoc mesenteroides (specie tipo), L. amelibiosum, L, Argentinum, L. carnosum, L.
citreum, L. cremoris, L. dextranicum, L. durionis, L. fallax, L. ficulneum, L. fructosum, L. garlicum, L.
gasicomitatum, L. gelidum,L. holzapfelii, L. Inhae, L. kimchii, L. lactis, L. miyukkimchii, L. oeni, L.
Palmae,L. paramesenteroides, L. pseudoficulneum e L. pseudomesenteroides.
Leuconostoc mesenteroides è stato implicato in infezioni umane50,51..
Di queste specie, quattro (L. ficulneum, L. fructosum, L. durionis eL. pseudoficulneum) sono state
riclassificate e trasferite al genere Fructobacillus. Ora esse sono rispettivamente Fructobacillus
ficulneum, Fructobacillus fructosum, Fructobacillus durionis e Fructobacillus pseudoficulneum. Si tratta
di specie non patogene che preferiscono come substrato di crescita il fruttosio, ma non glucosio. Si
trovano in nicchie ricche di fruttosio, come fiori, frutta e alimenti fermentati e più recentemente nel
tratto gastrointestinale degli animali che consumano fructosio52.
Leuconostoc mesenteroides è stata suddivisa in 4 sottospecie; 2 di queste (L. cremoris e L.
dextranicum sono state rinominate rispettivamente Leuconostoc mesenteroides sottospecie cremoris e
Leuconostoc mesenteroides sottospecie dextranicum), Leuconostoc mesenteroides sottospecie
mesenteroides e poi una aggiunta più recentemente, Leuconostoc mesenteroides sottospecie
suionicum53.
Le specie Leuconostoc sono cocchi Gram-positivi lenticolari che si presentano in coppie e catene,
sono tipicamente vancomicina resistenti e producono CO2 a partire dal glucosio. Sono catalasi
negative e le colonie su agar sangue sono spesso α-emolitiche. Sono anaerobie facoltative e possono
essere confuse con gli enterococchi perché la maggior parte delle specie Leuconostoc sono bile
esculina positive e alcune presentano reazioni crociate con antiseri del gruppo D43.
Specie Pediococcus
In cultura le specie Pediococcus possono assomigliare a streptococchi viridans, ma al microscopio
sono simili agli stafilococchi. Sono cocchi Gram-positivi che appaiono in coppie, gruppi e tetradi e sono
intrinsecamente resistenti alla vancomicina e moderatamente sensibili agli antibiotici beta-lattamici.
Sono anaerobi facoltativi e catalasi negativi. Tutti i ceppi non sono mobili e su piastra di agar sangue
appaiono come non-emolitici o α-emolitici. Sono leucina amino peptidasi positivi, ciò li distingue dalle
specie Leuconostoc54. Possono essere confusi con gli enterococchi, perché sono bile esculina positivi
e presentano reazione crociata con antisieri del Gruppo D43.
Principi di Identificazione
Gli Isolati da coltura primaria sono identificati da: aspetto della colonia, colorazione Gram, prova della
catalasi, classificazione di gruppo di Lancefield e sensibilità all’optochina. Per la successiva
identificazione ci si può avvale di prove biochimiche o di altro tipo per la differenziazione fra specie.
In alcuni casi, avvalendosi dell’aspetto delle colonie, informazioni cliniche ed esperienza dell’operatore,
si possono omettere le prime fasi dell’identificazione (quali colorazione di Gram e catalasi) e procedere
ad altri accertamenti. Tutte le prove d’identificazione devono in teoria essere eseguite con colonie
sviluppate su agar non selettivi.
Se la classificazione di Lancefield non fornisce una identificazione sufficiente per la gestione clinica,
l’accertamento completo può essere ottenuto utilizzando un sistema di identificazione commerciale, in
associazione ai risultati dei test di sensibilità.
Una particolare attenzione dovrebbe essere rivolta agli isolati che forniscono un insolita identificazione.
Se è richiesta la conferma dell'identificazione, gli isolati devono essere inviati un Laboratorio di
Riferimento in cui è disponibile (a pagamento) il servizio d’Identificazione tassonomica per
streptococchi e altri Gram positivi correlati, generi catalasi negativi.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Sistemi di identificazione commerciali
Al momento della stesura, alcune confezioni commerciali possono fornire risultati inaffidabili per
l'identificazione degli streptococchi α-emolitici. Scarsa è anche la differenziazione tra S. pneumoniae e
il gruppo S. mitis in quanto non sono geneticamente separabili, e pure per le specie Streptococcus
mitis/oralis che possono essere erroneamente identificate come S. pneumoniae55.
Un altro gruppo difficile da differenziare appartiene alle specie S. mitis e gruppi S. sanguinis che sono
spesso considerati come un unico gruppo; questi forniscono risultati discordanti dovuti alla scarsa
qualità del sistema di identificazione utilizzato.
MALDI-TOF MS
Una limitazione di MALDI-TOF MS è dovuta alla mancata pronta differenziazione fra Streptococcus
pneumoniae e gli altri componenti del gruppo Streptococcus mitis. Nonostante questa limitazione, la
sottotipizzazione dei ceppi di Streptococcus pneumoniae con MALDI-TOF MS può essere eseguita in
modo affidabile, anche per ceppi immunologicamente non tipizzabili o non capsulati56.
Test della catalasi
A volte è fornita un debole reazione della catalasi o pseudocatalasi da specie Aerococcus e
Enterococcus .
1
Considerazioni sulla Sicurezza57-73
2
Microrganismi di Gruppo di Rischio 2.
Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza della manipolazione per tutti i microrganismi presentati
in questo documento.
Devono essere indossati e rispettati in ogni momento adeguati dispositivi di protezione individuale
(PPE) e tecniche finalizzate a ridurre al minimo l'esposizione del personale di laboratorio
Le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina
microbiologica di sicurezza.
I datori di lavoro devono garantire che il personale in gravidanza, immunocompromesso o
immunosoppresso deve avere accesso limitato al lavoro con esposizione a questi microrganismi
altamente infettivi o alla manipolazione di isolati con richiesta d’identificazione e, in alcune situazioni,
queste persone devono aver accesso solo a un laboratori a basso rischio74.
Sono state segnalate infezioni acquisite in laboratorio75.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con
la valutazione del rischio.
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto.
2
Microrganismo Bersaglio
Specie Streptococcus segnalate come causa di infezione Umana43,76
Streptococci con antigene A-G di Lancefield1
Group A
Streptococcus pyogenes (Streptococcus anginosus e Streptococcus constellatus sottospecie
constellatus può dare razioni crociate con l’antigene di gruppo A di Lancefield).
Group B
Streptococcus agalactiae
Group C
Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis, Streptococcus equi subspecies equi,
Streptococcus equi sottospecie zooepidemicus (Streptococcus anginosus e Streptococcus
constellatus sottospecie pharyngis può dare razioni crociate con l’antigene di gruppo C di Lancefield).
Group D3,15,19
Specie Enterococcus (consultare di seguito)
Gruppo Streptococcus bovis
La Tassonomia del gruppo S.bovis group è u problema ancora irrisolto14
Streptococcus bovis, Streptococcus gallolyticus77 (Streptococcus gallolyticus subsp gallolyticus (S.
bovis biotype I), Streptococcus gallolyticus subsp pasteurianus (S. bovis biotype II/2),
Streptococcus gallolyticus subsp macedonicus), Streptococcus equinus, Streptococcus infantarius (in
precedenza S. bovis biotype II/1), Streptococcus pasteurianus, Streptococcus lutetiensis
Group F
Streptococcus anginosus,Streptococcus constellatus sottospecie constellatus
Group G
Streptococchi di gruppo G (Streptococcus anginosus e Streptococcus constellatus sottospecie
constellatus può dare razioni crociate con l’antigene di gruppo G di Lancefield).
Steptococchi”viridans”
Sono suddivisi in 5 sottogruppi5. Sono di seguito descritti
Streptococcus anginosus group (noto anche come gruppo S. milleri)16,18
Streptococcus anginosus, Streptococcus anginosus subspecies whileyi, Streptococcus constellatus
subspecie constellatus, Streptococcus constellatus subspecies pharyngis, Streptococcus constellatus
subspecie viborgensis, Streptococcus intermedius
Gruppo Streptococcus mutans - Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus
Gruppo Streptococcus mitis group2 - Streptococcus mitis78, Streptococcus oralis,
Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus
79
14
cristatus, Streptococcus massiliensis , Streptococcus pneumoniae* , Streptococcus
23
14,80
pseudopnemoniae , Streptococcus peroris
, Streptococcus oligofermentans14, Streptococcus
14
14,80
australis , Streptococcus infantis
, Streptococcus sinensis81
Gruppo Streptococcus salivarius Streptococcus salivarius, Streptococcus vestibularis
Altri streptococci con raggruppamento incerto o relazione genetica sconosciuta) -Streptococcus
suis, Streptococcus acidominimus82
Varianti Nutrizionali di streptococci27,29,83 - Granulicatella adjacens, Granulicatella elegans,
Abiotrophia defectiva.
* Tassonomicamente, questo è dimostrato di essere all'interno del raggruppamenti mitis, ma potrebbe
essere separato da tutte le altre specie.
Specie Enterococcus Segnalete come Causa di Infezione Umana
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus dispar,
Enterococcus durans, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus raffinosus
Altri generi generi Segnalati come Causa di Infezione Umana
Specie Aerococcus ,specie Facklamia,specie Gemella, specie Globicatella,specie Helcococcus,specie,
Lactococcus,specie Leuconostoc,specie Pediococcus
3
3.1
Identificazione
Aspetto Microscopico
Colorazione Gram (TP 39 - Staining Procedures)
Le specie Streptococcus, Enterococcus e Lactococcus sono Gram-positive, con cellule rotonde od
ovali disposte a coppie, in corte o lunghe catenelle e talvolta a grappolo.
Gli Streptococcus pneumoniae sono Gram-positivi, di forma lanceolata disposti in coppie, spesso
dotate di capsula visibile.
Le specie Aerococcus, Pediococcus, Facklamia, e Helcococcus sono cocchi Gram-positivi disposti a
grappolo o tetradi.
Le specie Gemella e Leuconostoc sono cocchi Gram-positivi disposti in coppie, grappoli e corte
catenelle (Gemella possono essere facilmente decolorate).
3.2
Terreni di Primo Isolamento
Agar sangue incubato in 5 - 10% di CO2 a 35°C – 37° per 16 – 48 ore o in anaerobiosi a 35°C - 37°C
per 16 - 24 ore per i tamponi faringei (B 9 - Investigation of Throat Swabs).
Agar Staf/Strep incubato in aerobiosi a 35°C – 37°C per 16 - 48 ore.
Agar CLED incubato in aerobiosi a 35°C – 37°C per 16 - 24 ore.
Agar per anaerobi esigenti incubato in anaerobiosi 16 - 48 ore.
3.3
Aspetto Colonia
Microrganismo
“gruppo”
Emolisi
Streptococchi β-emolitici
β
Streptococchi “viridans”
α o non
Enterococchi
α, β o non
Caratteristiche di crescita su agar sangue dopo
incubazione a 35°C - 37°C per 16 – 24 ore
Circa 0.5 mm, margine continuo, possono
assumere aspetto asciutto, può essere difficile
prelevare le colonie dalla piastra
Le colonie sono di 0.5 - 1.0 mm, margine continuo
Le colonie sono di dimensioni maggiori di quelle
degli streptococchi, di solito 1 – 2 mm, aspetto
umido. Emolisi di tipo variabile
S. pneumoniae
α
Colonie di 1 – 2 mm possono apparire a ‘pedina di
dama’. Dopo incubazione anaerobica le dimensioni
delle colonie possono essere maggiori e di aspetto
mucoso
“S. anginosus”
α, β or non
Colonie piccole (≤ 0.5 mm), emolisi di tipo variabile.
Alcuni ceppi possono presentare un addensamento
bianco sopra la colonia
VNS
α or non
Colonie piccole (≤ 0.5 mm), per la crescita
richiedono piridossale o cisteina
α
Assomigliano a streptococchi “viridans”
Specie Facklamia
α or non
Specie Gemella
α or non
Specie Aerococcus
Specie Globicatella
α
Specie Helcococcus
non
Specie Lactococcus
α or non
Specie Leuconostoc
α or non
Specie Pediococcus
α or non
3.4
Assomigliano a specie Aerococcus
Colonie di 0.5 - 1.0 mm, margine continuo
Assomigliano ad enterococchi
Procedure di Prova
3.4.1 Test Biochimici
Prova della catalasi (TP 8 - Catalase Test)
Gli Streptococchi ed i microrganismi di aspetto morfologico simile sono solitamente catalasi-negativi.
A volte una debole reazione della catalasi o della pseudocatalasi è prodotta da specie Aerococcus e
Enterococcus.
Idrolisi bile-esculina (TP 2 - Aesculin Hydrolysis Test)
Enterococchi, streptococchi di Lancefield di Group D e lattococchi idrolizzano l’esculina in presenza di
bile al 40%, gli altri streptococchi sono negativi.
Alcuni ceppi delle specie Aerococcus possono idrolizzare l’esculina.
Prova di Sensibilità all’optochina (TP 25 - Optochin Test )
S. pneumoniae di solito è sensibile all’optochina, gli altri streptococchi sono solitamente resistenti.
Occasionalmente alcuni ceppi di S. oralis, S. mitis e S. pseudopneumoniae possono essere sensibili
all’optochina.
Pyrolidonyl arylamidasi (PYR-aminopeptidasi)
Enterococchi e S. pyogenes sono positivi, gruppo S. bovis e gruppo S. anginosus sono negativi.
Prova di solubilità nella bile (opzionale) (TP 5 - Bile Solubility Test)
S. pneumoniae è solubile nei sali biliari al 10%, S. pseudopneumoniae è parzialmente solubile e gli
altri streptococchi α-emoliici non sono solubili.
Riassunto risultati delle prove
Presenza di
antigene di
gruppo
Lancefield
Prova di
sensibilità
all’optochina24
Catalasi
Idrolisi Bile
Esculina
( TP 25)
(TP 8)
(TP 2)
PYR
(Confezione
commerciale)
Gruppo B, C, F, e
G
+
R
-
-
-
S. pneumoniae
-
S
-
-
d
Gruppo D
+
R
-
+
-
Enterococchi
+
R
v
+
+
R
-
+
-
(V) #
S. bovis
Specie
Aerococcus
-
R
v
v
D
Gruppo A
+
R
-
-
+
Gruppo S.
anginosus
v
R
-
v
-
Streptococchi
“viridans”
-
v
-
ND
ND
Specie Falklamia
-
R
-
-
+
Specie Gemella
-
R
w
-
+
Specie
Globicatella
-
R
-
+
+
Specie
Helcococcus
-
R
-
-
+
Specie
Leuconostoc
-
R
-
d
D
Specie
Pediococcus
cr
R
-
+
-
v variabile
R resistente
S sensibile
w reazione debole ND Nessun dato +
cr reazione crociata
d 6 - 84 % di ceppi positivi
-
# - Nel gruppo S. bovis , Streptococcus infantarius (in precedeza S. bovis biotype II/1) e S. lutetiensis
entrambi forniscono risultati variabili con gli antigeni della classificazione di Lancefield5.
Questi risultati sono coerenti con tassonomia di tre sistemi1,9,84. Diffusamente pubblicati.
3.4.2 Raggruppamento streptococchi (Identificazione confezioni commerciali)
Lancefield ha dimostrato che la maggioranza degli streptococchi patogeni possiedono specifici
antigeni composti da carboidrati, che permettono la classificazione degli streptococchi in gruppi. Questi
antigeni di gruppo dello streptococco possono essere estratti dalle cellule utilizzando acido,
formammide o metodi enzimatici85-87. L'uso di una procedura di estrazione enzimatica riduce
considerevolmente il tempo necessario per l'estrazione dell'antigene e migliora di molto la resa
dell’antigene, solo parzialmente per gli streptococchi del gruppo D.
La maggior parte delle prove con lattici commerciali si avvalgono di reagenti azoto modificati, che
rapidamente estraggono gli antigeni dei gruppi, senza richiedere alcuna incubazione. Le particelle del
saggio con lattice sono sensibilizzate con anticorpo gruppo specifico e agglutinano in presenza
dell’antigene omologo. Gli antigeni gruppo specifici sono estratti da streptococchi utilizzando
temperatura ambiente con procedura di estrazione immediata con acido nitroso. L'estratto è poi
neutralizzato e gli antigeni sono identificati tramite agglutinazione.
Possono verificarsi reazioni crociate per i gruppi Lancefield A, B, C, D, F e G. I laboratori devono
seguire le istruzioni del produttore e le prove rapide e le confezioni devono essere validate prima del
loro uso avendo dimostrato di essere adatte allo scopo.
3.4.3 Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry
(MALDI-TOF MS)
MALDI-TOF è stato sviluppato e validato per determinare specie e caratteristiche di Streptococcus ed
Enterococcus88. Questo ha dimostrato di essere uno strumento rapido e potente per la sua
riproducibilità, velocità e sensibilità dell'analisi. Il vantaggio di MALDI-TOF rispetto a PFGE è dovuto a
fatto che i risultati delle analisi sono disponibili entro poche ore anziché diversi giorni. Una limitazione
di MALDI-TOF è dovuta alla difficoltà di distinguere facilmente tra Streptococcus pneuomoniae e gli
altri componenti del gruppo Streptococcus mitis. Nonostante questa limitazione, la sottotipizzazioni di
ceppi di Streptococcus pneumoniae mediante MALDI-TOF MS può essere eseguita in modo affidabile,
anche per ceppi immunologicamente non tipizzabile o non incapsulati56. Questo strumento è stato
anche utilizzato per identificare aerococci a livello di specie, ma tuttavia, la precisione d’identificazione
del MALDI-TOF MS per specie batteriche non comuni nei campioni clinici, quali aerococci, deve
essere ulteriormente valutata89.
3.4.4 Test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT)
La PCR è ormai affermata come una tecnica rapida, affidabile e riproducibile per l'identificazione di
specie Streptococcus e Enterococcus. Per le specie Streptococcus, sono disponibili vari tipi PCR; sarà
eseguita l'appropriata PCR per i diversi gruppi, loro geni bersaglio e in funzione delle notizie cliniche.
La PCR Multiplex è un'analisi rapida e conveniente che permette l'amplificazione simultanea di più di
un locus nella stessa reazione e questo ha fornito un'alternativa affidabile e rapida ai test fenotipici e
monoplex PCR per il rilevamento di cinque potenziali geni di virulenza (sostanza di aggregazione,
gelatinasi, citolisina, proteine di superficie di enterococchi e, molto recentemente, ialuronidasi) in
enterococchi, determinazione del tipo di capsula di Streptococcus agalactiae, per i sierotipi capsulari di
pneumococco etc90-92.
La PCR è stata utilizzata anche per la rilevazione simultanea di genotipi di resistenza ai glicopeptidici e
l'identificazione a livello di specie di enterococchi clinicamente rilevanti (Enterococcus faecium, E.
faecalis, E. gallinarum, e E. casseliflavus)93.
3.5
Identificazione Successiva
Se è richiesta una successiva identificazione dopo le informazioni ottenute dalle caratteristiche di
crescita, morfologia delle colonie, test della catalasi, colorazione Gram della coltura, risultati sierologici
e risultati di identificazione biochimici, inviare l’isolato al Laboratorio di Riferimento.
Metodi rapidi
Sono stati sviluppati una grande varietà di metodi rapidi di tipizzazione per isolati da campioni clinici; si
tratta di tecniche molecolari come la Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), 16S rRNA gene
sequencing, atpA Gene Sequence Analysis, e la Multilocus sequence typing (MLST). Tutti questi
approcci consentono la sottotipizzazione di ceppi non correlati, ma il risultato ha accuratezza, potere
discriminatorio e riproducibilità diversi.
Tuttavia, alcuni di questi metodi rimangono accessibili solo ai laboratori di riferimento e sono difficili da
implementare per l’identificazione batterica di routine di un laboratorio clinico.
Sequenziamento
Sequenziamento basato sulla tipizzazione emm l'uso di oligonucleotidi che hanno come
bersaglio l’ N-terminale del gene codificante la proteina M rappresenta il metodo più pratico di
tipizzazione perché il gene che codifica la proteina M dello Sterptococcus di gruppo A contiene una
regione ipervariabile soggetta a molti poliformismi a singolo nucleotide, che serve come base per la
tipizzazione emm degli isolati di S. pyogenes94.
atpA Gene Sequence Analysis è utilizzata per differenziare tutte le specie attualmente
conosciute di Enterococcus sulla base delle loro sequenze atpA e il gene 16S rRNA è molto utile per
discriminare i principali gruppi di enterococchi, ossia gruppi di specie E. avium, E. casseliflavus, E.
cecorum, E. faecalis e E. faecium; ma non riesce a discriminare le specie strettamente correlate, vale
a dire gli appartenenti alle specie dei gruppi E. faecalis e E. faecium e le specie Streptococcus non
sono facilmente individuate dalla sequenza del gene 16S rRNA4.
Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
La PFGE è un metodo di tipizzazione molecolare molto riproducibile, discriminante e efficace per studi
epidemiologici di tipizzazione volti a identificare e classificare gli streptococchi e gli enterococchi in
sottotipi; è considerato il standard di riferimento95. Tuttavia, PFGE è risultata essere superiore per
l'interpretazione dei rapporti tra fra ceppi di enterococchi, ma non ha dato luogo a risultati discriminanti
di bande DNA specie-specifiche4. Inoltre, in funzione delle sue caratteristiche, richiede molto tempo
(30 ore o più per eseguire la prova) e necessita di attrezzature speciali; la PFGE non è diffusamente
usata se non nei laboratori di riferimento.
Multi-locus sequence typing (MLST)
La Multi-locus sequence typing (MLST) è uno strumento molto discriminante ampiamente utilizzato per
la tipizzazione filogenetica dei batteri, nonché per studi di'epidemiologia molecolare e della struttura
genetica della popolazione di microrganismi. La MLST si avvale dell’amplificazione PCR e del
sequenziamento di un certo numero di frammenti strutturali di geni essenziali (di solito 6 o 7) o sparsi
attorno al cromosoma batterico. La MLST misura direttamente le variazioni di sequenza del DNA in un
insieme di geni costitutivi e caratterizza i ceppi per i loro profili allelici unici.
Il principio di MLST è semplice: la tecnica comporta l'amplificazione PCR seguita da sequenziamento
del DNA. Le differenze nucleotidiche tra ceppi possono essere controllate in un numero variabile di
geni in funzione del grado di discriminazione desiderato. A causa della conservazione della sequenza
nei geni costitutivi , a volte la MLST non è in grado di differenziare i ceppi batterici, ciò ne limita
l'utilizzo negli studi epidemiologici. I suoi vantaggi sono inequivocabili e i dati di sequenza possono
essere facilmente confrontati tra laboratori, inoltre i dati possono essere memorizzati in un database
centrale facilmente accessibile via Internet; ciò costituisce una potente risorsa per l’epidemiologia
globale96.
Questo metodo è stato utilizzato con successo nella tipizzazione e ricerca della struttura di ceppi di
Streptococcus agalactiae (Streptococco di gruppo B di Lancefield, GBS)97. E’ stato pure utilizzato per
identificare i principali cloni associati a grave malattia pneumococcica invasiva e per la
caratterizzazione di Streptococcus pyogenes (streptococco gruppo A di Lancefield, GAS ) isolati a fini
epidemiologici utilizzando questo metodo con il suo database disponibile su web dedicato e che può
essere consultato su http://pubmlst.org/mlst/98,99.
Tuttavia, gli svantaggi della MLST sono il costo e il notevole lavoro di laboratorio richiesto per
amplificare, determinare, e rileggere la sequenza nucleotidica dei frammenti di DNA bersaglio; ciò
rende il metodo poco adatto per analisi di laboratorio di routine.
3.6
Conservazione e Invio
Se richiesto, eseguire la sottocoltura dell’isolato puro su agar sangue a becco di clarino per l’invio al
Laboratorio di Riferimento.
4 Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e
Microrganismi Morfologicamente Simili
Il diagramma di flusso è solo indicativo.
Batteriologia – Identificazione | ID 4 | Emissione no: 3 | Data emissione: 28.10.14 | Pagina: 27 di 36
UK Standards for Microbiology Investigations | Emesso da Standards Unit, Public Health England
Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e microrganismi morfologicamente simili
5
Refertazione
5.1
Identificazione Presuntiva
Se si riscontrano appropriate caratteristiche di crescita, aspetto della colonia, colorazione Gram della
coltura, catalasi e risultati sierologici.
5.2
Conferma Identificazione
La conferma dell’identificazione e della tossicità sono effettuate solo dalla Respiratory and Vaccine
Preventable Bacteria Reference Unit (RVPBRU) PHE Colindale.
5.3
Medico Microbiologo
Informare il medico microbiologo di tutti gli isolati con identificazione preliminare e confermata di
specie Streptococcus, Enterococcus, e di microrganismi morfologicamente simili, isolati da campioni
prelevati da sedi normalmente sterili.
Per motivi correlati a potenziali malattie invasive, allo sviluppo di sequele di tipo immunologico o
mediate da tossine, segnalare al medico microbiologo, secondo i protocolli locali, gli isolati di
Streptococcus pyogenes ritenuti di “nuovo isolamento” ed i microrganismi dotati di antigeni C o G di
Lancefield che sviluppano “grosse colonie”.
Considerare la possibilità d’informare il medico microbiologo, secondo i protocolli locali, quando il
modulo di richiesta contiene informazioni importanti od aggiuntive che fanno sospettare un’infezione
streptococcica grave o di tipo invasivo quale:
•
Fenomeni mediati da tossina (Sindrome da Shock Tossico o Scarlattina)
•
Fascite (necrotizzante) o miosite, sepsi puerperale
•
Endocardite
•
Ricerca di possibile epidemie o sospette infezioni crociate in ospedale od in altre istituzioni.
•
Profili insoliti di resistenza antimicrobica di specie Enterococcus, includenti vancomicina o altro
glicopeptide, e resistenza di S. pneumoniae alla penicillina.
Secondo i protocolli locali il medico microbiologo deve essere informato degli isolati di streptococco βemolitico di Gruppo B di Lancefield quando:
•
La paziente è gravida, nell’immediato post partum o neonato
Seguire I protocolli locali per la refertazione al medico del paziente
5.4
CCDC
Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione.
5.5
Public Health Englnd100
Fare riferimento alle linee guida attuali del CIDSC ed alle indicazioni del COSURV.
Batteriologia – Identificazione I ID 4 I Emissione no: 2.3| Data emissione: 10.03.14 | Pagina: 28 di 36
5.6
Gruppo Controllo Infezione
In accordo con i protocolli locali, informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati di
streptococchi di Gruppo A, specie Enterococcus glicopeptide resistenti e pneumococchi penicillina
resistenti isolati da pazienti degenti secondo le disposizioni locali. Si deve anche valutare la possibilità
d’informare il Gruppo di Controllo delle Infezioni sull’entità di questi isolamenti in pazienti che sono
attualmente presenti in comunità (incluse le istituzioni per infermiere professionali) secondo le
disposizioni locali, in modo particolare nel caso di sospetta trasmissione crociata.
6
Invio
6.1
Laboratorio di Riferimento
Contattare gli appropriati laboratori nazionali di riferimento per informazioni sugli accertamenti
disponibili, tempi di risposta, procedure di trasporto ed altre, riguardanti il laboratorio di riferimento,
rivolgersi a:
Streptococchi
Streptococcus and Diphtheria Reference Section
Streptococcus and Diphtheria Reference Section
WHO Global Collaborating Centre for Streptococcal and Diphtheria Infections
Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit
Public Health England
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
https://www.gov.uk/rvpbru-reference-and-diagnostic-services
Enterococci:
Antimicrobial Monitoring and Health Care Associated Infections Reference Unit (AMRHAI)
Public Health England
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
https://www.gov.uk/amrhai-reference-unit-reference-and-diagnostic-services
Contattare il centralino della PHE: Tel. +44 (0) 20 8200 4400
Inghilterra e Galles
https://www.gov.uk/specialist-and-reference-microbiology-laboratory-tests-and-services
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.belfasttrust.hscni.net/Laboratory-MortuaryServices.htm
7
Notifica al PHE100,101 o Equivalente102-105
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public
Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della
Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi
urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore.
Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE. Se il
caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora
richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad agenti causali
soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce
l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente
al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici e molte sezioni della
PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d’infezione.
Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione per
Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare Associated
Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification Duties of Registered
Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic Laboratories’.
https://www.gov.uk/government/organisations/public-health-england/about/our-governance#healthprotection-regulations-2010
Esistono accordi diversi in Scozia Scotland102,103, Wales104 and Northern Ireland105.
Traduzione a cura di Roberto Rescaldani, già primario del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San
Gerardo dei Tintori - Monza.
I testi originali e le traduzioni sono disponibili sul Web APSI - www.apsi.it - Webmaster Sergio Malandrin,
Dirigente di primo livello del Laboratorio di Microbiologia e Virologia A.O. San Gerardo dei Tintori di Monza
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