ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit

ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red
Detection Kit
Enhancer
Naphthol
Precipitato
rosso
760-501
05269814001
Fast Red
Coniugato AP
250
Anticorpo
primario
FINALITÀ D’USO
VENTANA ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit (kit di rivelazione
ultraView AP Red) è un sistema indiretto privo di biotina per la rilevazione di anticorpi
primari di topo IgG, di topo IgM e di coniglio mediante il microscopio ottico. Il kit è
concepito per l’uso in laboratorio al fine di identificare i target mediante
immunohistochemistry (IHC) in sezioni di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina
colorato su strumenti VENTANA BenchMark IHC/ISH.
Questo prodotto deve essere interpretato da un patologo qualificato unitamente all’esame
istologico, alle informazioni cliniche pertinenti e ai controlli appropriati.
Questo prodotto è indicato per uso diagnostico in vitro (IVD).
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
L’immunohistochemistry (IHC) è una tecnica usata nei laboratori a scopo diagnostico.
L’IHC si avvale di anticorpi primari specifici che localizzano e si legano agli antigeni in
sezioni di tessuto fissato o congelato. Il legame dell’anticorpo con l’antigene viene
visualizzato mediante determinazione indiretta. Le tecniche più comuni dei metodi indiretti
utilizzano un anticorpo secondario, diretto contro la specie di anticorpo primario e un
enzima con un cromogeno/substrato corrispondente. Questa combinazione dà origine a
un precipitato colorato nel sito del legante dell’anticorpo specifico. Il kit di rivelazione
ultraView AP Red utilizza un metodo indiretto per la visualizzazione di anticorpi specifici
legati ad antigeni mediante la deposizione di un precipitato di colore rosso.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Il kit di rivelazione ultraView AP Red rileva anticorpi specifici di topo e di coniglio, legati ad
un antigene in sezioni di tessuto incluso in paraffina. L’anticorpo specifico viene
individuato da un cocktail di anticorpi secondari marcati con enzima, che localizzano
l’anticorpo primario legato. Il complesso viene quindi visualizzato con substrato Naphthol e
cromogeno Fast Red, il quale produce un precipitato rosso che viene facilmente rilevato al
microscopio ottico.
Il protocollo di colorazione consiste di numerose fasi in cui i reagenti sono incubati a
specifiche temperature e a tempi predeterminati. Alla fine di ciascuna fase di incubazione,
lo strumento BenchMark IHC/ISH lava le sezioni, allo scopo di rimuovere il materiale non
legato, e applica una soluzione coverslip liquida che riduce al minimo l’evaporazione dei
reagenti acquosi dal vetrino.1 I risultati vengono interpretati con un microscopio ottico e
sono utili alla diagnosi differenziale di processi patofisiologici, che possono essere
associati o meno a un particolare antigene.
Per informazioni più dettagliate sul funzionamento dello strumento, fare riferimento al
relativo Manuale d’istruzioni.
La Figura 1 illustra il metodo di determinazione indiretta.
Antigene target
Tessuto
ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection
Figura 1. ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Reaction
MATERIALE E METODI
Reagenti forniti
Il kit di rivelazione ultraView AP Red contiene reagente sufficiente per 250 test.
Un dispensatore da
25 ml
ultraView Universal AP Red Multimer contiene un cocktail di
anticorpi marcati con Alkaline Phosphatase (AP) (<50 μg/ml)
in un tampone contenente la soluzione di conservante
ProClin 300.
Un dispensatore da
25 ml
ultraView Universal AP Red Fast Red A contiene Fast Red
in una percentuale pari a ≤1,0% (w/v), in tampone di acetato
contenente la soluzione di conservante ProClin 300.
Un dispensatore da
25 ml
ultraView Universal AP Red Fast Red B contiene Fast Red
in una percentuale pari a ≤1,0% (w/v), in tampone di acetato
contenente la soluzione di conservante ProClin 300.
Un dispensatore da
25 ml
ultraView Universal AP Red Naphthol contiene Naphthol in
una percentuale pari a ≤1,0% (w/v), in tampone Tris
contenente la soluzione di conservante ProClin 300.
Un dispensatore da
25 ml
ultraView Universal AP Red Enhancer contiene MgCl2 in
una percentuale pari a ≤3% (v/v), in un tampone Tris con la
soluzione di conservante ProClin 300.
Ricostituzione, miscelazione, diluizione e titolazione
Il kit di rivelazione ultraView AP Red è ottimizzato per l’uso su strumenti BenchMark
IHC/ISH. Non è necessaria alcuna ricostituzione, miscelazione, diluizione o titolazione dei
reagenti del kit.
Un’ulteriore diluizione può ridurre la colorazione dell’antigene. È necessario che
l’utilizzatore convalidi qualunque modifica di questo genere. Eventuali differenze nella
processazione del tessuto e nella procedura precedente l’analisi nel laboratorio possono
produrre una variabilità significativa dei risultati. Per ulteriori informazioni sui controlli,
vedere il paragrafo sulle procedure di controllo qualità.
Materiali e reagenti necessari ma non forniti
È possibile che non tutti i prodotti elencati nel foglietto illustrativo siano disponibili in tutte
le zone geografiche. Rivolgersi al distributore locale.
I reagenti e materiali indicati di seguito possono essere necessari per la colorazione, ma
non vengono forniti con il kit di determinazione:
1.
Anticorpo primario
2.
Reagente di controllo negativo
3.
Controlli positivi e negativi dei tessuti (consultare i foglietti illustrativi degli anticorpi
per individuare i tipi consigliati)
4.
Kit di rivelazione
2016-03-17
FT0700-420j
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5.
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16.
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18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
OptiView Amplification Kit
OptiView DAB IHC Detection Kit
ultraView Universal DAB Detection Kit
Proteasi 1
Proteasi 2
Proteasi 3
Hematoxylin
Hematoxylin II
Bluing Reagent
Reaction Buffer Concentrate (10X)
Cell Conditioning Solution (CC1)
Cell Conditioning Solution 2 (CC2)
ULTRA Cell Conditioning Solution (ULTRA CC1)
ULTRA Cell Conditioning Solution 2 (ULTRA CC2)
Antibody Diluent
EZ Prep Concentrate (10X)
Coverslip liquido (alta temperatura)
ULTRA LCS (Predilute)
Vetrini per microscopia, caricati positivamente
Stufa di asciugatura in grado di mantenere una temperatura di 60 °C ± 5 °C
Etichette con codici a barre (etichette con codici a barre appropriate per il controllo
negativo dei reagenti e l’anticorpo primario da testare)
Xilene (per istologia)
Acqua deionizzata o distillata
Coverslip e metodo coverslip sufficiente a coprire il tessuto
Microscopio ottico
Detergente per piatti delicato
Montavetrini automatico (ad esempio Tissue-Tek SCA Automated Coverslipper)
Conservazione e manipolazione
Al ricevimento e quando non è in uso, il prodotto va conservato a 2-8 °C. Non congelare.
L’utente dovrà convalidare eventuali condizioni di conservazione diverse da quanto
indicato nel foglietto illustrativo. Questo kit di rivelazione può essere utilizzato solo dopo la
rimozione dal frigorifero.
Per garantire una dispensazione adeguata e la stabilità di ciascun reagente, riposizionare
il tappo dopo ogni uso e riporre immediatamente il dispensatore nel frigorifero in posizione
verticale.
Ogni kit di rivelazione è provvisto di data di scadenza. Se conservato adeguatamente, il
prodotto resta stabile fino alla data indicata sull’etichetta. Non utilizzare il prodotto oltre la
data di scadenza relativa al metodo di conservazione indicato. Non vi sono segni evidenti
che indichino l’instabilità di questo prodotto. Pertanto, è consigliabile eseguire
contemporaneamente controlli positivi e negativi sui campioni da testare. Se ci sono segni
di instabilità del reagente, è necessario rivolgersi immediatamente al rappresentante
dell’assistenza tecnica di zona.
Prelievo dei campioni e preparazione per l’analisi
I tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina sono idonei all’uso con il kit di rivelazione
ultraView AP Red e con uno strumento BenchMark IHC/ISH (fare riferimento alla sezione
Materiali e reagenti necessari ma non forniti). Il fissativo consigliato per i tessuti è
formalina neutra tamponata al 10% (NBF).2 Come risultato dello spessore della sezione di
tessuto, del tipo di fissazione, prolungata o mediante processi speciali, quali la
decalcificazione di campioni di midollo osseo, possono verificarsi risultati variabili.
Ogni sezione deve essere tagliata con lo spessore appropriato (2-5 μm) per l’utilizzo
dell’anticorpo primario e posizionata su un vetrino per microscopio caricato positivamente.
I vetrini contenenti la sezione di tessuto possono essere cotti/scaldati per almeno 2 ore
(ma non più di 24 ore) in una stufa a 60 °C ± 5 °C. Il riscaldamento dei vetrini viene
utilizzato per asciugare il tessuto dopo l’inserimento nel vetrino e per una migliore
adesione del tessuto al vetrino. NOTA: per conoscere i limiti di riscaldamento fare
riferimento al foglietto illustrativo dell’anticorpo primario. Il riscaldamento prolungato del
tessuto può comportare una minore disponibilità dell’antigene.
Il Clinical Laboratory Improvement Act (CLIA) del 1988, all’articolo 42CFR493.1259 (b),
dispone che “Il laboratorio deve conservare i vetrini colorati per almeno dieci anni dalla
data dell’esame e conservare i blocchi di campioni per almeno due anni dalla data
dell’esame”.
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AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Per uso diagnostico in vitro (IVD).
Solo per uso professionale.
La soluzione ProClin 300 viene utilizzata come conservante in questa soluzione.
È classificata come irritante e può causare la sensibilizzazione della cute. Adottare
precauzioni ragionevoli durante la manipolazione. Evitare il contatto dei reagenti con
occhi, pelle e mucose. Indossare guanti e indumenti di protezione adeguati.
I materiali di origine umana o animale devono essere trattati come materiali a
potenziale rischio biologico e pertanto smaltiti adottando le necessarie precauzioni.
Adottare ragionevoli precauzioni quando si maneggiano reagenti. Evitare il contatto dei
reagenti con occhi, pelle e mucose. Utilizzare guanti monouso e indossare indumenti
protettivi idonei quando si maneggiano materiali tossici o agenti cancerogeni sospetti.
Se i reagenti entrano in contatto con aree sensibili, lavare con acqua abbondante.
Evitare l’inalazione dei reagenti.
Verificare che il contenitore dei rifiuti sia vuoto prima di avviare una fase sullo
strumento. Se non viene presa questa precauzione, il contenitore dei rifiuti potrebbe
tracimare e l’utente potrebbe essere esposto al rischio di scivolare e cadere.
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti perché potrebbe produrre risultati
imprecisi.
Consultare le autorità locali o statali in merito al metodo di smaltimento consigliato.
Per ulteriori informazioni sulla sicurezza, consultare la Scheda dati di sicurezza del
prodotto e la Guida ai simboli e alle frasi di rischio all’indirizzo www.ventana.com.
ISTRUZIONI PER L’USO
Il kit di rivelazione ultraView AP Red è stato sviluppato per l’uso su strumenti BenchMark
IHC/ISH, in combinazione con gli anticorpi primari e gli accessori VENTANA. È possibile
visualizzare i parametri per le procedure automatiche, stamparli e modificarli seguendo la
procedura contenuta nel Manuale d’istruzioni dello strumento. Altri parametri operativi per
lo strumento sono stati preimpostati in fabbrica.
Le procedure di colorazione sugli strumenti BenchMark IHC/ISH sono delineate di seguito.
Per istruzioni più dettagliate e ulteriori opzioni di protocolli fare riferimento al Manuale
d’istruzioni dello strumento. La necessità di Cell Conditioning per il singolo campione
dipende dall’anticorpo usato. Consultare il foglietto illustrativo dell’anticorpo per istruzioni.
Strumenti BenchMark IHC/ISH
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Applicare l’etichetta con codice a barre che corrisponde al protocollo da eseguire.
Caricare l’anticorpo primario, i dispensatori del kit di rivelazione adeguati e il
reagente accessorio necessario sul carosello reagenti, quindi posizionarli sul
coloratore automatico di vetrini.
Controllare i prodotti consumabili e svuotare lo scarico.
Caricare i vetrini nel coloratore automatico.
Avviare la fase di colorazione.
Al termine della fase, rimuovere i vetrini dal coloratore automatico.
Funzionalità di colorazione doppia
La configurazione a colorazione doppia consiste in una colorazione sequenziale: il primo
anticorpo primario viene colorato con la determinazione DAB utilizzando VENTANA
ultraView Universal DAB Detection Kit (kit di rivelazione ultraView DAB) o VENTANA
OptiView DAB IHC Detection Kit (kit di rivelazione OptiView DAB) e viene quindi eseguita
la determinazione del secondo anticorpo primario mediante il kit di rivelazione ultraView
AP Red. Nella configurazione a colorazione doppia, i kit di rivelazione ultraView DAB e
OptiView DAB sono stati ottimizzati per tempi di incubazione specifici utilizzando
CONFIRM anti-CD20 (L26) Primary Antibody (anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26)). Il kit
di rivelazione ultraView AP Red è stato ottimizzato per tempi di incubazione specifici
utilizzando CONFIRM anti-CD3 (2GV6) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (anticorpo
CONFIRM anti-CD3 (2GV6)). Tuttavia, l’utente deve convalidare i risultati ottenuti con
questo reagente. Per i protocolli di colorazione consigliati, fare riferimento alla Tabella 1 e
alla Tabella 2.
Tabella 1. Protocollo di colorazione consigliato per kit di rivelazione ultraView DAB
(utilizzando l’anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26)) e kit di rivelazione ultraView AP Red
(utilizzando l’anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6)) su uno strumento BenchMark GX,
BenchMark XT o BenchMark ULTRA.
Tipo di procedura
Metodo
Sparaffinatura
Selezionato
21100IT Rev G
Cell Conditioning (CC1)
(smascheramento dell’antigene)
5.
Strumento BenchMark GX, delicato
Strumento BenchMark XT, delicato
Strumento BenchMark ULTRA, 36 minuti
Collocare la soluzione coverslip sul vetrino. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare
una soluzione di montaggio compatibile con substrati di fosfatasi alcalina.
Procedure di controllo qualità
Controllo positivo del tessuto
Con ogni procedura di colorazione eseguita è necessario processare un controllo positivo
del tessuto. La pratica di laboratorio ottimale consiste nell’includere una sezione di tessuto
di controllo positivo sullo stesso vetrino del tessuto del paziente. Questa pratica aiuta a
identificare un eventuale errore di applicazione dell’anticorpo primario o di altri reagenti
critici al vetrino di saggio del paziente. Un tessuto con una colorazione positiva debole è
DS Antibody (Red)
Anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6)
più indicato per effettuare un controllo di qualità ottimale. I componenti del tessuto a
Strumento BenchMark GX, 20 minuti
colorazione positiva vengono usati per verificare che l’anticorpo sia stato applicato e che
lo strumento funzioni adeguatamente. Tale tessuto può contenere cellule o componenti
Strumento BenchMark XT, 20 minuti
tissutali a colorazione positiva e negativa e servire come tessuto di controllo sia positivo
Strumento BenchMark ULTRA, 20 minuti
sia negativo. I tessuti di controllo dovrebbero provenire da campioni autoptici, bioptici
Controcolorazione
Hematoxylin II, 4 minuti
o chirurgici recenti preparati o fissati il prima possibile, in modo identico alle sezioni da
testare. Tali tessuti consentono di controllare tutte le fasi della procedura, dalla
Post-controcolorazione
Bluing, 4 minuti
preparazione del tessuto fino alla colorazione. L’uso di una sezione di tessuto fissata
o processata diversamente dai campioni da esaminare, fornisce un controllo per tutti
i reagenti e le fasi del metodo, eccetto la fissazione e la processazione del tessuto.
Tabella 2. Protocollo di colorazione consigliato per kit di rivelazione OptiView DAB
(utilizzando l’anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26)) e kit di rivelazione ultraView AP Red
Utilizzare i controlli positivi noti solo per monitorare le adeguate prestazioni dei tessuti
processati e dei reagenti del test, non come aiuto per stabilire una diagnosi specifica dei
(utilizzando l’anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6)) su uno strumento BenchMark GX,
campioni del paziente. Se i controlli positivi del tessuto non si colorano positivamente,
BenchMark XT o BenchMark ULTRA.
i risultati con i campioni da esaminare non devono essere considerati validi.
Tipo di procedura
Metodo
Controllo negativo del tessuto
Sparaffinatura
Selezionato
Lo stesso tessuto utilizzato per il controllo positivo del tessuto può essere utilizzato come
controllo negativo. La varietà dei tipi di cellule presenti nella maggior parte delle sezioni di
Cell Conditioning (CC1)
Strumento BenchMark GX, 32 minuti
tessuto offre zone di controllo negativo interne, ma questo deve essere verificato
(smascheramento dell’antigene)
Strumento BenchMark XT, 32 minuti
dall’utente. I componenti privi di colorazione dovrebbero dimostrare l’assenza di
Strumento BenchMark ULTRA, 32 minuti
colorazione specifica e fornire un’indicazione di colorazione di fondo (ovvero chiazzatura
o arrossamento). Se è presente una colorazione specifica nei siti di controllo negativi del
Pre-Primary Peroxidase Inhibitor
Selezionato
tessuto, i risultati con i campioni del paziente non devono essere considerati validi.
Anticorpo (DAB)
Anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26)
Discrepanze inspiegabili
Strumento BenchMark GX, 6 minuti
Riferire immediatamente al rappresentante locale dell’assistenza ogni discrepanza
Strumento BenchMark XT, 8 minuti
inspiegabile nei controlli. Se i risultati del controllo della qualità non soddisfano le
Strumento BenchMark ULTRA, 16 minuti
specifiche, i risultati dei pazienti non sono validi. Fare riferimento alla sezione Risoluzione
dei problemi, contenuta nel presente foglietto illustrativo. In tal caso, è necessario
DS Antibody (Red)
Anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6)
identificare e correggere il problema e ripetere i campioni del paziente.
Strumento BenchMark GX, 20 minuti
Controllo negativo del reagente
Strumento BenchMark XT, 20 minuti
Per riuscire a interpretare meglio i risultati, è necessario eseguire un controllo negativo del
Strumento BenchMark ULTRA, 20 minuti
reagente per ciascun campione. Per valutare colorazioni aspecifiche (ovvero chiazzatura
o arrossamento), viene utilizzato un controllo negativo del reagente anziché l’anticorpo
Controcolorazione
Hematoxylin II, 4 minuti
primario. Il vetrino dovrebbe essere colorato con Negative Control Mouse o con Negative
Post-controcolorazione
Bluing, 4 minuti
Control Rabbit, a seconda di quale sia più adeguato. Se si usa un altro reagente negativo
di controllo, diluirlo alla stessa concentrazione dell’antisiero dell’anticorpo primario con
Antibody Diluent. In alternativa ai controlli negativi dei reagenti descritti in precedenza è
A causa delle variazioni nella fissazione e nella processazione dei tessuti, nonché delle
possibile utilizzare il diluente da solo. Il periodo di incubazione del controllo negativo del
condizioni ambientali e degli strumenti di laboratorio, potrebbe essere necessario
reagente deve essere uguale a quello dell’anticorpo primario.
aumentare o diminuire il tempo di incubazione o cell conditioning dell’anticorpo primario in
base ai singoli campioni, alla rilevazione utilizzata e alla preferenza del lettore. Per ulteriori Se si utilizzano pannelli di più anticorpi per le sezioni in serie, è possibile utilizzare un
informazioni sulle variabili di fissazione, consultare “Immunohistochemistry Principles and controllo negativo del reagente su un vetrino come controllo di fondo aspecifico o negativo
per gli altri anticorpi.
Advances”.7
Verifica dell’analisi
Procedure consigliate dopo la processazione sullo strumento
Prima di utilizzare un anticorpo primario o un sistema di colorazione in una procedura
Nota: il cromogeno Fast Red è solubile in alcol e acetone. Non utilizzare bagni d’alcol o di diagnostica, è necessario controllare la specificità dell’anticorpo primario effettuando
acetone né effettuare lavaggi prolungati con xilene per la disidratazione e la
l’analisi su una serie di tessuti con caratteristiche di prestazione immunoistochimiche note
chiarificazione dei vetrini.
che rappresentano tessuti positivi e negativi noti (consultare la sezione Controllo positivo
1.
Per eliminare la soluzione coverslip liquida, lavare i vetrini con 2 soluzioni
del tessuto nel foglietto illustrativo e le raccomandazioni per il controllo qualità del College
successive di un detergente per stoviglie delicato (non utilizzare detergenti per
of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology
lavastoviglie).
Checklist3 o le linee guida approvate da CLSI4 o entrambi i documenti). Ripetere queste
2.
Sciacquare accuratamente i vetrini con acqua deionizzata per ca. 1 minuto. Agitare procedure di controllo qualità per ciascun nuovo lotto di anticorpi o ogni volta che vengono
leggermente per rimuovere l’acqua in eccesso.
modificati i parametri dell’analisi. I tessuti elencati al paragrafo Prestazioni dell’anticorpo
3.
Lasciar asciugare i vetrini per un minimo di 15 minuti in una stufa (45-60 °C) o
primario sono idonei per la verifica dell’analisi.
all’aria, a temperatura ambiente. Assicurarsi che i vetrini siano completamente
Interpretazione dei risultati
asciutti prima di applicare la soluzione coverslip.
Il kit di rivelazione ultraView AP Red fa sì che un prodotto con reazione colorato di rosso
4.
Trasferire i vetrini in un bagno di xilene per un lavaggio rapido di ca. 30 secondi.
precipiti in corrispondenza dell’antigene individuato dall’anticorpo primario. Un patologo
Anticorpo (DAB)
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Anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26)
Strumento BenchMark GX, 6 minuti
Strumento BenchMark XT, 16 minuti
Strumento BenchMark ULTRA, 16 minuti
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qualificato con esperienza nelle procedure immunoistochimiche dovrà valutare i controlli e
qualificare il prodotto colorato prima di interpretare i risultati. Prima di tutto, è necessario
notare la colorazione dei controlli negativi e confrontare tali risultati con il materiale
colorato per verificare che il segnale generato non sia la causa di interazioni non
specifiche.
Controllo positivo del tessuto
Anzitutto, è necessario esaminare il controllo positivo del tessuto colorato per verificare
che tutti i reagenti funzionino correttamente. La presenza di un prodotto di reazione
appropriatamente colorato nelle cellule target indica una reattività positiva. A seconda
della durata del periodo di incubazione e della potenza dell’ematossilina utilizzata, la
controcolorazione darà luogo a una colorazione da azzurro chiaro a blu scuro nei nuclei
delle cellule. Una controcolorazione eccessiva o incompleta può compromettere
l’interpretazione corretta dei risultati.
Se il controllo positivo del tessuto non si colora positivamente, i risultati con i campioni da
esaminare non devono essere considerati validi.
Controllo negativo del tessuto
Il controllo negativo del tessuto deve essere esaminato dopo quello positivo per verificare
l’etichettatura specifica dell’antigene target da parte dell’anticorpo primario. L’assenza di
colorazione specifica nel controllo negativo del tessuto conferma l’assenza di reattività
crociata tra l’anticorpo e le cellule o i componenti cellulari. Se si nota una colorazione
specifica nel controllo negativo del tessuto, i risultati con i campioni del paziente non
devono essere considerati validi.
La colorazione aspecifica, se presente, sarà diffusa. Sarà inoltre possibile osservare una
leggera colorazione sporadica del tessuto connettivo nelle sezioni di tessuti
eccessivamente fissati in formalina. In questo caso è necessario utilizzare le cellule intatte
per interpretare i risultati della colorazione. Le cellule necrotiche o degenerate presentano
spesso una colorazione non specifica.
Tessuto del paziente
I campioni del paziente devono essere esaminati per ultimi. L’intensità della colorazione
positiva deve essere valutata nel contesto di qualsiasi colorazione di fondo (ovvero
chiazzatura o arrossamento) non specifica del controllo negativo del reagente. Come in
qualsiasi altro test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l’antigene in
questione non è stato rilevato, non che l’antigene è assente nelle cellule o nei tessuti
esaminati. Se necessario, utilizzare un pannello di anticorpi per favorire l’identificazione di
reazioni false negative. È necessario anche esaminare la morfologia di ciascun campione
del tessuto utilizzando una sezione colorata con ematossilina ed eosina durante
l’interpretazione dei risultati immunoistochimici. I risultati morfologici del paziente e i dati
clinici pertinenti devono essere interpretati da un patologo qualificato.
6.
7.
8.
9.
Limitazioni specifiche
1.
2.
3.
4.
LIMITAZIONI
Limitazioni generali
1.
2.
3.
4.
5.
L’IHC è un processo diagnostico a più fasi che necessita di formazione specialistica
nella scelta dei reagenti appropriati, nella selezione dei tessuti, nella fissazione,
processazione, preparazione del vetrino e nell’interpretazione dei risultati di
colorazione.
La colorazione del tessuto dipende dalla manipolazione e dall’analisi del tessuto
prima della colorazione. Una fissazione, un congelamento, uno scongelamento, un
lavaggio, un’asciugatura, un riscaldamento e un sezionamento inadeguati o
contaminazione con altri tessuti o fluidi possono produrre artefatti, l’intrappolamento
dell’anticorpo o risultati falsi negativi. Variazioni nella fissazione e nei metodi di
inclusione o le irregolarità intrinseche del tessuto possono provocare risultati
incoerenti.
Una controcolorazione eccessiva o incompleta può compromettere l’interpretazione
corretta dei risultati.
L’interpretazione clinica di qualunque colorazione positiva o della sua assenza deve
essere valutata nel contesto dell’anamnesi clinica, della morfologia e di altri criteri
istopatologici. L’interpretazione clinica di qualsiasi colorazione o della sua assenza
deve essere integrata con studi morfologici, controlli appropriati oltre che da altri test
diagnostici. La responsabilità dell’impiego degli anticorpi, dei reagenti e dei metodi
utilizzati per interpretare la preparazione colorata spetta al patologo qualificato.
È necessario eseguire la colorazione in un laboratorio certificato e autorizzato, sotto
la supervisione di un patologo responsabile della revisione dei vetrini colorati che
garantisca l’adeguatezza dei controlli positivi e negativi.
Gli anticorpi e i reagenti forniti da Ventana Medical Systems, Inc. sono forniti a una
diluizione ottimale per l’uso, purché le istruzioni fornite siano rispettate. Qualsiasi
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deviazione dalle procedure consigliate per il test può rendere nulli i risultati attesi.
È necessario applicare e documentare i controlli appropriati. Gli utenti che non si
attengono alle procedure consigliate per il test devono accettare la responsabilità
dell’interpretazione dei risultati dei pazienti.
I reagenti possono produrre reazioni impreviste in tessuti non sottoposti a test in
precedenza. La possibilità di reazioni impreviste anche in gruppi di tessuti testati
non può essere eliminata completamente per via della variabilità biologica
dell’espressione dell’antigene in neoplasie o in altri tessuti patologici.5 Contattare il
rappresentante locale del servizio di assistenza in caso di reazioni impreviste
documentabili.
Se utilizzati in fasi bloccanti, i normali sieri provenienti dalla stessa sorgente animale
degli antisieri secondari possono causare risultati falsi negativi o falsi positivi a
causa degli autoanticorpi o anticorpi naturali.
I risultati falsi positivi possono essere identificati grazie al legame non immunologico
delle proteine o ai prodotti di reazione al substrato. Questi risultati dipendono
talvolta da un’attività pseudo-perossidasi (eritrociti), dalla perossidasi endogena6 o
dalla fosfatasi alcalina endogena.
Come in qualsiasi altro test immunoistochimico, un risultato negativo indica che
l’antigene non è stato rilevato, non che l’antigene era assente nelle cellule o nei
tessuti esaminati.
5.
6.
Ogni fase della procedura del kit di rivelazione è stata ottimizzata su uno strumento
BenchMark IHC/ISH ed è preimpostata. A causa delle variazioni nella fissazione e
nella processazione dei tessuti, può essere necessario aumentare o diminuire il
tempo di incubazione dell’anticorpo primario su singoli campioni. Il tempo
d’incubazione dell’anticorpo primario dipende dal livello di fissazione del tessuto e
può essere compreso fra 8 e 32 minuti. Per ulteriori informazioni sulle variabili della
fissazione, fare riferimento a “Immunohistochemistry Principles and Advances”7 o
“Immunomicroscopy: A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist.”8
Questo kit di rivelazione, in combinazione con gli anticorpi primari e gli accessori
VENTANA, rileva l’antigene che resiste alla processazione e al sezionamento del
tessuto normalmente fissato in formalina.
Il kit di rivelazione è stato ottimizzato per l’uso con la soluzione di lavaggio Reaction
Buffer, anticorpi primari, accessori e strumenti BenchMark IHC/ISH. L’uso della
soluzione di lavaggio Reaction Buffer è essenziale per il corretto funzionamento di
questo kit di rivelazione. Gli utilizzatori che deviano dalle procedure consigliate sono
responsabili dell’interpretazione dei risultati del paziente in tali circostanze.
Questo kit di rivelazione è stato ottimizzato per l’uso con LCS (Predilute) o ULTRA
LCS (Predilute), noto anche come LCS o Liquid Coverslip (High Temperature). LCS
è una soluzione coverslip prediluita utilizzata sia come barriera fra i reagenti acquosi
e l’aria sia come reagente per la rimozione della paraffina dai campioni di tessuto
durante la procedura di sparaffinatura. La barriera LCS riduce l’evaporazione e
fornisce un ambiente acquoso stabile per le reazioni di ibridazione IHC o in situ
(ISH) effettuate su coloratori automatici di vetrini VENTANA.
Tempi di incubazione e temperature diversi da quelli indicati possono dar luogo a
risultati errati. È necessario che l’utente convalidi qualunque modifica di questo
genere.
Quando si utilizza la colorazione doppia, è possibile osservare leggere variazioni di
tonalità nei singoli cromogeni a causa della reattività crociata tra le reazioni dei
cromogeni.
SINTESI DEI RISULTATI PREVISTI
Prestazioni
Le prestazioni del kit di rivelazione ultraView AP Red sono state valutate mediante studi di
riproducibilità e altri studi rilevanti.
Studi di riproducibilità: colorazione singola
Sono stati eseguiti test di riproducibilità mediante la colorazione di reazioni seriali di
tonsilla fissata in formalina neutra tamponata e inclusa in paraffina con anticorpo primario
anti-Ki67 su strumenti BenchMark IHC/ISH, se non diversamente specificato.
Tutti gli anticorpi primari sono stati incubati per 16 minuti e i vetrini controcolorati mediante
Hematoxylin II seguita da Bluing Reagent. Tutti i vetrini colorati con un anticorpo primario
sono stati confrontati tra loro, per verificare l’adeguatezza e l’intensità della colorazione e
sono stati valutati da un lettore di vetrini qualificato.
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1.
La riproducibilità all’interno della stessa fase (stesso anticorpo primario colorato su
una piattaforma) si basa sul confronto di vetrini colorati lo stesso giorno, nella
stessa fase, sulla stessa piattaforma. Per questo criterio, i vetrini sono stati colorati
2.
su uno strumento BenchMark XT e i risultati sono stati confrontati. La riproducibilità
all’interno della stessa fase per lo strumento BenchMark XT è risultata pari al 100%.
2.
La riproducibilità tra una fase e l’altra è stata calcolata sulla base del numero di vetrini
colorati in 3 fasi per ogni tipo di strumento. Le fasi di colorazione sono state effettuate
al ritmo di una al giorno in 3 giorni separati, utilizzando uno strumento BenchMark XT.
La riproducibilità tra una fase e l’altra per lo strumento BenchMark XT è risultata pari al
100% (30 vetrini su 30, 10 vetrini colorati per un anticorpo primario in 3 fasi diverse).
3.
3.
La riproducibilità tra uno strumento e l’altro è stata calcolata sulla base del numero
di vetrini colorati in 9 fasi su tutti gli strumenti. Le fasi di colorazione sono state
effettuate al ritmo di 1 al giorno in 3 giorni separati, utilizzando 3 diversi strumenti:
BenchMark GX, BenchMark XT e BenchMark ULTRA per IHC. La riproducibilità tra
uno strumento e l’altro del kit di rivelazione ultraView AP Red è risultata pari al
100% (90 vetrini colorati su 90).
Le prestazioni del kit di rivelazione ultraView AP Red sono state determinate colorando 66
sezioni di tessuto sano e malato fissate in formalina tamponata neutra, utilizzando 22
anticorpi primari. Gli anticorpi selezionati rappresentavano specie e isotipi comunemente
utilizzati per effettuare l’IHC. Nel 98% dei casi testati (65 casi colorati su 66), il kit di
4.
rivelazione ultraView AP Red ha riconosciuto l’anticorpo primario e ha garantito
un’adeguata utilità clinica, come è stato accertato dal lettore di vetrini qualificato.
Studi di riproducibilità: colorazione doppia
Sono stati completati studi di riproducibilità per il kit di rivelazione ultraView AP Red
(utilizzando l’anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6)) con il kit di rivelazione ultraView DAB
(utilizzando l’anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26)) al fine di dimostrare:
•
La riproducibilità all’interno della stessa fase e tra una fase e l’altra su strumenti
BenchMark IHC/ISH.
•
La riproducibilità sulla stessa piattaforma sugli strumenti BenchMark IHC/ISH.
•
La riproducibilità tra una piattaforma e l’altra tra gli strumenti BenchMark GX,
BenchMark XT e BenchMark ULTRA.
Tutti gli studi hanno soddisfatto i criteri di accettazione.
Sono stati completati studi di riproducibilità per il kit di rivelazione ultraView AP Red
(utilizzando l’anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6)) con il kit di rivelazione OptiView DAB
IHC (utilizzando l’anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26)) al fine di dimostrare:
•
La riproducibilità all’interno della stessa fase e tra una fase e l’altra su strumenti
BenchMark IHC/ISH.
•
La riproducibilità sulla stessa piattaforma sugli strumenti BenchMark IHC/ISH.
•
La riproducibilità tra una piattaforma e l’altra tra gli strumenti BenchMark GX,
BenchMark XT e BenchMark ULTRA.
Tutti gli studi hanno soddisfatto i criteri di accettazione.
Studi di concordanza: colorazione doppia
5.
6.
7.
8.
•
Se dal vetrino non è stata rimossa tutta la paraffina, la fase di colorazione
deve essere ripetuta utilizzando l’opzione di sparaffinatura estesa, se
disponibile.
•
In alternativa, è possibile eseguire una sparaffinatura manuale esterna allo
strumento. Se viene utilizzata l’opzione manuale, deselezionare la
sparaffinatura online dal protocollo di colorazione prima di caricare i vetrini
sullo strumento. È necessario prestare molta attenzione per assicurarsi che i
vetrini non si asciughino prima della fase di colorazione.
Se la colorazione di un anticorpo specifico è troppo intensa, è necessario ripetere la
fase riducendo il tempo di incubazione di intervalli di 4 minuti fino a ottenere
l’intensità di colorazione desiderata.
Se le sezioni di tessuto vengono rimosse dal vetrino durante il lavaggio, controllare i
vetrini per verificare che siano stati caricati positivamente.
Per un’eventuale azione correttiva, fare riferimento al paragrafo Istruzioni per l’uso,
al Manuale d’istruzioni dello strumento o rivolgersi al rappresentante dell’assistenza
locale.
Se un dispensatore di reagente non eroga liquido, verificare che nella camera di
priming o nel menisco non siano presenti materiali estranei o particelle, come fibre o
precipitati. Se il dispensatore è bloccato, evitare di utilizzarlo e rivolgersi al
rappresentante dell’assistenza locale. Altrimenti, riempire nuovamente il
dispensatore puntandolo verso un contenitore di scarico, rimuovendo il cappuccio
dell’erogatore e premendo verso il basso sulla parte superiore del dispensatore.
Il cromogeno Fast Red è solubile in alcol e acetone. L’esposizione di vetrini colorati
ad alcol e/o acetone può causare una perdita di segnale specifico.
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
È stato completato uno studio sugli strumenti BenchMark GX, BenchMark XT e
BenchMark ULTRA al fine di dimostrare la concordanza tra il vetrino sottoposto a
colorazione doppia utilizzando il kit di rivelazione ultraView DAB (utilizzando l’anticorpo
CONFIRM anti-CD20 (L26)) con il kit di rivelazione ultraView AP Red (utilizzando
l’anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6)) e i vetrini sottoposti a colorazione singola con
anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6) e anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26). I vetrini
sottoposti a colorazione singola sono stati processati con il kit di rivelazione ultraView
DAB applicando le condizioni riportate nel foglietto illustrativo.
È stato completato uno studio sugli strumenti BenchMark GX, BenchMark XT e
BenchMark ULTRA al fine di dimostrare la concordanza tra il vetrino sottoposto a
colorazione doppia utilizzando il kit di rivelazione OptiView DAB (utilizzando l’anticorpo
CONFIRM anti-CD20 (L26)) con il kit di rivelazione ultraView AP Red (utilizzando
l’anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6)) e i vetrini sottoposti a colorazione singola con
anticorpo CONFIRM anti-CD3 (2GV6) e anticorpo CONFIRM anti-CD20 (L26). I vetrini
sottoposti a colorazione singola sono stati processati con il kit di rivelazione ultraView
DAB applicando le condizioni riportate nel foglietto illustrativo.
Tutti gli studi hanno soddisfatto i criteri di accettazione.
per determinare se il problema dipende dall’anticorpo primario o da uno dei reagenti
secondari comuni.
Se il controllo positivo risulta negativo, verificare che il vetrino abbia l’etichetta con
codice a barre corretto. Se il vetrino è stato etichettato correttamente, è necessario
utilizzare gli altri controlli positivi esaminati durante la stessa fase sullo strumento
per determinare se il problema dipende dall’anticorpo primario o da uno dei reagenti
secondari comuni. È possibile che i tessuti siano stati prelevati, fissati o sparaffinati
in modo errato. Utilizzare la procedura appropriata per prelevare, conservare e
fissare i campioni.
Una sparaffinatura incompleta potrebbe determinare artefatti nella colorazione o
assenza di colorazione.
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PROPRIETÀ INTELLETTUALE
BENCHMARK, CONFIRM, ultraView, OPTIVIEW, VENTANA e il logo VENTANA sono
marchi di proprietà di Roche.
Tutti gli altri marchi commerciali sono di proprietà dei rispettivi titolari.
© 2016 Ventana Medical Systems, Inc.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
1.
Se il controllo positivo ha una colorazione più debole di quella attesa, è necessario
utilizzare gli altri controlli positivi esaminati durante la stessa fase sullo strumento
2016-03-17
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INFORMAZIONI DI CONTATTO
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1910 E. Innovation Park Drive
Tucson, Arizona 85755
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www.ventana.com
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Sandhofer Strasse 116
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2016-03-17
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