NOVA Lite® ANCA IFA Kit

NOVA Lite® ANCA (Formalin) Kit with DAPI
Per uso diagnostico In Vitro
Codice prodotto: 708300
Complessità CLIA: elevata
Uso previsto
Questo prodotto è destinato all'uso nello screening e nella titolazione degli anticorpi anti-citoplasma dei
neutrofili (ANCA) circolanti. Questi anticorpi sono maker per la diagnosi e il trattamento della granulomatosi di
Wegener e di altre vasculiti sistemiche.1
Introduzione e descrizione del test
Le vasculiti necrotizzanti, tra cui la granulomatosi con poliangite (in passato nota come granulomatosi di
Wegener13), la poliarterite nodosa, la sindrome di Churg-Strauss, la glomerulonefrite a semilune idiopatica e
la vasculite sistemica ‘sovrapposta’ sono un gruppo di malattie sistemiche correlate che variano
considerevolmente nella loro presentazione clinica e pertanto possono causare problemi nella diagnosi. La
granulomatosi con poliangite è una malattia vascolare grave caratterizzata da granulomi necrotizzanti del
tratto respiratorio e da glomerulonefrite focale. È importante una diagnosi precoce in quando la terapia
immunosoppressiva esercita un effetto importante sull'esito renale ma i sintomi iniziali alla presentazione e
l'esame istologico mediante biopsie sono spesso aspecifici.2
Nel 1982 Davies et al descrissero la presenza di anticorpi anticitoplasma dei neutrofili (ANCA) nel siero dei
pazienti con glomerulonefrite necrotizzante.3 Questa scoperta fu seguita nel 1985 da una pubblicazione di
van de Woude et al secondo la quale 25 pazienti su 27 affetti da granulomatosi con poliangite attiva
presentavano il pattern classico di colorazione citoplasmatica (c-ANCA) nell'immunofluorescenza indiretta.1 Il
pattern c-ANCA classico sui neutrofili fissati in etanolo mostra una colorazione citoplasmatica granulare
caratteristica con una colorazione minima dei lobi nucleari. Il principale antigene bersaglio per gli
autoanticorpi c-ANCA è la proteinasi 3, una serina proteasi.
Un secondo pattern di colorazione ANCA (perinucleare, p-ANCA) venne descritto nel 1988 da Falk et al nei
pazienti nefropatici con vasculite sistemica.4 Si ritiene che il principale antigene bersaglio per gli autoanticorpi
p-ANCA sia la mieloperossidasi, benché numerosi altri antigeni (p.es. lactoferrina, elastasi, catepsina G)
siano associati in misura minore. Il pattern p-ANCA su neutrofili fissati in etanolo mostra una colorazione
perinucleare nettamente delineata.
Molti campioni presentati per il test ANCA risultano positivi anche all'anti-dsDNA, agli anticorpi anti-istone e
ad altri autoanticorpi antinucleari (ANA) che possono mimare il pattern di colorazione p-ANCA. I campioni dei
pazienti positivi agli autoanticorpi ANA possono essere positivi anche agli anticorpi p-ANCA. Ovviamente è
fondamentale distinguere i veri pattern di colorazione c-ANCA e p-ANCA dagli altri artefatti non-ANCA.
Questo obiettivo viene raggiunto utilizzando una combinazione di vetrini con substrato di neutrofili fissati in
etanolo e formalina.
La fissazione in etanolo dei neutrofili fa sì che le proteine citoplasmatiche granulari con carica positiva
migrino verso il DNA con carica negativa del nucleo, con conseguente colorazione perinucleare (p-ANCA).5
Se i neutrofili vengono tratti con un fissativo "cross-linking" come la formalina, questa migrazione viene
impedita e le proteine citoplasmatiche granulari restano nel citoplasma cosicché i veri campioni p-ANCA
presenteranno un pattern di colorazione c-ANCA citoplasmatico granulare sui vetrini fissati in formalina. I
campioni ANA positivi, quando testati su neutrofili fissati in formalina, diventano negativi o mostrano
un'intensità di colorazione fortemente ridotta. I campioni ANA specifici dei granulociti (GS–ANA) che
producono una reazione nucleare o perinucleare sui neutrofili fissati in etanolo diventano negativi quando
vengono testati su neutrofili fissati in formalina.
L'immunofluorescenza indiretta sui vetrini con substrato di neutrofili è il metodo di elezione per lo screening
degli anticorpi ANCA. I vetrini INOVA utilizzano neutrofili umani purificati preparati e fissati per ottenere
pattern di colorazione ottimali. I campioni che danno pattern di colorazione ANCA positivi, ANA e atipici
devono essere titolati.
Principi della procedura
Questo prodotto utilizza una tecnica di immunofluorescenza indiretta6. I campioni dei pazienti e controlli
appropriati vengono incubati con il substrato di neutrofili. Gli anticorpi senza reazioni vengono lavati e quindi
viene applicato un coniugato appropriato marcato con fluoresceina. Il coniugato non legato viene lavato come
indicato in precedenza. I vetrini vengono visualizzati con un microscopio a fluorescenza e i campioni positivi
diventano verde mela in corrispondenza alle aree del neutrofilo in cui si è legato l'anticorpo.
1
Reagenti
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
ANCA (Formalina), vetrini QR - 12 pozzetti/vetrino, con essiccante
Coniugato FITC IgG con DAPI, contenente 0,09% di azoturo di sodio
Controllo cANCA Positivo, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e anticorpi da
siero umano agli antigeni cANCA, prediluito
Controllo pANCA Positivo, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e anticorpi da
siero umano agli antigeni pANCA, prediluito
Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e nessun
anticorpo da siero umano verso ANCA, prediluito
PBS II Concentrato (40x)
Mezzo di montaggio, contenente 0,09% di azoturo di sodio
Coprivetrini
Avvertenze
1.
2.
3.
4.
Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli per questo prodotto è
stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana
(HIV), dell’antigene superficiale dell’epatite B (HBsAg) e dell’epatite C (HCV) in base a metodi
approvati dall’FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell’assenza
del virus dell’HIV, HCV o altri agenti infettivi. Pertanto, i controlli pANCA Positivo, cANCA Positivo e
Negativo Sistemi IFA devono essere trattati come materiali potenzialmente infettivi.14
L’azoturo di sodio viene usato come conservante. L’azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico
se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L’azoturo di sodio può reagire con le tubature in
piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo
smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di acqua per evitare l’accumulo di azide.
Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti.
I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie,
rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali.
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico In Vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel sistema può causare risultati incoerenti.
Un lavaggio incompleto o inefficiente dei pozzetti IFA può causare un elevato rumore.
L’adattamento di questo dosaggio all’uso con unità di sviluppo automatiche dei campioni e altri
dispositivi per la manipolazione dei liquidi, anche parziale, può produrre differenze nei risultati del test
rispetto a quelli ottenuti utilizzando la procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio
verificare che la procedura automatica dia risultati dei test entro limiti accettabili.
Le prestazioni del dosaggio sono influenzate da molti fattori. Tra questi figurano la temperatura
iniziale dei reagenti, l’intensità della lampadina del microscopio usato, la precisione e la riproducibilità
della tecnica di pipettamento, l’accuratezza del lavaggio e la lunghezza dei periodi di incubazione
durante il test. Per ottenere risultati accurati e riproducibili è necessario prestare grande attenzione
alla coerenza.
Nel tempo, il coniugato può cambiare di colore a causa dell'esposizione alla luce. Tuttavia, il cambio
di colore non altera le prestazioni del dosaggio.
Si raccomanda un rigido rispetto del protocollo.
Condizioni di conservazione
1.
2.
3.
4.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza indicata sull'etichetta apposta sulla confezione se conservati e maneggiati in accordo alle
istruzioni.
Una volta volta che i vetrini sono stati rimossi dall'involucro in alluminio, devono essere utilizzati
immediatamente.
Il tampone PBS diluito può essere conservato fino a un mese a 2-8°C.
Il coniugato del kit deve essere tenuto lontano dalla luce del sole, dalla luce fluorescente e dai raggi
UV, quando possibile.
Prelievo del campione
Questa procedura deve essere eseguita con un campione di siero. L’aggiunta di azide o altri conservanti ai
campioni del test può influenzare negativamente i risultati. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti
a trattamento termico o contenenti particolato visibile non devono essere usati. Evitare campioni o sieri
lipemici o fortemente emolizzati. Dopo il prelievo, separare il siero dal coagulo. Il CLSI (in passato NCCLS)
Document H18-A4 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i
campioni a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore; 2) se il test non verrà completato entro 8 ore,
refrigerare il campione a 2-8°C; 3) se il test non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del
campione, congelare a -20°C o a una temperatura inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati
dopo il decongelamento e prima di eseguire il test. Evitare il congelamento e lo congelamento ripetuti.
2
Procedura
Materiale fornito
708300
20
1
1
1
1
2
1
1
1
ANCA (Formalina), vetrini QR - 12 pozzetti
15ml di coniugato FITC IgG con DAPI
0,5 ml di controllo cANCA Positivo
0,5 ml di controllo pANCA Positivo
0,5ml di Controllo Negativo Sistemi IFA
25 ml di PBS II Concentrato (40x)
7ml di Mezzo di montaggio
20 Coprivetrini
Inserto per istruzioni
Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Acqua distillata
Contenitore da 1l (per la diluizione del PBS)
Micropipette e puntali monouso
Camera umida
Spruzzette o Pipette pipette Pasteur
Vaschetta di Coplin
Microscopio a fluorescenza
Metodo
Prima di iniziare
1.
2.
3.
Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (20-26°C) e miscelare bene.
Diluire il PBS Concentrato:IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS concentrato nella misura di
1:40 aggiungendo il contenuto del flacone di concentrato PBS concentrato a 975 ml di acqua distillata
o deionizzata e miscelare accuratamente. Il tampone PBS viene usato per diluire i campioni dei
pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato fino a 4 settimane a
2-8°C.
Diluire i campioni dei pazienti:
a.
Screening iniziale: Diluire i campioni dei pazienti nella misura di 01:20:00 con tampone PBS
diluito (p.es., aggiungere 50μl di siero fino a 950μl di tampone PBS).
b.
Titolazione: preparare diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i
campioni positivi con tampone PBS diluito (ossia 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, ecc). Per esempio,
Prelevare 100μl della diluizione 1:20, miscelare con 100μl di PBS per ottenere una diluizione
1:40. Ripetere per ottenere ulteriori diluzioni.
Procedura del dosaggio
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Preparare i vetrini di substrato: lasciare che il vetrino di substrato raggiunga la temperatura
ambiente prima di rimuoverlo dalla busta. Marcare il vetrino con una matita e collocarlo in una camera
umida idonea. Aggiungere 1 goccia (20-25μl) di controllo positivo e negativo non diluito
rispettivamente ai pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25μl) di campione del paziente diluito ai
pozzetti restanti.
Incubazione del vetrino: incubare il vetrino per 30 ± 5 minuti in una camera umida (la carta
assorbente inumidita posta sul fondo di un contenitore chiuso in vetro o in plastica conserverà le
condizioni di umidità idonee). Non consentire al substrato di seccare durante la procedura di
dosaggio
Lavare i vetrini: dopo l’incubazione, utilizzare una spruzzetta in plastica per eliminare delicatamente
il siero con il tampone PBS diluito. Orientare il vetrino e il flusso di tampone PBS in modo da ridurre al
minimo il wash‑over dei campioni tra i pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente sui
pozzetti per evitare di danneggiare il substrato. Se lo si desidera, collocare i vetrini in una
vaschetta di Coplin di tampone PBS diluito per massimo 5 minuti.
Aggiunta di coniugato fluorescente: Picchiettare per rimuovere l’eccesso di tampone PBS.
Collocare nuovamente il vetrino nella camera umida e coprirlo immediatamente con una goccia di
coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per altri 30 + 5 minuti al buio.
Lavare i vetrini: ripetere il punto 3.
Coprivetrino: le procedure da utilizzare con i coprivetrini variano da un laboratorio all’altro; tuttavia, si
raccomanda la seguente procedura:
a.
Collocare un coprivetrino su carta assorbente.
b.
Applicare il mezzo di montaggio in linea continua sul bordo inferiore del coprivetrino.
c.
Picchiettare per rimuovere l'eccesso di tampone PBS e toccare il bordo inferiore del vetrino
con il bordo del coprivetrino. Abbassare delicatamente il vetrino sul coprivetrino in modo che il
mezzo di montaggio fluisca sul bordo superiore del vetrino senza formazione o
intrappolamento di bolle d’aria.
3
7.
Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza: I vetrini finiti devono essere conservati a 2-8°C e
osservati il più presto possibile.
Controllo della qualità
Un controllo positivo (cANCA Positivo o pANCA Positivo) e il Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere
eseguiti su ogni vetrino per garantire che tutti i reagenti e tutte le procedure vengano eseguite correttamente.
Sieri di controllo aggiuntivi idonei possono essere preparati suddividendo in aliquote campioni di siero umano
e conservandoli a < -70°C. Affinché i risultati di test possano essere considerati validi, devono essere
soddisfatti tutti i criteri seguenti. Se uno qualsiasi di questi non viene soddisfatto, il dosaggio deve essere
considerato non valido e deve essere ripetuto.
1.
Il controllo cANCA Positivo non diluito deve essere > 3+.
2.
Il controllo pANCA Positivo non diluito deve essere > 3+.
3.
Il Controllo controllo Negativo negativo Sistemi del sistema IFA deve essere negativo.
Se i controlli non appaiono come descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto.
Interpretazione dei risultati
Reattività negativa. Un campione viene considerato negativo se una colorazione nucleare e citoplasmatica
specifica è uguale o inferiore al Controllo Negativo Sistemi IFA. I campioni possono mostrare vari gradi di
colorazione di sfondo dovuta agli anticorpi eterofili o ad autoanticorpi di basso livello ai costituenti
citoplasmatici come le proteine contrattili.
Reattività positiva. Un campione è considerato positivo se la colorazione citoplasmatica specifica descritta
di seguito è maggiore del controllo negativo e l'intensità della colorazione è pari a 1+ o superiore.
Determinare il grado o l'intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri:
4+
Fluorescenza verde mela brillante
3+
Fluorescenza verde mela intensa
2+
Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile
1+
Fluorescenza specifica minima che consente di differenziare chiaramente la colorazione
nucleare e/o citoplasmatica dalla fluorescenza di fondo.
Interpretazione del pattern. Possono essere presenti una varietà di pattern di colorazione citoplasmatica in
base ai tipi e alle quantità corrispondenti di autoanticorpi presenti nel campione. È possibile osservare i
seguenti tipi di pattern di colorazione:
cANCA o colorazione citoplasmatica: I campioni c-ANCA positivi e vetrini fissati in formalina presentano
una fluorescenza citoplasmatica granulare. Questo pattern di solito è prodotto dagli anticorpi che reagiscono
con l'enzima granulare primario Serina Proteasi 3 (PR3) o mieloperossidasi (MPO).
Colorazione nucleare
Sui vetrini fissati in formalina, la maggior parte degli antigeni nucleari sono stati distrutti, pertanto i campioni
ANA positivi mostreranno una fluorescenza negativa o fortemente ridotta nel nucleo.
Limiti della procedura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
I campioni inattivati con il calore, emolizzati, microbicamente contaminati o defibrinati in modo
completo possono causare una forte colorazione di sfondo e rendere difficile l'interpretazione.
Ottenere un campione fresco e ripetere il test. L'aggiunta del 2% di albumina e siero bovino al
tampone PBS usato per diluire i campioni può ridurre la colorazione di sfondo dei campioni
problematici.
I risultati IFA Positivi devono essere confermati dai test immunoenzimatici (EIA) mieloperossidasi
(MPO) e proteinasi 3 (PR3).11,12 I vetrini ANCA fissati in formalina possono contribuire alla
determinazione della specificità degli anticorpi, in particolare per i campioni con titolo moderato e alto.
I campioni ANCA-positivi possono non sempre risultare positivi alla mieloperossidasi (MPO) o alla
serina proteinasi 3 (PR3) utilizzando i test immunoenzimatici EIA in quanto altri antigeni di granuli
primari multipli potrebbero essere responsabili del classico pattern di colorazione p-ANCA o c-ANCA
positivo. Questi includono elastasi, lactoferrina, catepsina G, proteina cationica 57 e altri antigeni dei
neutrofili non ancora identificati.
Gli anticorpi anti muscolo liscio (actina) possono reagire con i neutrofili umani fissati in etanolo
nonché con gli alloanticorpi come Mart o NB17. L'actina o gli anticorpi anti muscolo liscio reagiscono
con il citoplasma dei neutrofili producendo un pattern di colorazione omogeneo invece del tipico
pattern c-ANCA con colorazione grossolana. Anche gli alloanticorpi reagiscono con il citoplasma dei
neutrofili producendo una pattern di colorazione fine. Tipicamente, solo il 40% delle cellule o meno
presentano fluorescenza.
I campioni possono contenere più di un anticorpo, p.es. c-ANCA e p-ANCA o c‑ANCA e ANA.
Anticorpi reattivi ai neutrofili possono essere osservate anche nel siero di pazienti con malattia
infiammatoria intestinale o colite ulcerosa8. Sui vetrini con substrato di neutrofili fissato in etanolo,
questi campioni appaiano come un pattern p-ANCA con una colorazione perinucleare molto
accentuata. Sui vetrini con substrato di neutrofili fissati in formalina, questi campioni appaiono
negativi o producono una fluorescenza molto ridotta.
L'uso di reagenti ottenuti da altri tipi di kit di anticorpi fluorescenti (in particolare coniugato) può
influenzare negativamente la sensibilità e la specificità dei vetrini con substrato di neutrofili fissato in
etanolo.
La fonte luminosa, i filtri e le ottiche di microscopi di fluorescenza diversi influenzano la sensibilità del
kit. Le prestazioni del microscopio vengono influenzate in modo significativo da una corretta
manutenzione specialmente se si centra la lampada al vapore e si cambia la lampada dopo il periodo
di tempo raccomandato.
4
9.
10.
11.
12.
Per contrassegnare i vetrini utilizzare solo la matita. L'uso di qualsiasi altro materiale di scrittura può
causare artefatti di colorazione.
Tutte le vaschette di Coplin usate per il lavaggio dei vetrini devono essere ripulite da tutti i residui di
colorante. L’uso di vaschette di Coplin contenenti un residuo di coloranti può causare artefatti di
colorazione.
Questo test da solo non deve essere considerato diagnostico. Occorre tenere in considerazione tutti
gli altri fattori tra cui l'anamnesi clinica del paziente e altri risultati sierologici o di biopsie.
Non sono stabilite prestazioni per matrici diverse dal siero.
Caratteristiche
Valori previsti
Gruppo di pazienti
Persone sane
Morbo di Crohn
Colite ulcerosa
Colangite sclerosante primitiva con malattia infiammatoria intestinale
Cirrosi biliare primaria
Epatite autoimmune
Granulomatosi di Wegener
Poliarterite nodosa *
N°
30
80
46
17
25
15
30
5
% positivi
p-ANCA c-ANCA
0
0
25
0
46
0
58
0
28
0
33
0
0
100
0
100
Tutte le suddette informazioni sono state tratte da Seibold et al9, eccetto quelle contrassegnate da *, che
sono state ottenute da studi interni presso The Binding Site Ltd.
Precisione
Dieci sieri di pazienti (tre p-ANCA-positivi, tre c-ANCA-positivi, due ANA-positivi e due negativi) sono stati
valutati nove volte (in triplicato su tre lotti di kit separati). Il pattern di colorazione per ogni campione differiva
di non più di un'unità di colorazione (sulla base di una scala da 1+ (colorazione debole) a 3+ (colorazione
forte)).
Studio comparativo
Concorrente
100 campioni di siero clinico e 40 sieri da donatore normale adulto (20 uomini, 20 donne) sono stati testati
utilizzando il kit combi ANCA sul sito di legame e un kit di vetrini di un concorrente. I risultati ottenuti sono
stati i seguenti:
c-ANCA
p-ANCA
p-/c-ANCA
ANA
Neg.
c-ANCA
60
3
0
0
0
Il sito di legame
p-ANCA
ANA
3
0
27
0
0
0
0
6
0
0
Neg.
0
0
0
0
40
p-/c-ANCA
0
0
1
0
0
134 su 140 campioni testati hanno dato risultati identici con i due metodi. Per il pattern c-ANCA, la sensibilità
relativa era del 95%, la specificità relativa era del 96% e l'accordo relativo del 96%. Per il pattern p-ANCA, la
sensibilità relativa era del 90%, la specificità relativa era del 97% e l'accordo relativo del 96%. Per i sei
campioni che hanno dato pattern diversi, tutti hanno dimostrato una colorazione molto forte o molto debole
con uno o entrambi i kit e questo può rendere l'interpretazione più difficile.
5
Bibliografia
1.
2.
3.
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Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National
Institute of Health, 2007, Fifth Edition
Fornitore:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745
Technical Service (Outside the U.S.) :
1 858-805-7950
[email protected]
Rappresentante Autorizzato:
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Altenhofstrasse 80
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Tel.: +49-6894-581020
Fax.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628300ITA
February 2013
Revision 1
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