Terreni colturali e controllo di idoneità

Transcript

Terreni colturali
e
controllo di idoneità
Giornata di Studio AFI 31/03/2009
Pergola Luigi - Doppel Farmaceutici
1

Il terreno di coltura è l’
unico mezzo che abbiamo
(con la microbiologia tradizionale) per evidenziare la
presenza di contaminazione microbica; per essere
quindi certi dei risultati di analisi è fondamentale che
questo sia efficace.
2

Tutto questo assume maggior importanza se
consideriamo che, secondo stime pubblicate da Klaus
Haberer al recente PDA Conference di Milano del
Novembre 2008, il recupero della contaminazione si
aggira intorno al 10% del totale della conta vitale.

Questi sono microrganismi ‘
non coltivabili’a causa delle
limitazioni intrinseche del metodo; scelta della
temperatura di incubazione, generalità del terreno, tipo
respiratorio, microrganismi ‘
difficili’che necessitano di
supplementi specifici.
3
 Definizione
di terreno di coltura
4

I terreni di coltura sono dei sistemi solidi o liquidi
contenenti sostanze nutritive generalmente costituite da
fonti di C, H, O, N, S, P sotto forma di amminoacidi e
zuccheri capaci di fornire un ambiente ottimale per la
crescita dei microrganismi.

Un terreno liquido può essere reso solido semplicemente
aggiungendo agar che agendo da solidificante trasforma
il terreno in gelatina.
5
 Classificazione dei terreni
1.
2.
3.
4.
5.
Terreni arricchiti
Terreni selettivi
Terreni di arricchimento
Terreni generici
Terreni indicativi
6

Terreni arricchiti
 Sono
terreni ricchi di nutrienti studiati appositamente
per le specie microbiche esigenti da un punto di vista
nutritivo, spesso contengono sangue o siero, per
simulare meglio le condizioni riscontrate
nell'organismo che ospita un determinato
microrganismo.
7
 Terreni






selettivi
Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie
batteriche grazie alla presenza di sostanze che inibiscono lo
sviluppo delle altre specie.
alcuni esempi di sostanze inibenti.
CRISTAL VIOLETTO: Inibitore dei Gram+
VERDE BRILLANTE: Inibitore dei Gram+
CETRIMIDE: Sale d’
ammonio attivo sia sui Gram+ che Gram -.
ANTIBIOTICI: in genere utilizzati per inibire la crescita dei batteri
favorendo quella di lieviti e muffe.
8
 Terreni
di arricchimento
 Sono
terreni che consentono di aumentare la carica
della specie batterica che ci interessa isolare, grazie
alla presenza di fattori che rallentano la crescita di
specie batteriche contaminanti presenti nel campione
in esame.
9
 Terreni
generici
 Sono
terreni la cui composizione permette un ampio
spettro di specie batteriche coltivabili.
10
 Terreni
indicativi
 Sono
terreni la cui composizione permette di
evidenziare le qualità fenotipiche dei microrganismi.
11
 Passi
fondamentali per una preparazione di qualità
del terreno di coltura
Preparazione del terreno
Test per il Controllo Qualità
Stoccaggio del terreno
12

Preparazione del terreno:

rif. USP <1117> microbial best laboratory practices

Attenersi scrupolosamente a quanto indicato dal fornitore.



Il quale deve fornire adeguata certificazione circa le istruzioni di
preparazione per i terreni disidratati.
Certificato di analisi per i terreni pronti, comprensivo di data di scadenza, di
istruzioni di conservazione e test di idoneità con i microrganismi utilizzati.
Pesata

La fase di pesatura deve essere accurata, utilizzando una bilancia calibrata e
ben pulita.
13

Preparazione del terreno:

Diluente



l’
acqua distillata è il diluente di elezione per i terreni microbiologici.
Tutte le pesate effettuate e le quantità di diluente utilizzato
devono essere registrate.
Dissoluzione del terreno



Porre attenzione che il terreno non venga a contatto con sostanze inibitorie
che possono essere presenti come residui del lavaggio della vetreria; i
contenitori devono essere accuratamente puliti.
I terreni disidratati devono essere dissolti completamente prima della
distribuzione nel contenitore finale.
Qualora sia necessario riscaldare per dissolvere il terreno, è importante non
eccedere con le temperature.
14
 Preparazione
del terreno:
 Sterilizzazione
 I tempi dell’
eventuale sterilizzazione a vapore, in genere, è indicata
dal fornitore; tipicamente si utilizzano cicli a 121 °C per 15 minuti,
usando un’
autoclave con ciclo convalidato.

Alcuni terreni vengono sterilizzati per filtrazione, mentre altri,
essendo termolabili e non filtrabili, subiscono solo un blando
riscaldamento; la preparazione di questi terreni viene effettuata in
condizioni asettiche sotto cappa a flusso laminare sterile utilizzando
contenitori ed attrezzature sterili.
15
 Stoccaggio

del terreno:
I terreni devono essere etichettati con il numero di lotto, data di
preparazione e di scadenza e l’
identificazione del terreno.

Minimizzare la perdita di umidità e provvedere alla protezione
meccanica
Importante è la fase di conservazione dei terreni prima dell’
uso.

E’necessario garantire la corretta temperatura di conservazione.

16

Stoccaggio del terreno:

Le condizioni di stoccaggio sono quelle definite dal fornitore o
se diverse devono essere convalidate.

Non conservare i terreni solidi a temperature inferiori a 0 °C.

Proteggere il terreno dalla luce e da eccessive temperature.

Gli ambienti di conservazione devono essere monitorati.

Vale per i luoghi di stoccaggio sia dei terreni pronti che dei terreni
disidratati.
17
 Stoccaggio


del terreno:
In caso di guasti alle celle climatiche, il terreno deve essere
spostato in ambiente con le condizioni climatiche più vicine a
quelle prescritte ma prima dell’
uso dovrà essere verificata la
fertilità di ogni terreno interessato dall’
anomalia.
Durante l’
utilizzo, il terreno solido che deve essere fluidificato va
mantenuto in bagnomaria a 45 –50 °C per non più di otto ore .
18

Controlli di qualità - Idoneità:


La capacità di un terreno è strettamente dipendente dalla
preparazione .
Ogni lotto di terreno pronto o preparato deve essere
testato: EP 2.6.12 (4.4) - 2.6.13 (3.3) - USP <1117>.
19


Parametri che inficiano la qualità del terreno:
Il pH è parametro critico (Range secondo istruzioni del fornitore).
 Flaconi conservati non attenendosi alle raccomandazioni.
 Terreno scaduto o surriscaldato.
 Pesata errata.
 Recipiente di preparazione sporco.
 Sterilizzazione non corretta.
 Acqua di cattiva qualità.

20


Verifiche dopo la preparazione:
ispezione visiva dei contenitori al termine della preparazione e
sterilizzazione.
 integrità dei contenitori e dei coperchi.
 riempimento omogeneo dei contenitori.
 eccessivo imbrunimento o variazioni di colore.
 formazione di cristalli.
 eccessivo numero di bolle.

21


contaminazione microbica.
 stato di ossidazione del terreno.
 precipitazione dei componenti.
 corrispondenza numero di lotto e data di scadenza.

22



Ulteriori parametri da controllare dopo la preparazione sono i
seguenti .
STERILITÀ.
 FERTILITÀ (GROWTH PROMOTION).
 PROPRIETÀ INIBITORIE (INIBITORY PROPERTIES).
 INDICAZIONI DI CRESCITA (INDICATIVE PROPERTIES).

23
 Controlli
di qualità - Idoneità:
 Controlli

di STERILITÀ:
effettuare una verifica della sterilità per ogni lotto di terreno preparato.
Tale test viene effettuato incubando una parte del lotto alle
temperature di 30-35°C e 20-25°C.
 Per i terreni non sterilizzati, incubare tutto il lotto alternativamente
alla temperatura di 30-35°C e 20-25°C.

24
 Controlli
di qualità - Idoneità:
 Controlli


di STERILITÀ :
Dopo incubazione il terreno, per essere approvato, deve risultare
sterile; nel caso in cui al termine dei relativi periodi d’
incubazione si
verifichi crescita microbica, le eventuali analisi effettuate con i lotti
non idonei devono essere invalidate.
L’
esecuzione del test ed i relativi risultati devono essere registrati
indicando: data d’
inizio e di fine incubazione, temperatura
d’
incubazione, esito e sigla analista che ha emesso il giudizio sulla
sterilità.
25

 Controlli


di FERTILITÀ :
La prova consiste nel determinare le capacità nutritive dei terreni di
coltura.
I terreni agarizzati contenuti nei flaconi vengono dapprima sciolti e
piastrati in numero sufficiente per le prove.
26


Controlli di FERTILITÀ :
L’
inoculo del microrganismo appropriato non deve essere maggiore di
100 CFU.
 I terreni generici (TSA ecc.) inoculati con ceppi batterici sono incubati a
30-35°C per non più di tre giorni.
 I terreni generici inoculati con ceppi fungini sono incubati a 20-25° o
30-35°C a seconda del terreno utilizzato per non più di cinque giorni.
 I terreni specifici sottoposti al test di fertilità, vanno incubati alle
relative temperature di utilizzo nei test microbici per il tempo più breve
indicato .

27

 Controlli
 Sui
di FERTILITÀ - Esiti:
terreni solidi di conta:
La crescita ottenuta non deve differire di un fattore maggiore
di 2 (il doppio o la metà) rispetto al valore calcolato di un
inoculo standardizzato.
 La crescita del microrganismo test sia comparabile con
quanto ottenuto con un lotto precedentemente testato ed
approvato.

28

 Controlli
 Sui
di FERTILITÀ - Esiti:
terreni liquidi:
avvenga lo sviluppo del microrganismo inoculato e sia
comparabile con quanto ottenuto con un lotto
precedentemente testato ed approvato.
 (Non
prescritto ma consigliato) Verificare, mediante
subculture su terreno selettivo, che l’
aspetto delle colonie
sviluppatesi sia corrispondente al microrganismo test
utilizzato.

29

 Controlli
CASEYN SOYA
AGAR
di FERTILITÀ :
Aspergillus niger ATCC 16404
Candida albicans ATCC 10231
Bacillus subtilis ATCC 6633
Ps. aeruginosa ATCC 9027
St. aureus ATCC 6538
| Funghi 5gg
30- 35°C x |
| Batteri 3 gg
30

 Controlli
CASEYN SOYA
BROTH
di FERTILITÀ :
St. aureus ATCC 6538
Ps. aeruginosa ATCC 9027
Bacillus subtilis ATCC 6633
30- 35°C 3 gg
--------- non prescritti ----------
Salmonella enteritidis NCTC 6017
Escherichia coli ATCC 8739
SABOURAUD
DEXTROSE AGAR
Aspergillus niger ATCC 16404
Candida albicans ATCC 10231
18 h ?
20- 25°C 5 gg
31


PROPRIETA’INIBITORIE (INIBITORY PROPERTIES ):
La prova consiste nel determinare le capacità inibitorie dei terreni
di coltura.
 Inoculare almeno 100 CFU del microrganismo appropriato.
 I terreni specifici sottoposti al test di inibizione, vanno incubati alle
relative temperature di utilizzo nei test microbici per il tempo più
lungo indicato.


Esito:

Nessuna crescita nel test di inibizione.
32



INDICAZIONI DI CRESCITA (INDICATIVE PROPERTIES):
 La prova consiste nel verificare la capacità dei terreni specifici di coltura
di evidenziare i microrganismi tramite l’
aspetto della colonia e le reazioni
biochimiche previste.
 Inoculare non più di 100 CFU del microrganismo appropriato.
 I terreni specifici sottoposti al test delle proprietà, vanno incubati alle
relative temperature di utilizzo nei test microbici per un tempo compreso
tra quello indicato.
Esito:
 l’
aspetto sia comparabile con quanto ottenuto con un lotto
precedentemente testato ed approvato ovvero comparabile a quanto
descritto nelle Farmacopee Ufficiali o, in mancanza, nei manuali dei
fornitori di terreni.
33


INDICAZIONI DI CRESCITA (INDICATIVE PROPERTIES):
Terreno
Microrganismo test
Aspetto delle colonie
VRB glucose agar
E. Coli ATCC 8739
VRB glucose agar
P. Aeruginosa ATCC 9027
MacConkey agar
E. Coli ATCC 8739
Colonie dal rosa al rosso circondate da zona di
precipitazione rossastra (bile precipitato)
X.L.D. agar
Salmonella enterica NCTC 6017
Colonie rosato/rosse con o senza centro nero
X.L.D. agar
E. Coli ATCC 8739
Mannitol salt agar
S. Aureus ATCC 6538
Colonie gialle circondate da alone giallo
Cetrimide Agar
P. Aeruginosa ATCC 9027
Colonie trasparenti da incolori a verde
fluorescente con intenso aroma fruttato
SAB dextrose agar
C. Albicans ATCC 10231
Colonie rosse o rossastre circondate da zona
di precipitazione rossastra/rosso intensa
Colonie chiare
Inibizione/leggera crescita di colonie gialle
Colonie bianche cremose
34

 Controlli
microrganismi specifici:
Medium
E.E.B.- Mossel
Property
Incubation
temperature
Test strains
Growth
promoting
30÷35 x 24 h
E. coli ATCC 8739
P. aeruginosa ATCC 9027
Inhibitory
30÷35 x 48 h
S. aureus ATCC6538
Growth
promoting
30÷35 x 18 h
Indicative
30÷35 x 18-48 h
Test for bile-tolerant
gram-negative bacteria
VRB glucose agar
E. coli ATCC8739
P. aeruginosa ATCC9027
35

 Controlli
microrganismi specifici :
Medium
Property
Incubation
temperature
Test strains
Growth
promoting
42÷44 x 24 h
E. coli ATCC8739
Inhibitory
42÷44 x 48 h
S. aureus ATCC6538
Growth
promoting
30÷35 x 18 h
MacConkey broth
Test for Escherichia coli
E. coli ATCC8739
MacConkey agar
indicative
30÷35 x 18-72 h
36

 Controlli
Medium
Rappaport
Vassiliadis
Salmonella
enrichment broth
Test for Salmonella
X.L.D. agar
Property
Incubation
temperature
Test strains
Growth
promoting
30÷35 x 18 h
Salmonella enterica
NCTC 6017
Inhibitory
30÷35 x 24 h
S. aureus ATCC6538
Growth
promoting
30÷35 x 18 h
indicative
30÷35 x 18-48 h
Indicative *
30÷35 x 18-48 h
Salmonella enterica
NCTC 6017
E. coli ATCC8739
37

 Controlli
Medium
Test for Pseudomonas
aeruginosa
Test for Staphylococcus
aureus
Incubation
temperature
Test strains
Growth
promoting
30÷35 x 18 h
P. aeruginosa ATCC 9027
Inhibitory
30÷35 x 72 h
E. coli ATCC8739
Growth
promoting
30÷35 x 18 h
indicative
30÷35 x 18-72 h
Inhibitory
30÷35 x 72 h
Property
Cetrimide agar
Mannitol Salt agar
S. aureus ATCC 6538
E. coli ATCC 8739
38

 Controlli
Property
Incubation
temperature
Reinforced medium
for clostridia
Growth promoting
30÷35 x 48 h
Columbia agar
Growth promoting
30÷35 x 48 h
SAB dextrose broth
Growth promoting
30÷35 x 3 d
Growth promoting
30÷35 x 24 h
Medium
Test strains
Cl. sporogenes ATCC19404
Test for clostridia
Test for Candida albicans
SAB dextrose agar
Cl. sporogenes ATCC19404
C. albicans ATCC10231
C. albicans ATCC10231
Indicative
30÷35 x 24-48 h
39

Controlli di qualità - Dubbi e suggerimenti :





Verificare la fertilità del TSB con Coli e Salmonella…
* Eliminazione del test indicativo del XLD con E. coli… Ufficiale da luglio 2009
Modalità di confronto: non obbliga al confronto parallelo, è ammessa la verifica su
carta se chiaramente descritta (e.d.q.m.).
…comparable to that previously obtained with a previously tested and approved
batch of medium occurs.
Growth promotion per microrganismi specifici è un test qualitativo e non
quantitativo; il fattore 2 non è richiesto ma può essere usato per la comparazione
insieme, ad esempio, alla dimensione delle colonie al tempo più breve di
incubazione prescritto (e.d.q.m.).
…
40
41

Terreni colturali e controllo di idoneità

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