P-type ATPases from yeast to man - ETH E

Diss. ETH No. 11254
P-type
ATPases from
yeast
to
man
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the
degree
of
Doctor of Natural Sciences
presented by
FAUSTO EROS VELLANI
dipl.
Natw. ETH
born 6th November 1966
in Bellinzona
Accepted
on
(TI)
the recommendation of
Prof. E. Carafoli, examiner
Prof. P. Dimroth, co-examiner
Dr. D.
Guerini, co-examiner
Zurich 1995
Summary
VI
SUMMARY
Ca2+ is essential for life. In
directly
indirectly by Ca2+.
or
modulated
the presence
by
Ca2+ is also know
In
the
first
purification
the yeast
are
living organisms
a
this
of
novel
integral
the Pj. The
energy
to
the
envelope
P-type
high
of this novel
by
all the
to the
cytosol
P-type
perform
its
releasing
ATPases is to
intermediate between the enzyme and
P-type
ATPase found in the yeast nuclei
phosphorylated
intermediate and the
activity.
different aspects of the
already
(PMCA). In order to carry
cytosolic Ca2+ concentration
well known
out its role
has to be
compared
as
a
to the extracellular concentration
extracellular
concentration
stimulus
increases
to 100
(up
cells possess
intracellular messenger, the
(mM),
mechanisms
or
to return to the
ATPase situated in the
responsible
for
pumping
plasma
out
The 21 amino acids stretch
studied. This sequence if
reticulum and
chimeric
degrade
the
resting
(nM),
state cells. An
cytosolic Ca2 +
-
distinct Ca2+-channels.
high Ca2+-
this
prepared
to
answer
state. The PMCA is
a
to
P-type
membrane of almost every cells and it is
Ca2+ from the cell.
Glul067-Argl087 present
exposed
a
resting
that decrease
concentration after each stimulus in order to be
another stimulus
in
times), through opening
special
The intracellular
very low concentration
rapidly
very
study
membrane Ca2+ ATPase
plasma
precisely regulated.
concentration has to be maintained at
has the
ability
in the PMCA4CI
to retain in the
proteins containing
this
sequence
or
for the PMCA4CI and that it
can
not
reason
similar sequences
a
were
endoplasmic
truncated form of the pump. For this
constructed. The results indicated that this acidic stretch is
signal
of
ATPases
The second and third part of the thesis have been dedicated to
The
is
role
Ca2+. In fact, submicromolar concentrations of Ca2+
inhibit both the formation of the
ATPase
in the nuclear
energy bond of ATP and
characteristic shared
phosphorylated
peculiarity
sensitivity
present
that transport ions from the
proteins
general
is its
regulated
activity
particular
luminal spaces. The energy necessary to
by hydrolyzing
high
whose
cerevisiae has been described. The
membrane
or
ATPase
ADP and P;. The
an
proteins
thesis, the characterization and the partial
work is obtained
form
many
the absence of Ca2+. For this
P-ttype
Saccharomyces
extracellular space
are
intracellular messenger.
as
part
of
or
There
are
many processes
very
were
specific
be substituted with other
Summary
vii
sequences rich in acidic amino acids. In addition this sequence is not
universal
signal,
in fact it works
only
that this stretch interacts with other
particular
three dimensional
parts
an
likely
in the PMCA. In conclusion it is
of the molecule in order to form
a
signal.
The third and last part of the thesis aimed at the identification of the amino
acids
Ca2+-transport
for the
responsible
words,
and that release it after the
milieu. This
acids
channel of the PMCA. In other
the amino acids that bind Ca2+ at the
was
present
The mutants
done
by
protein
cytosolic
site-directed mutations of
in the middle of the transmembrane
tested for their
were
transport Ca2+ and
to form
side of the membrane
moved forward Ca2+ to the extracellulare
phenotype
with
phosphorylated
some
particular
of the
regions
respect
to their
amino
protein.
ability
to
intermediate from both ATP
and Pi.
It has been found that mutations of the amino acids
Asn879, Asp883
and Gln971 lead to the
transport Ca2+ and
other hand
the
to
all
form the
the
phosphoenzyme starting
Pro422 and Pro426
the
Ca2+-binding
involved in the
they
maintained
phosphate.
proposed
to be
In
ability
of to
intermediate from ATP. On
the
ability
to
build
the
conclusion, the amino acids
responsible
for the correct
site and the sites Glu423, Asn879,
binding
should be further
were
were
complete
phosphorylated
mutants
from
Pro422, Glu423, Pro426,
loss of the
Asp883
folding
and Gln971
of
are
of Ca2+. However, the Asn879 and Gln971 mutants
investigated since,
in the contrast to the other mutants,
shown to be retained in the ER.
Riassunto
vui
RIASSUNTO
II Ca2+
processi
molte
un
e
elemento essenziale per la vita.
direttamente
regolati
sono
la cui attivita
proteine
Ca2+. Per questo
modulata dalla presenza
e
particolare
suo
Negli organismi
viventi molti
indirettamente da questo ione. Esitono
o
ruolo il Ca2+
e
dall'assenza del
o
anche conosciuto
come
messaggero intracellulare.
Nella
prima parte
di
purificazione parziale
di
delle
citosolo
intermedio fosforilato ad alta
tipo
o
fosfato
e
condivisa da tutte le ATPasi di
di
di
luminali.
energia.
P trovata nei nuclei del
La
legame
sua
dal
per
ad alta energia
La caratteristica
peculiarity
lievito 6 la
tipo
ioni
necessaria
la formazione di
e
la
e
presente nella
trasportano
L'energia
inorganico.
tipo P,
P
tipo
cerevisiae. Le ATPasi di
& ottenuta idrolizzando il
rilasciando ADP
e
la caratterizzazione
di membrana che
extracellulari
svolgere questo compito
dell'ATP
Saccharomyces
proteine integrali
agli spazi
ATPasi
nuova
una
membrana nucleare del lievito
P sono
6 descritta
questa tesi,
di questa
estrema
un
generate
prodotto
nuova
ATPasi
sensibilia alia
concentrazione di Ca2+. In effetti concentrazioni submicromolari di Ca2+
inibiscono
sia
la
formazione
del
intermedio
fosforilato
l'attivita
sia
ATPasica.
La seconda
e
terza
parte
aspetti della gia ben
(PMCA).
Per poter
confrontato
provocano
Ca2+
(fino
svolgere
La
quiescente deve
un
preparando
una
del
praticamente
Questa
regolata
essere
intracellulare
in
(mM).
Stimoli
cellula
una
livello molto basso
un
molto
(nM)
se
extracellulari
molto rapido della concentrazione citosolica del
volte) aprendo dei canali specifici per il Ca2+. Le cellule
meccanismi che diminuiscono l'alta concentrazione del
lo stimolo,
dopo
di
P
tipo
tutte le
riportandola
risposta
localizzata
cellule ed
21 amino acidi
sequenza,
endoplasmatico,
e
se
nella
alia concentrazione iniziale
e
stimolo. La PMCA
e
un
nuovo
membrana
per il
parte del lavoro,
citoplasmatica
pompaggio
e
una
ha
l'abilita
di
di
del Ca2+
stato analizzato il
(Glul067-Argl087) presente
esposta
degradare
ad
responsabile
e
fuori dalla cellula. Nella seconda
segmento di
ad
citoplasmatica
messaggero intracellulare, la
deve
extracellulare
cosi la cellula alia
ATPasi
come
calcio
mantenuta
quello
possiedono speciali
Ca2+ formatasi
ruolo
suo
aumento
100
a
il
concentrazione
sua
essere
con
tesi sono dedicate alio studio di differenti
questa
conosciuta calcio ATPasi della membrana
citosolica
concentrazione
accuratamente.
di
nella PMCA4CI.
ritenere,
nel
reticolo
forma troncata della
pompa. Per
questa
Riassunto
IX
ragione
sono
state costruite delle chimere contenenti
simili. I risultati indicano che
per la PMCA
segnale specifico
altre
acidiche.
sequenze
sequenza in
questo segmento
questione
compito solamente
il
e
suo
Ulteriori
6
non
una
compito
molecola formando
essere
hanno
sequenza universale,
nella PMCA.
particolari
puo'
non
esperimenti
In conclusione si
questo segmento debba
verosimilmente
questa sequenza
altre
o
di amino acidi acidici 6
interagire
indicato
il
la
suo
affermare che
puo'
con
che
svolge
ma
un
svolto da
altre
strutture tri-dimensionali che
parti
della
agiscono
come
segnale.
La terza ed ultima
degli
amino acidi
parole gli
amino
membrana
a
stato
parte
di
responsabili
per il
acidi che
legano
raggiunto
di
scopo l'identificazione
come
trasporto del Ca2+ nella PMCA. In altre
il Ca2+
nella
parte citosolica della
che lo rilasciano nell'ambiente extracellulare. Questo scopo
mutando
transmembranarie della
capacita
tesi ha avuto
questa
trasportare
particolari
proteina.
Ca2+
e
amino acidi
I mutanti
presenti
al centro di
stati
sono
e
regioni
testati nella loro
di formare l'intermedio fosforilato sia dall'ATP
che dal fosfato.
£
stato trovato che la mutazione
Asn879, Asp883
trasporto
di Ca2+
o
e
Gln971
causano
Ca2+
nel
e
sono
che
legame
responsabili
gli
di
puo'
investigare
prendere
affermare che
gli
"folding"
riguarda
dell'abilitS di
le
del sito di
e
Gln971
proteine
quanto
altri mutanti, nel reticolo
partendo
amino acidi Pro422
in considerazione ulteriori
la loro conformazione, in
dagli
Glu423, Pro426,
perdita completa
Glu423, Asn879, Asp883
del Ca2+. Per quanto
diversamente
una
per il corretto
amino acidi
Gln971 si devono
amino acidi Pro422,
della formazione dell'intermedio fosforilato
dall'ATP. In conclusione si
Pro426
degli
legame
sono
coinvolti
mutate in Asn879
esperimenti
esse
e
per il
in
e
grado
vengono ritenute,
endoplasmatico.
Zusammenfassung
x
ZUSAMMENFASSUNG
Ca2+
ist
essentielles Element des Lebens
ein
Organismen
sind
Viele
lebender
Prozesse
direkt oder indirekt durch dieses Ion
reguliert
Aktivitat vieler Proteme wird durch die An- oder Abwesenheit
Aufgrund
moduhert
mtrazellularer
Der
"Messenger'
Teil
erste
Energie
ATP
stammt
der
P-typ
zeichnet
von
wurde,
Ca2+
Ca2+
einen
und
zweite
verschiedener
der
Aspekte
Plasmamembran
Zellen
(nM)
lhre
die
dieser
extreme
submikromolare
zeigen
Arbeit
sind
Ca2+
Damit
gewidmet
Ein
braucht
kann,
extrazellularer
Bildung
des
dem
Studium
Die
es
der
als
prazise
eine
Ca2+ sehr tief
des
provoziert, durch die
Reiz
Zellen
Rolle
seine
Im Ruhezustand der
starke Zunahme
eine
Ca2+-konzentration
im
und die ATPase Aktivitat
Teil
Offnung Ca2+-spezifische Kanale,
zytosolischen
durch
des
kovalentes
P-typ ATPase,
intrazellulare Ca2+-Konzentration
werden
ein
der schon gut charaktensierten Ca2+-ATPase
(PMCA)
die
muss
gehalten
sich
Tat
sie
in
benotige
dazu
hemmenden Effekt auf die
Messenger
der
die
Zytosol
vom
Die
neue
spielen
zytosolischen Ca2+-Konzentration
mtrazellularer
Reguherung
dntte
Diese
der
In
aus
phosphoryherten Zwischenproduktes
Der
und
der Kernmembran
die Ionen
ATPasen ist, dass
Hefekern
Konzentrationen
als
hochenergetischen Bindung
der
bilden
fur
in
transportieren
phosphorylierte Zwischenprodukt
gefunden
Ca2+
auch
lokahsiert ist
Hydrolyse
Generelles Merkmal aller
Empfindhchkeit
welche
P-typ ATPase,
cerevisiae
Luminalraume
von
von
Ca2+
ist
Charaktensierung
mtegrale Membranproteine,
oder
extrazellulare
Rolle
bekannt
einer neuen
Saccharomyces
ATPasen sind
P-Typ
besonderen
dieser Thesis beschreibt die
partielle Reimgung
der Hefe
dieser
Die
(bis
zu
verfugen
100
uber
mal) der
spezielle
Mechamsmen, welche die erhohte Ca2+-konzentration reduzieren und auf
die
anfangliche
weitere Stimuli
Konzentration
zuruckbrmgen
zu
antworten
Die PMCA ist
zytoplasmatischen
Membran
praktisch aller
und deren
dann bestehet Ca2+
Im
Aufgabe
zweiten
Teil
(Glul067-Argl087)
Pumpe wird
Retikulum
der
Arbeit
wird
der PMCA4CI
durch die
Exposition
zuruckgehalten
und
aus
ein
P-typ ATPase,
Zellen
der Zelle
Eine
Sequenz
degradiert
die
nachgewiesen
zu
Segment
analysiert
dieser
Dies erlaubt der Zelle auf
eine
in
der
wurde
pumpen
von
21
Aminosauren
C-terminal verkurtze
im
endoplasmatischen
Deshalb wurden chimensche
Proteinen konstruiert, die diese oder ahnhche
Sequenzen
enthalten
Die
xi
Resultate
dass dieses
zeigten,
PMCA
spezifisches Signal ist,
sauren
Sequenzen
dass diese
Zusammenfassung
Segment
reich
und dass seine
Aminosauren ein
sauren
an
Aufgaben
von
anderen
ubernommen werden kann. Weitere Versuche
zeigten,
kein universales
Sequenz
Segment moglicherweise
ist, sondern ihre
Signal
den PMCA ausfiihrt. Man konnte die
nicht
Schlussfolgerung
mit anderen Teilen der
Aufgabe
nur
in
ziehen, dass dieses
Pumpe interagiert,
dadurch eine besondere dreidimensionale Struktur aufbaut, die als
und
Signal
erkannt wird.
Der dritte und letzte Teil dieser Thesis identifiziert die Aminosauren der
PMCA, welche verantwortlich sind fur die Bildung des Kanals des Ca2+-
Transportes,
der
in anderen Worten
zytosolischen
freilassen.
Diese
wurde durch die
erzielt, welche sich
befinden. Die
diejenigen Aminosaure,
Membranseite binden und im
Fahigkeit
Man hat
besondere Aminosauren
Mutierung
in der Mitte der transmembranen Domanen des Proteins
dieser Mutanten Ca2+
phosphoryliertes Zwischenprodukt
getestet.
welche Ca2+ auf
extrazellularen Raum
gefunden,
von
zu
ATP und
transportieren
von
Pi
zu
und ein
bilden wurde
dass Mutationen der Aminosauren Pro422,
Glu423, Pro426, Asn879, Asp883 oder Gln971 einen kompletten Verlust der
Fahigkeit
Ca2+
zu
Zwischenprodukt (von
und
transportieren
ATP
ausgehend)
zu
ein
phosphoryliertes
bilden verursachten. Man kann
daraus schliessen, dass die Aminosauren Pro422 und Pro426 verantwortlich
fur das
richtige faltung
der
Asn879, Asp883 und Gln971
den
Aminosauren
endoplasmatischen
Versuche
Bindungstelle
an
der
Asn879
Retikulum
durchgefiihrt werden,
analysieren.
des Ca2+ sind und dass Glu423,
Bindung
und
des Ca2+
Gln971
beteiligt
mutierten
zuruckgehalten werden,
um
sind. Da die in
Proteine
im
sollten weitere
die Konformation dieser Proteine
zu