Preparazione dei campioni

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
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Come valutare la preparazione di un vetrino (con campioni di sangue periferico o midollo) prima di
proseguire con la FISH?
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Dopo la FISH, ho dei segnali deboli e una sorta di "velo" che copre il vetrino. Come posso rimediare?
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Perché il counterstain è troppo debole?
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Perché la morfologia cellulare del mio campione è distorta?
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Quanto tempo posso conservare i miei vetrini bianchi per poterli ancora ibridare in modo efficace?
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Dopo l'ibridazione, quanto tempo posso conservare le mie diapositive e ancora vedere fluorescenza?
Come valutare la preparazione di un vetrino (con campioni di sangue periferico o midollo) prima di proseguire
con la FISH?
Valutare i vetrini sotto un microscopio a contrasto di fase. In una buona preparazione: i cromosomi ed i nuclei
dovrebbero essere grigio opaco non rifrangenti e con citoplasma minimo. In una cattiva preparazione: Le cellule
saranno " traslucide e brillanti", apparendo biancastre con un alone attorno ai nuclei. Possibile causa: il
campione sui vetrini potrebbe essersi asciugato troppo in fretta durante la preparazione. Soluzione: - Aumentare
l'umidità attorno al vetrino nella fase del "drop" ponendolo su un rack su un bagnetto termostatico a 65 ° C per
20 minuti. - Non porre i vetrini in stufa,ciò potrebbe influenzare negativamente i risultati dell' ibridazione. Asciugare i vetrini a temperatura ambiente per una notte. I migliori risultati si ottengono quando i vetrini
vengono invecchiati o.n. a temperatura ambiente. - I vetrini preparati e utilizzati nello stesso giorno non danno
risultati ottimali, tuttavia forniremo di seguito gli steps per una preparazione over day(da utilizzare in caso di
emergenza): asciugare il vetrino su una piastra termica a 45°C per 30 minuti, poi disidratare il vetrino attraverso
scala alcolica ascendente in soluzioni di etanolo (70% 85% e 100%) per un minuto ciascuno.
Dopo la FISH, ho dei segnali deboli e una sorta di "velo" che copre il vetrino. Come posso rimediare?
Solitamente la causa è un campione troppo ricco di cellule. Il "velo" che ricopre il vetrino è dovuto al citoplasma
delle cellule del campione. Per risolvere il propblema, provare a lavare il pellet cellulare con fissativo fresco,
diluire il campione e droppare su un nuovo vetrino. Alcuni tipi di campioni (touch preps, strisci di midollo osseo o
di sangue, campioni inclusi in paraffina) possono essere più inclini a questo tipo di problema. Queste tipologie di
campioni possono richiedere trattamenti aggiuntivi:
Per ulteriori informazioni tecniche e commerciali potete contattare:
Servizio Clienti
S.r.l.
Via Cadore, 14 - 00045 GENZANO di Roma RM – Italy Tel.: (+39) 06 93955058 - Fax: (+39) 06 93955059
E-mail: [email protected] Per invio ordini: [email protected] PEC-mail: [email protected]
Sito WEB: www.resnovaweb.com
a) Per gli strisci - Lavaggio di 30 secondi in acido acetico 70% ed asciugatura ad aria. Una volta che i campioni si
saranno asciugati, proseguire con un lavaggio di 30 secondi in metanolo assoluto.
b) Per campioni inclusi in paraffina: aumentare il tempo di digestione delle proteine (aumentando il tempo di
azione della soluzione di pepsina).
Perché il counterstain è troppo debole?
I vetrini potrebbero non essere stati asciugati correttamente prima della giustapposizione del DAPI. Assicurarsi di
invecchiare per 24 ore il vetrino dopo il drop delle cellule. Provare a disidratare i campioni attraverso una serie di
lavaggi in etanolo per poi ricolorare con il DAPI. Ci sono due concentrazioni di colorante di contrasto DAPI
disponibili fornite dalla Kreatech. DAPI (0,1 mg / ml) da utilizzare con campioni citologici ed il DAPI (1 mg / ml) da
utilizzare su campioni di tessuto.
Perché la morfologia cellulare del mio campione è distorta?
Diversi tipi di tessuto o di campione possono richiedere diversi tempi di denaturazione. Se il tempo di
denaturazione è troppo lungo per la tipologia del campione, le cellule appariranno distorte.
Quanto tempo posso conservare i miei vetrini bianchi per poterli ancora ibridare in modo efficace?
Se i vetrini sono conservati a -20 C sotto azoto, dovrebbero essere utilizzabili per almeno sei mesi.
Dopo l'ibridazione, quanto tempo posso conservare le mie diapositive e ancora vedere fluorescenza?
Se i vetrini vengono conservati a -20 ° C e non esposti troppo frequentemente alla luce UV ad alta intensità della
lampada al mercurio, allora potranno durare parecchi mesi.II segnali sbiadiscono nel tempo e con l'esposizione
alla luce.
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