Dako GenPointTM Tyramide Signal Amplification System

Dako
TM
GenPoint
Tyramide Signal Amplification System
for Biotinylated Probes
Codice K0620 10 ml
Licenza per uso
limitato
Questo sistema incorpora la tecnologia sviluppata e concessa in licenza da PERKIN ELMER/NEN LIFE
SCIENCE PRODUCTS, INC., (Brevetto U.S.A. n. 5,196,306).
Questo prodotto viene distribuito e venduto all'Utente Finale conformemente alla licenza concessa da PERKIN
ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. e può essere usato dall'Utente Finale esclusivamente su
strumenti Dako per l'elaborazione manuale o automatica di vetrini o altri supporti per microscopia
(ad eccezione di micromatrici e biochip) contenenti campioni di cellule o tessuti destinati all'esame al
microscopio (compresi l'acquisizione automatica delle immagini e i sistemi di analisi) ai fini della rivelazione
degli acidi nucleici o delle proteine bersaglio. L'acquisto non prevede né attribuisce il diritto di rivendere o
trasferire il presente prodotto, né come prodotto autonomo, né come componente di un altro prodotto. È
severamente vietato qualunque impiego di questo prodotto diverso da quello previsto nella licenza d'uso,
senza espressa autorizzazione scritta di PERKIN ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC.
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
Le istruzioni fornite si riferiscono al sistema GenPoint™ Tyramide Signal Amplification System for
Biotynilated Probes.
GenPoint (codice K0620) è un sistema di amplificazione del segnale altamente sensibile, che viene impiegato
per la rivelazione delle sonde biotinilate nelle preparazioni tissutali e cellulari. Il sistema è compatibile con tutti i
tipi di sonde biotinilate e può essere usato per amplificare il segnale di ibridazione del DNA o dell'RNA. I
campioni biologici e le sonde biotinilate devono essere reperiti dall'utente.
Procedura di GenPoint
1. Ibridazione della sonda biotinilata.
2. Applicazione del coniugato primario streptavidina-HRP.
3. Applicazione del substrato di tiramide (reagente di amplificazione).
4. Applicazione del coniugato secondario streptavidina-HRP.
5. Conversione DAB.
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Cenni introduttivi
Le metodiche di ibridazione in situ (ISH) utilizzano sonde marcate per localizzare, a livello subcellulare,
sequenze specifiche di acidi nucleici. La biotina è usata comunemente per marcare le sonde per la rilevazione
non radioattiva.1-6 La biotina può essere visualizzata mediante un certo numero di sistemi che utilizzano
l’avidina o la streptavidina, entrambe caratterizzate da un'elevata affinità di legame per la biotina.7 I sistemi
standard di rilevazione della biotina utilizzano complessi enzimatici di streptavidina per produrre segnali di
colorazione di precipitazione provenienti da substrati enzimatici cromogenici. Il sistema GenPoint crea un livello
aggiuntivo di amplificazione della rilevazione di biotina. Dopo un legame iniziale della streptavidina-perossidasi
con la sonda biotinilata, la perossidasi catalizza l’ossidazione della tiramide biotinilata,8 che forma
immediatamente legami covalenti con i gruppi aromatici del campione. Questa reazione deposita grandi
quantità di biotina nel sito di ibridazione. La biotina aggiuntiva viene poi usata per catturare più streptavidinaperossidasi. Questo ciclo di amplificazione streptavidina-perossidasi > tiramide biotinilata > streptavidinaperossidasi può essere ripetuto per incrementare ulteriormente l’accrescimento della biotina. Questo segnale
viene, alla fine, sviluppato aggiungendo l’indicatore cromogenico diaminobenzidina (DAB), che viene ossidato
dagli enzimi perossidasi fino alla produzione di un precipitato di colore marrone scuro nel sito di ibridazione.
Reagenti forniti
I componenti del kit sono sufficienti per analizzare 65 vetrini con un singolo ciclo di amplificazione.
Materiali necessari
ma non forniti
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Quantità
30 ml
Descrizione
Lavaggio stringente concentrato
0,2 ml
Concentrato primario streptavidina-HRP
15 ml
Diluente primario streptavidina-HRP
10 ml
Soluzione tiramide biotinilata
10 ml
Streptavidina-HRP secondario
0,2 ml
Cromogeno DAB concentrato
10 ml
Tampone substrato DAB
Sonde biotinilate
Hybridizer (S2450 o S2451, 110 V o 220 V)
Target Retrieval Solution (codici S1699 o S1700)
Proteinase K (codice S3004 o S3020) o Pepsin (codice S3002)
TBST (Tris-Buffered Saline/Tween-20, codice S3306) è il tampone di lavaggio consigliato per la colorazione
automatica o manuale
0,3% di H202 in metanolo
Soluzioni alcoliche (95% e 100%)
Acqua deionizzata o distillata
Mezzo di montaggio, ad esempio Faramount (codice S3025) o Glycergel® (codice C0563)
Xylene o Histoclear
Colorante di contrasto (opzionale); si consiglia l'uso di Hematoxylin (codice S3302)
Rack per colorazione o vaschette Coplin
Vetrini per microscopio silanizzati o altrimenti trattati per l’adesività; presso Dako sono disponibili Silanized
Slides idonei per ISH (codice S3003)
Piastra di riscaldamento o forno
Incubatore
Forno
Bagnomaria
Vetrini coprioggetto per ibridazione (18 x 18 mm)
Vetrini coprioggetto per montaggio
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Carta assorbente
Guanti
Camera umida per l’incubazione dei vetrini
Microscopio ottico standard
Precauzioni
1. Per utenti professionisti.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura.
Sebbene non sia classificato come prodotto a rischio, il contenuto di NaN3 alle concentrazioni indicate può
reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo
smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l’eventuale accumulo di azide.11,12
3. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti, altrimenti potrebbe verificarsi un incremento della
colorazione aspecifica.
4. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
5. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, così da evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
6. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
7. Per gli utenti professionisti, è disponibile su richiesta una scheda dei dati di sicurezza.
Pericolo
Stringent Wash Concentrate: 1-5% Polyoxyethylene octyl phenyl ether; 1-5% Cloruro di sodio
H318
Provoca gravi lesioni oculari.
P280
Proteggere gli occhi/il viso.
P264
Lavare accuratamente le mani dopo l'uso.
P305 + P351 +
IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi
P338 + P310
minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare.
Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI o un medico.
Attenzione
Primary Streptavidin-HRP Diluent: 10-30% Glycerol
H320
Provoca irritazione oculare.
P280
Proteggere gli occhi/il viso.
P264
Lavare accuratamente le mani dopo l'uso.
P305 + P351 +
IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi
P338
minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a
sciacquare.
P337 + P313
Se l’irritazione degli occhi persiste, consultare un medico.
Attenzione
Biotinyl Tyramide:10-30% Glycerol
H320
Provoca irritazione oculare.
P280
Proteggere gli occhi/il viso.
P264
Lavare accuratamente le mani dopo l'uso.
P305 + P351 +
IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi
P338
minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a
sciacquare.
P337 + P313
Se l’irritazione degli occhi persiste, consultare un medico.
Conservazione
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Pericolo
DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride
H350
Può provocare il cancro.
H341
Sospettato di provocare alterazioni genetiche.
P201
Procurarsi istruzioni specifiche prima dell’uso.
P202
Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze.
P281
Utilizzare il dispositivo di protezione individuale richiesto.
P308 + P313
IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Richiedere assistenza medica.
P405
Conservare sotto chiave.
P501
Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali,
nazionali e internazionali.
I reagenti del sistema GenPoint devono essere conservati al buio a 2–8 °C. Non congelare.
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Preparazione dei
reagenti
Soluzione salina tamponata Tris/Tween (TBST)
Diluire il concentrato TBST (codice S3306) con rapporto 1:10 in acqua deionizzata o distillata. La soluzione
diluita è stabile per un mese a 2–8 °C. Eliminare i l tampone se intorbidisce.
Soluzione di lavaggio stringente
Diluire il lavaggio stringente concentrato con rapporto 1:50 in acqua deionizzata o distillata e riscaldare a
bagnomaria fino alla temperatura appropriata. Eliminare l'eventuale soluzione diluita inutilizzata.
Soluzione primaria streptavidina-HRP
Diluire il concentrato primario streptavidina-HRP con rapporto 1:100 nel diluente primario streptavidina-HRP
fornito nel kit 30 minuti prima dell’uso. Eliminare l'eventuale soluzione diluita inutilizzata.
Cromogeno DAB
Diluire il cromogeno DAB concentrato con rapporto 1:50 nel tampone substrato DAB fornito nel kit. La soluzione
diluita del tampone substrato resta stabile a temperatura ambiente per un giorno o al massimo cinque giorni se
conservata a 2–8 °C.
Procedura
Procedura ISH
Rimozione della paraffina
Rimuovere la paraffina da tutti i campioni biologici in modo da privare questi ultimi del mezzo di inclusione,
quindi reidratarli prima dell’ibridazione in situ e della colorazione. Evitare la rimozione parziale della paraffina,
poiché i residui potrebbero provocare un aumento della colorazione aspecifica. La rimozione della paraffina può
essere eseguita riscaldando dapprima le sezioni tissutali in un forno a 60 °C per 30 minuti per ammorb idire la
paraffina, quindi sottoponendo i vetrini a immersioni sequenziali di xilene o di Histoclear della durata di cinque
minuti ciascuna. I residui di xilene o Histoclear possono essere a loro volta rimossi sottoponendo i vetrini a due
immersioni sequenziali di alcol al 100%, seguite da tre immersioni di alcol al 95%, della durata di un minuto
ciascuna. I vetrini devono essere successivamente reidratati con diverse immersioni in acqua.
Pretrattamento del campione
I campioni cellulari e tissutali preparati con fissativi a legami crociati, come la formalina, devono essere
sottoposti a pretrattamento per poter consentire alla sonda di ibridazione di accedere alle sequenze degli acidi
nucleici bersaglio.
Il pretrattamento dei campioni può essere eseguito applicando uno dei seguenti metodi:
1. Pretrattamento con Target Retrieval Solution: immergere i vetrini in Target Retrieval Solution preriscaldata
(codice S1700) per 20–40 minuti a 97 °C (±2 °C), fa cendo seguire il raffreddamento nella soluzione per
20 minuti. Sciacquare i vetrini diverse volte con acqua distillata per rimuovere i residui della soluzione per il
recupero del bersaglio.
2. Pretrattamento con Pepsin: immergere i vetrini in Pepsin 0,4%–0,8% (codice S3002). Sciogliere il contenuto
del pacchetto in 250–500 ml di acido cloridrico 0,2N) a 37 °C per 1–10 minuti, quindi sciacquare i vet rini
diverse volte in acqua distillata per rimuovere i residui di pepsina.
3. Pretrattamento con Target Retrieval e Pepsin: trattare i vetrini con la Target Retrieval Solution per il
recupero del bersaglio, nel modo sopra descritto; far seguire un trattamento delicato con pepsina. In genere
è sufficiente un trattamento con pepsina 0,005%–0,01% in acido cloridrico 0,2 N per 10–20 minuti a
temperatura ambiente.
4. Pretrattamento con Proteinase K: trattare i vetrini con Proteinase K, RTU (codice S3020) per 10–30 minuti a
temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini diverse volte con acqua distillata per rimuovere i residui di
Proteinase K.
Le condizioni ottimali per il pretrattamento, sia esso mediante recupero del bersaglio, digestione proteolitica o
una combinazione dei due metodi, vanno determinate di volta in volta in base al tipo di campione biologico. Per
molti campioni, è sufficiente il pretrattamento con uno dei due metodi. In genere i campioni citologici richiedono
un trattamento meno aggressivo di quelli tissutali. I campioni preparati con fissativi privi di legami crociati, come
l’acetone, non richiedono alcun pretrattamento. Nel caso si ritenga comunque di dover pretrattare tali campioni,
procedere con delicatezza perché potrebbero danneggiarsi facilmente.
Per il pretrattamento dei campioni per citologia a base liquida, si consiglia di attenersi alla procedura seguente:
Immergere i vetrini in alcol al 50% per 30 minuti, quindi far seguire un trattamento di post-fissazione in formalina
tamponata neutra al 10% per 30 minuti. Sciacquare i vetrini in diversi ricambi di acqua deionizzata e incubare
con Proteolytic Enzyme (codice S3007) a temperatura ambiente per 3 minuti. Al termine della digestione
enzimatica, è necessario sciacquare le sezioni in diversi ricambi di acqua deionizzata e immergerle in H2O2 allo
0,3% in metanolo per 5 minuti. Sciacquare i vetrini in diversi ricambi di acqua deionizzata. Ai fini della riduzione
del fondo, è possibile incubare i vetrini con Biotin Blocking System (codice X590). Applicare Avidin Block per
10 minuti, quindi far seguire da Biotin Block per 10 minuti (sciacquare in diversi ricambi di acqua deionizzata
prima e dopo ogni passaggio). Prima dell'applicazione della sonda, avere cura di mantenere i vetrini sempre
umidi. I suggerimenti per l'ibridazione e il lavaggio stringente sono disponibili nelle istruzioni della sonda.
Attenersi alle istruzioni per la rivelazione fornite di seguito, con una sola eccezione: diluire il concentrato
primario streptavidina-HRP con rapporto 1:100–1:300 per una incubazione della durata di 15–30 minuti.
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Soppressione della colorazione di fondo
Questo passaggio contribuisce a ridurre la colorazione di fondo in determinati tessuti, distruggendo l’attività
legante la streptavidina endogena e sopprimendo ogni attività perossidasica eventualmente presente nel
campione. Un protocollo tipico prevede l’esposizione del vetrino ad H2O2 allo 0,3% in metanolo, a temperatura
ambiente per almeno 20 minuti. Deve seguire un lavaggio in acqua distillata per 10 minuti.
Ibridazione e lavaggio stringente
Le temperature ottimali per l'ibridazione e il lavaggio stringente per le sonde biotinilate Dako sono specificate
nelle istruzioni a corredo delle singole sonde. Nel caso di sonde reperite dall’utente, sarà necessario
determinare le temperature ottimali per l'ibridazione e il lavaggio stringente. Come regola generale, la
temperatura ottimale per l’ibridazione è di 25 °C i nferiore alla TM (temperatura di fusione della sonda ibridata)
calcolata e quella per il lavaggio stringente è di 10–20 °C inferiore alla T M calcolata. Le formule per calcolare la
TM si trovano in Current Protocols in Molecular Biology.10
Per le sonde a singola elica e per l'mRNA bersaglio, non è indispensabile denaturare i materiali prima
dell'ibridazione. Per le sonde a doppia elica e/o per il DNA bersaglio, è invece obbligatorio un passaggio di
denaturazione. La denaturazione del DNA bersaglio o della sonda avviene in genere riscaldando la sonda e/o i
vetrini a 90–95 °C per 5 minuti con una piastra di riscaldamento.
Procedura per la colorazione
Nota: i protocolli per l’uso con la strumentazione Dako possono essere richiesti all'Assistenza Tecnica Dako.
PASSAGGIO 1 STREPTAVIDINA-HRP PRIMARIO
Prima dell’uso, il concentrato primario streptavidina-HRP deve essere diluito con rapporto
1:100 nel diluente primario streptavidina-HRP fornito nel kit. Preparare circa 150 µl di
soluzione primaria streptavidina-HRP per ogni vetrino.
Dopo il lavaggio stringente, sciacquare i vetrini diverse volte in tampone di lavaggio TBST.
Picchiettare delicatamente per eliminare il TBST in eccesso e asciugare con cautela attorno al
campione, in modo da rimuovere l'eventuale liquido residuo. Applicare 3–4 gocce della
soluzione primaria diluita streptavidina-HRP, ricoprendo il campione, e incubare a temperatura
ambiente per 15 minuti. Sciacquare i vetrini nel tampone di lavaggio TBST e immergerli in tre
bagni tampone TBST freschi della durata di 5 minuti ciascuno, così da rimuovere i residui della
soluzione primaria streptavidina-HRP.
PASSAGGIO 2 TIRAMIDE BIOTINILATA (REAGENTE DI AMPLIFICAZIONE)
Picchiettare delicatamente per eliminare il TBST in eccesso e asciugare con cautela attorno al
campione, in modo da rimuovere l'eventuale liquido residuo. Applicare 3–4 gocce di tiramide
biotinilata, ricoprendo il campione, e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Sciacquare i vetrini nel tampone di lavaggio TBST e immergerli in tre bagni tampone TBST
freschi della durata di 5 minuti ciascuno, così da rimuovere i residui della soluzione tiramide
biotinilata.
PASSAGGIO 3 STREPTAVIDINA-HRP SECONDARIO
Picchiettare delicatamente per eliminare il TBST in eccesso e asciugare con cautela attorno al
campione, in modo da rimuovere l'eventuale liquido residuo. Applicare 3–4 gocce della
soluzione secondaria streptavidina-HRP, ricoprendo il campione, e incubare a temperatura
ambiente per 15 minuti. Sciacquare i vetrini nel tampone di lavaggio TBST e immergerli in tre
bagni tampone TBST freschi della durata di 5 minuti ciascuno, così da rimuovere i residui della
soluzione secondaria streptavidina-HRP.
PASSAGGIO 4 REAZIONE DEL CROMOGENO
Immediatamente prima dell’uso, diluire il cromogeno DAB concentrato con rapporto 1:50 nel
tampone substrato DAB. Preparare circa 150 µl di cromogeno per ogni vetrino.
Picchiettare delicatamente per eliminare il TBST in eccesso e asciugare con cautela attorno al
campione, in modo da rimuovere l'eventuale liquido residuo. Applicare 3–4 gocce del
cromogeno DAB diluito, ricoprendo il campione, e incubare a temperatura ambiente per
5 minuti. Arrestare la reazione del cromogeno immergendo i vetrini in acqua per 1 minuto.
Sciacquare i vetrini con diverse immersioni sequenziali in acqua, così da rimuovere i residui di
DAB.
PASSAGGIO 5 COLORAZIONE DI CONTRASTO
Il colorante Hematoxylin (codice S3302) produce una colorazione blu del nucleo che contrasta
con i segnali marroni del cromogeno DAB ed è permanente sia nei mezzi di montaggio
acquosi, sia in quelli organici.
Immergere i vetrini in un bagno di ematossilina. La durata dell’incubazione dipende
dall’intensità dell’ematossilina usata. Se si usa il prodotto Hematoxylin (codice S3302),
generalmente è sufficiente un’incubazione di 1–4 minuti. Sciacquare i vetrini diverse volte
prima in TBST e poi in acqua, prima del montaggio.
PASSAGGIO 6 MONTAGGIO
Montare i campioni usando mezzi di montaggio acquosi o permanenti. Per il montaggio a base
acquosa, si consiglia l'uso di Glycergel (codice C0563).
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Controllo della qualità
Differenze nell'allestimento del tessuto e nelle procedure tecniche in uso presso il laboratorio dell’utente
possono produrre risultati discrepanti, pertanto è necessario eseguire regolarmente dei controlli interni.
Seguendo la procedura di colorazione con i controlli appropriati sarà possibile dimostrare il funzionamento dei
reagenti e la correttezza delle procedure tecniche adottate.
Tessuto e/o sonda di controllo positivo
Per verificare il corretto rendimento dei tessuti, delle sonde del test e dei reagenti, è necessario usare tessuti
noti per il controllo positivo della sonda del test e/o sonde note per il controllo positivo dei campioni del test.
Ai fini della dimostrazione del DNA del genoma nel nucleo, è possibile usare il prodotto Positive Control (Human
DNA) Biotinylated DNA Probe (codice X1414). La specificità dei reagenti di rivelazione può essere dimostrata
eseguendo la procedura di ibridazione in assenza della sonda: l'eventuale presenza della colorazione di fondo
quando si usa questo controllo è indicativa di legame aspecifico dei reagenti di rivelazione. Questo problema
potrebbe verificarsi se si lasciano asciugare le sezioni durante la procedura di rivelazione.
Sonda di controllo negativo
Per valutare la colorazione aspecifica e la specificità della reazione di ibridazione con la sonda del test, al posto
di quest'ultimo è possibile usare una sonda di controllo negativo su una sezione di ogni campione del test.
Come controllo negativo per determinare la specificità della reazione di ibridazione è possibile usare una sonda
marcata non ibridante, ad esempio il prodotto Negative Control (Plasmid DNA) Biotinylated DNA Probe (codice
X1415).
Interpretazione della
colorazione
Innanzitutto è necessario esaminare i campioni di controllo positivo per verificare che tutti i reagenti funzionino a
dovere. I segnali positivi, corrispondenti ad aree di ibridazione, appariranno come regioni marroni o nere
all’interno dei confini di ogni singola cellula.
L’assenza di colorazione specifica nei campioni di controllo negativo confermerà la specificità della sonda del
test. La colorazione aspecifica, se presente, avrà un aspetto punteggiato o diffuso. L’alto grado di sensibilità di
GenPoint è dovuto all'alto livello di amplificazione di questo sistema, pertanto sarà amplificata anche l'eventuale
colorazione di fondo aspecifica. Per questa ragione, ai fini dell’interpretazione dei risultati della colorazione, si
consiglia di usare sonde di controllo negativo sui campioni analizzati.
Limitazioni
Risultati negativi possono essere causati da temperature e tempi di incubazione errati, diluizione inadeguata dei
reagenti e fissazione o condizioni di pretrattamento non ottimali. Le condizioni ideali per la fissazione e il
pretrattamento devono essere determinate dall’utente per ogni tipo di campione.
L’alto grado di sensibilità di questo sistema di rivelazione garantisce la rivelazione di geni a sequenza ridotta
(“low-copy”) e di mRNA bersaglio a bassa abbondanza (“low-abundance”). Comunque, l'efficacia della
rivelazione di geni a copia singola (“single copy gene”) o di mRNA bersaglio a bassissima abbondanza (“very
low abundance”) quando si usa questo sistema di rivelazione dipende da quanto chiaramente le sonde per
analisi sono state marcate (in altre parole, dalla densità dei marcatori di biotina per sonda) e anche dalla
grandezza delle sonde e dei bersagli.
L’attività della perossidasi endogena o pseudoperossidasi può essere identificata in proteine ematiche quali
emoglobina, mioglobina, citocromo e catalasi, come pure in determinati leucociti.7 Tale attività può essere
eliminata incubando i campioni con perossido di idrogeno al 3% per 5 minuti a temperatura ambiente
(Passaggio 1 della procedura di colorazione), prima dell’applicazione della sonda.
I tessuti contenenti l’antigene di superficie dell’epatite B (HbsAg) possono essere interessati da una colorazione
non specifica con perossidasi di rafano.13
Risoluzione dei
problemi
Intervento consigliato
1a. Aumentare la concentrazione
della sonda.
Aumentare il tempo di
ibridazione.
Aumentare il numero di cicli di
amplificazione.
1b. Pretrattamento non ottimale.
1b. Titolare i tempi di fissazione
e/o pretrattamento.
2a. Aumentare il rapporto di
2. Fondo eccessivo.
2a. Eccessivo sviluppo del segnale.
diluizione del concentrato
primario streptavidina-HRP.
Ridurre il tempo di sviluppo
DAB.
2b. Attività di perossidasi endogena.
2b. Sedare l'attività di perossidasi.
NOTA: Se il problema non è imputabile a nessuna di queste cause o se l'intervento correttivo consigliato non si
rivela efficace, contattare l'Assistenza Tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti.
Bibliografia
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hybridization probes. Biochem J 1988; 251:935
2. Saffran WA, et al. Preparation and characterization of biotinylated psoralen. Nuc Acids Res 1988; 16:7221
(127952-001)
Problema
1. Nessun segnale.
Probabile causa
1a. Sequenze bersaglio a basso
numero di copie o scarsa efficienza
di ibridazione.
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3. Levenson C, et al. Biotinylated psoralen derivative for labeling nucleic acid hybridization probes. Methods
Enzymol 1990; 184:577
4. Nelson PS, et al. Oligonucleotide labeling methods 3. Direct labeling of oligonucleotides employing a novel,
non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone. Nuc Acids Res 1992; 20:6253
5. Gebeyeju G, et al. Novel biotinylated nucleotide analogs for labeling and colorimetric detection of DNA.
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6. Langer PR, et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: Novel nucleic acid affinity probes.
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7. Green NM. Avidin. Adv Prot Chem 1975; 9:85
8. Bobrow M, et al. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to
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9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of laboratory workers from infectious
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Edizione 07/15
(127952-001)
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