Preparazione ed allestimento dei preparati citologici

Preparazione ed allestimento dei preparati citologici
Dr.ssa Ilaria Di Candia, DVM
La citologia diagnostica (citopatologia) è l’esame morfologico delle cellule prelevate
da un tessuto.
L’utilità della citopatologia nella pratica clinica risiede nella rapidità, non invasività, facilità
d'esecuzione, relativa economicità, ed ai rischi minimi che corre il paziente durante il prelievo. Il
vantaggio rispetto all'istopatologia è riconducibile essenzialmente alla riduzione nei tempi di
refertazione.
La citologia diagnostica trova applicazione soprattutto nelle masse cutanee, nella ricerca di agenti
infettivi microscopici e si rileva particolarmente utile nell’individuazione di neoplasie a cellule
discrete.
I limiti della citologia risiedono nell’impossibilità di valutazione dell’architettura e dell’infiltrazione,
nei tessuti adiacenti, di tessuto patologico: per queste indagini si rileva necessaria l’indagine
istopatologica. Si deve inoltre ricordare che un campione citologico non sempre è rappresentativo
della lesione: per esempio con pazienti in sovrappeso è possibile aspirare il tessuto adiposo
circostante la lesione, I preparati ottenuti per apposizione o scarificazione di lesioni ulcerate
possono contenere solo cellule superficiali ed essere preda di flogosi/infezioni secondarie e,
ancora, I linfonodi linfomatosi notevolmente aumentati di volume possono diventare necrotici e
quindi fornire campioni non diagnostici.
Citologia
Velocità di esecuzione
Istologia
+++
+
+
+++
+++
++
Analisi strutturale
+
+++
Capacità diagnostica
++
+++
Costi di esecuzione
Analisi cellulare
Tabella1: da Poli, Ciorba: Citologia diagnostica del cane e del gatto, 2007.
MATERIALI E METODI
MATERIALI
AGHI da 25G-27G o AGHI SPINALI (tessuti endocavitari parenchimatosi) e SIRINGA da 5-10ml
oppure
TAMPONI STERILI o
CYTOBRUSH e
VETRINI PULITI, SGRASSATI, preferibilmente con un’estremità sabbiata su cui scrivere a matita, i
dati utili per il riconoscimento dei preparati.
PORTAVETRINI POSTALI
FONTE DI CALORE (PHON) per l'asciugatura
PROVETTE VUOTE e contenenti EDTA per l'analisi dei liquidi.
METODI
Esistono tecniche di prelievo diverse che trovano indicazione in base a tessuto, regione anatomica
o tipo di lesione che si intende campionare.
Prima di eseguire il prelievo è importante preparare tutto il materiale necessario per il tipo
di campionamento che si intende eseguire.
A) AGO-INFISSIONE (Fine Needle Biopsy- FNB)
INDICAZIONI: tessuti solidi, masse, linfonodi, organi parenchimatosi.
ESECUZIONE: Per le masse cutanee/sottocutanee o i linfonodi è necessario tenere saldamente il
tessuto da campionare tra due dita di una mano, mentre con l’altra si inserisce l’ago
(preferibilmente non collegato ad una siringa) all’interno del tessuto con un movimento rotatorio o
spingendo delicatamente l'ago verso il centro della massa e ritraendolo. Tale operazione va
eseguita anche in direzione obliqua.
Figura 1
Ottenuto il campione, si collega l'ago ad una siringa vuota in cui si è ritratto lo stantuffo, quindi si
esercita una pressione adeguata sullo stantuffo per adagiare il materiale su uno o più vetrini puliti.
B) AGO-ASPIRAZIONE (Fine Needle Aspiration-FNA)
Utile nel campionamento di tessuti solidi tenaci o di liquidi (versamenti intracavitari, liquido
sinoviale).
1. Tessuti: la tecnica è la stessa dell'ago-infissione con la differenza che in questo caso
Figura 2
Figura 3
l'ago è collegato alla siringa su cui si esercita o una pressione continua oppure
intermittente.
2) Liquidi
L'aspirazione è continua, per la raccolta di liquidi presenti in grande quantità si può
utilizzare una siringa più capiente collegata ad un ago a farfalla.
Il materiale raccolto DEVE essere aliquotato in due provette: una contenente EDTA ed una
vuota, senza gel poichè le cellule vi possono aderire determinando una falsa diminuzione
del loro numero totale ; è sempre importante preparare subito, con il liquido tal quale
almeno un vetrino che va asciugato rapidamente all'aria o mediante una fonte di calore.
C) APPOSIZIONE/IMPRONTA
Impiegata per la raccolta di materiale da lesioni ulcerate o da prelievi bioptici. Se utilizzata per
lesioni ulcerate il campionamento va eseguito prima e dopo pulizia della parte mediante una garza
imbevuta di soluzione fisiologica sterile; in questo caso basta appoggiare con una buona pressione
la superficie di un vetrino pulito sulla lesione: tale operazione può essere effettuata 2-3 volte per
ogni vetrino. Nel caso di asportazione di lesioni solide o prelievi bioptici è necessario sezionare il
campione per ottenere una superficie adeguata e quindi allontanare il liquido in eccesso ponendo
delicatamente il campione su carta bibula o da filtro.
Figura 4
Figura 5
Si poggia quindi il campione ormai asciutto sulla superficie del vetrino, senza farlo strisciare.
Figura 6
Figura 7
D)TAMPONI
Trovano utilizzo nel campionamento delle mucose (orale, nasale, vaginale). Il tampone sterile va
inserito sulla superficie della mucosa da campionare operando un'azione rotatoria delicata. La
deposizione del materiale sul vetrino va eseguita per rotolamento, srotolando il tampone più volte
sulla superficie del vetrino.
Figura 8
E) SPAZZOLAMENTO/CYTOBRUSH
Metodo più usato in endoscopia, può essere utilizzato anche per prelievi di mucosa orale o
congiuntivale.
Figura 9
Figura10
Si utilizza uno spazzolino apposito con cui si raccoglie il materiale che viene poi delicatamente
depositato sui vetrini.
Figura 11
TECNICHE DI ALLESTIMENTO DEI VETRINI
Come linee generali il materiale per l'esame citologico deve essere posizionato vicino alla banda
sabbiata, e mai ad una estremità del vetrino, questo perchè altrimenti non è possibile valutare
l'intero campione.
Le tecniche di allestimento dei preparati, oltre a quelle già illustrate per I tamponi e lo
spazzolamento sono:
1) SQUASH-PREPARATION
Si pone il materiale su un vetrino pulito e si utilizza un secondo vetrino posizionato
perpendicolarmente al primo da apporre al campione: appena quest'ultimo si espande si fa
decorrere velocemente il vetrino incidente lungo il vetrino portaoggetto.
Figura 12
2) PUSH AND PULL
Figura 13
La tecnica è simile alla precedente con la differenza che il vetrino incidente è posizionato
parallelamente al portaoggetto; con questa tecnica è possibile utilizzare entrambi I vetrini per
l'esame citologico.
3) STAR-FISH
Figura 14
Questa tecnica utilizza l'ago con cui si è eseguito il campionamento per strisciare il materiale sul
vetrino. L'inconveniente maggiore è rappresentato dal mancato raggiungimento di un monostrato
cellulare: in citopatologia gli aggregati di aspetto tridimensionale, con gli elementi cellulari
sovrapposti gli uni agli altri non sono valutabili (unica eccezione il tessuto adiposo).
CAUSE DI INADEGUATEZZA DEL CAMPIONE CITOLOGICO
Le cause di inadeguatezza sono diverse e possono essere ricondotte a scorrette pratiche di
campionamento, di allestimento e di conservazione.
Campionamento
Uso di aghi di grande calibro
Può causare inadeguatezza per due ragioni:
-Emocontaminazione
-Presenza di materiale tissutale ammassato, di aspetto microscopico tridimensionale.
Eccessiva forza esercitata durante il prelievo
Accade soprattutto quando si attua l'ago-aspirazione, in particolare per tessuti delicati come il
tessuto linfonodale oppure esercitando troppa pressione con il cytobrush: la popolazione cellulare
può subire danni tali da renderla non valutabile.
Prelievo di tessuto extra-lesionale
Figura16
Le cause più comuni risiedono
nell'oltrepassarla(vedi figure16-17).
Figura17
nel
passare
tangenzialmente
alla
lesione
Allestimento
Materiale non strisciato
Eccessiva pressione durante l'allestimento del vetrino con conseguente danno cellulare.
oppure
Conservazione
Esposizione ai vapori di formalina. La formalina impedisce il corretto processo di colorazione
citologica rendendo I preparati non valutabili.
Contenitori inadeguati: I vetrini possono rompersi durante il trasporto se non vengono introdotti in
contenitori idonei (portavetrini postali).
Bibliografia
-
A. Poli, A. Ciorba, “Citologia del cane e del gatto”, 1a ed. 2007
R.L. Cowell, R. Tyler, J. Meinkoth, D. DeNicola, “Diagnostic Cytology and Hematology of
the dog and cat”, 3th edition, 2008
R. Raskin, D. Meyer “Canine and Feline Cytology”, 2nd edition, 2010
E. Villiers, L. Blackwood, “Gli Esami di Laboratorio del cane e del gatto”, 2006
R. Baker, J. Lumdsen, “Citologia del cane e del gatto-Atlante a colori” 1a ed. italiana, 2001
Iconografia
-
Figura 1: R. Raskin, D. Meyer “Canine and Feline Cytology”, 2nd edition, 2010
Figure 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 15, 16, 17: R.L. Cowell, R. Tyler, J. Meinkoth, D. DeNicola, “Diagnostic Cytology and Hematology of the dog and cat”, 3th edition, 2008
Figure 8, 12: A. Poli, A. Ciorba, “Citologia del cane e del gatto”, 1a ed. 2007