istruzioni operative
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BProbeTec ET Confezione di reagenti per lidentificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) Italiano USO PREVISTO Il pacco reagenti BD ProbeTec ET per lidentificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB), per uso con il sistema BD ProbeTec ET, utilizza una tecnica di Strand Displacement Amplification (SDA) per lidentificazione qualitativa diretta del DNA del complesso Mycobacterium tuberculosis da campioni di clinici decontaminati e digeriti delle vie respiratorie, come lespettorato, lespettorato indotto, i liquidi di lavaggio bronchiale ed altri campioni delle vie respiratorie. Il dosaggio BD ProbeTec ET per lidentificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) trova impiego come analisi diretta per la valutazione di campioni prelevati da pazienti con sospetta infezione da tubercolosi. Vengono considerati non trattati i pazienti che (1) non hanno mai ricevuto una terapia anti-tubercolare; (2) non hanno ricevuto detta terapia negli ultimi 12 mesi oppure; (3) hanno ricevuto meno di 7 giorni di terapia. SOMMARIO E SPIEGAZIONE Circa un terzo della popolazione mondiale è infettata da Mycobacterium tuberculosis e presenta un rischio del 10% di sviluppare la malattia durante il corso della vita.1,2 La tubercolosi uccide circa 3 milioni di persone allanno in tutto il mondo, è quindi la causa principale di morte da malattie infettive.1,3 La crescita lenta dellorganismo M. tuberculosis ritarda la diagnosi clinica e il trattamento della malattia e ne favorisce la diffusione. Secondo le raccomandazioni dei Centers for Disease Control and Prevention degli USA, occorre adoperarsi affinché i laboratori adottino i metodi più rapidi a disposizione per le analisi micobatteriche diagnostiche.3 Limpiego di tecnologie di amplificazione del DNA, come la tecnica di Strand displacement amplification (SDA) consente lindividuazione rapida e lidentificazione del DNA del complesso M. tuberculosis in campioni clinici, agevolando di conseguenza interventi terapeutici tempestivi. Il pacco reagenti per il complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) viene usato con il sistema BD ProbeTec ET. Il sistema di analisi utilizza una tecnologia SDA omogenea come metodo di amplificazione e un trasferimento di energia fluorescente (ET) come metodo di rilevamento della presenza del complesso Mycobacterium tuberculosis direttamente da campioni decontaminati e digeriti delle vie respiratorie (sedimenti NALC-NaOH). Il complesso M. tuberculosis comprende M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti.4,5 PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il dosaggio del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) BD ProbeTec ET si basa sulla simultanea amplificazione e determinazione del DNA target mediante un primer di amplificazione e una sonda marcata con indicatore fluorescente.6-8 I reagenti SDA sono essiccati in due micropozzetti monouso separati. Il sedimento NALC-NaOH preparato viene aggiunto alla striscia di micropozzetti di priming che contiene i primer di amplificazione, le sonde marcate con indicatore fluorescente e gli altri reagenti. Dopo lincubazione, la miscela reattiva viene trasferita nella striscia di micropozzetti di amplificazione che contiene due enzimi (una DNA polimerasi e una endonucleasi di restrizione) necessari per lSDA. I micropozzetti di amplificazione vengono sigillati per evitare la contaminazione e incubati in un lettore fluorescente termocontrollato che esegue il monitoraggio della reazione per la formazione di prodotti amplificati. Ciascuna reazione include la co-amplificazione e il riconoscimento di un controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control - IAC). La funzione di questo controllo è di confermare la validità della reazione di amplificazione e di identificare una possibile inibizione da parte del campione analizzato. I risultati vengono riportati mediante un algoritmo come positivi, negativi o indeterminati. REAGENTI E MATERIALI Ogni pacco reagenti BD ProbeTec ET per lidentificazione del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) include quanto segue. Micropozzetti di priming per DTB, 3 x 32; 4 oligonucleotidi ≥ 7,6 pmol; DNA umano ≥ 6 µg; dNTP ≥ 37,6 nmol; sonde indicatrici ≥ 30 pmol; oligonucleotide sintetico ≥ 10.500 copie. Micropozzetti di amplificazione per DTB, 3 x 32; Enzima di restrizione ≥ 25,5 unità; DNA polimerasi ≥ 8 unità; dNTPS ≥ 10 nmol. Accessori: 10 coperchi, 8 buste per rifiuti, 16 sigillanti. Ogni kit BD ProbeTec ET per la preparazione dei campioni per lidentificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) include quanto segue. Tampone di lavaggio per DTB 1 - 225 mL di soluzione contenente urea, tampone CAPS, dimetilsolfossido, glicerolo e idrossido di sodio. Tampone di lisi per DTB 2 - 50 mL di soluzione contenente idrossido di potassio. Tampone di neutralizzazione per DTB 3 - 150 mL di soluzione contenente bicina, idrossido di potassio, dimetilsolfossido, glicerolo e 0,03% di Proclin (conservante). Ogni set di controlli BD ProbeTec ET per lidentificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB) include quanto segue. Controllo positivo per DTB - DNA di scroto essiccato di salmone ≥ 5 µg e ≥ 750 copie di oligonucleotide sintetico per reazione ≥ 5250 copie in tutto. 39 Controllo negativo per DTB - DNA di scroto di salmone ≥ 5 µg. Strumenti, attrezzatura e materiali duso e consumo - Strumento BD ProbeTec ET e relativa piastra, incubatore per riscaldamento e priming BD ProbeTec ET, forno BD ProbeTec ET, bagno ad ultrasuoni BD ProbeTec ET e relativo inserto, pipettatore e alimentatore BD ProbeTec ET, cestello di provette portacampioni da 2 mL, supporto trasparente per pipettaggio, provette portacampioni da 2 mL e relativi tappi, tappi da 2 mL e kit di accessori BD ProbeTec ET, tamponi CultureSwab EZ. Materiali richiesti ma non forniti - Microcentrifuga, con rotori standard a tenuta di aerosol, in grado di raggiungere 12.200 x g (come la microcentrifuga Eppendorf Modello 5417C) vortex, guanti monouso, pipette con puntali antiaerosol in grado di dispensare volumi da 100 µL, 500 µL, 600 µL e 1 mL, ipoclorito di sodio all1% (v/v) con Alconox*, recipienti sterili adatti per contenere le aliquote dei 3 tamponi per DTB, cronometro, disinfettante tubercolicida, garza/compresse assorbenti. *Mescolare 200 mL di candeggina con 800 mL di acqua tiepida. Aggiungere 7,5 g di Alconox e mescolare. Preparare una miscela fresca ogni giorno. Requisiti di preparazione e conservazione - I pacchi reagenti per DTB possono essere conservati a 233 °C. Non usare dopo la data di scadenza i pacchi reagenti non aperti. Una volta aperta la busta, i micropozzetti sono stabili per 4 settimane, se opportunamente sigillati, o fino alla data di scadenza, a seconda di quale delle due si verifica prima. Non congelare. I reagenti di preparazione per DTB possono essere conservati a 233 °C. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non congelare. I controlli per DTB possono essere conservati a 233 °C. Non usare i controlli dopo la data di scadenza. Non congelare. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per uso diagnostico in vitro. 1. Non sono state dimostrate le prestazioni di questo test per lidentificazione del complesso M. tuberculosis da campioni non delle vie respiratore, tra cui il sangue, il liquido cerebrospinale, le feci o le urine. Le prestazione del dosaggio BD ProbeTec ET per DTB non sono state valutate su campioni preparati con metodi diversi da quelli descritti in questo foglio illustrativo. 2. Le fasi di manipolazione e preparazione dei campioni durante il processo di inattivazione termica devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II. La centrifugazione dei campioni prima dellinattivazione termica deve essere eseguita esclusivamente con il rotore a tenuta di aerosol. Questo rotore deve essere aperto esclusivamente nellarmadio di sicurezza biologica. Usare esclusivamente il rotore standard per la centrifugazione dei campioni dopo linattivazione termica fuori dellarmadio di sicurezza biologica. 3. Il DNA di placenta umana è uno dei componenti dei micropozzetti di priming. Questi reagenti devono essere maneggiati come sostanze infettanti, in osservanza delle procedure di laboratorio stabilite9,10,11 e/o delle direttive del presidio di utilizzo. 4. Sottoporre a coltura tutti i campioni preparati per determinare leventuale presenza di micobatteri diversi da quello della tubercolosi (MOTT), eseguire un test di suscettibilità antimicobatterica, determinare le sottospecie del complesso M. tuberculosis e/o valutarne la vitalità. 5. I campioni possono contenere microrganismi patogeni, inclusi il virus dellepatite B e il virus dellimmunodeficienza umana (HIV). Di conseguenza, i reagenti devono essere maneggiati come sostanze infettanti, in osservanza delle procedure di laboratorio stabilite9,10,11 e/o delle direttive del presidio di utilizzo. 6. Il tampone di lavaggio per DTB 1 e il tampone di neutralizzazione per DTB 3 contengono dimetilsolfossido (DMSO), una sostanza dannosa che comporta il rischio di effetti irreversibili per inalazione, contatto con la pelle o ingestione. Evitare il contatto con gli occhi. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua. 7. Il tampone di lavaggio per DTB 1 e il tampone di lisi per DTB 2 sono fortemente alcalini. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua. Se non viene trattata, larea esposta al contatto è soggetta ad ustione. 8. Non scambiare o mescolare i micropozzetti, i controlli o i tamponi di preparazione provenienti da kit con numeri di lotto diversi. 9. Per eliminare i prodotti usati, come i puntali per pipette, le provette portacampioni, i copri-priming e tutti gli articoli monouso, attenersi alle disposizioni stabilite dal laboratorio. 10. Per il trasferimento dei campioni trattati ai micropozzetti di priming e per trasferire i campioni dai micropozzetti di priming ai micropozzetti di amplificazione, usare solo pipette e puntali per pipette BD ProbeTec ET. 11. Una volta aperte, le buste dei reagenti che contengono micropozzetti di priming e micropozzetti di amplificazione non utilizzati DEVONO essere richiuse con attenzione. Prima di richiudere le buste dei reagenti, assicurarsi che contengano il sacchetto di essiccante. 12. Prima del trasferimento dallincubatore per riscaldamento e priming BD ProbeTec ET allo strumento BD ProbeTec ET, la piastra che contiene i micropozzetti di amplificazione DEVE essere opportunamente sigillata con il sigillante di amplificazione. La chiusura a tenuta è necessaria per evitare la contaminazione dello strumento e dellarea di lavoro con i prodotti di amplificazione. Non rimuovere mai dai micropozzetti il materiale sigillante. 13. Qualora una piastra per analisi superi 6 colonne (>48 campioni e controlli), per evitare il rischio di contaminazione è necessario usare un foglio INTERO di sigillante di amplificazione. 14. Per evitare di contaminare lambiente di lavoro con i prodotti di amplificazione, una volta completata lanalisi usare le buste dei rifiuti fornite per smaltire i micropozzetti di amplificazione. 40 15. Per evitare la contaminazione crociata dei campioni, CAMBIARE I GUANTI quando specificato durante la preparazione dei campioni e la procedura di dosaggio. Se i guanti vengono a contatto con i campioni, cambiarli immediatamente per evitare la contaminazione di altri campioni. 16. Nel caso di contaminazione dellarea di lavoro o dellattrezzatura con il campione preparato, pulire accuratamente le superfici contaminate con ipoclorito di sodio 1% (v/v) contenente Alconox e sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata/distillata. Prima di proseguire, lasciare asciugare completamente le superfici. 17. Pulire ogni giorno lintera area di lavoro le superfici dei banchi e degli strumenti con ipoclorito di sodio all1% contenente Alconox. Sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata/distillata. Prima di procedere ad altre analisi, lasciare asciugare completamente le superfici. 18. I micropozzetti di priming che contengono liquido residuo, dopo il trasferimento del liquido dai micropozzetti di priming a quelli di amplificazione, costituiscono una fonte di contaminazione del target. Prima di eliminare i micropozzetti di priming, sigillarli accuratamente con il sigillante per piastra. 19. Non introdurre le dita o le mani nel bagno ad ultrasuoni quando le onde ultrasonore sono attivate (ON), in quanto questo può provocare una sensazione spiacevole e causare irritazione cutanea. È anche possibile che si verifichino danni prolungati a carico del tessuto molle. 20. Non usare un termometro a mercurio per verificare la temperatura del bagno ad ultrasuoni; utilizzare il termometro digitale appositamente fornito. 21. In caso di situazioni insolite, come un versamento nello strumento BD ProbeTec ET o una contaminazione di DNA impossibile da eliminare con la pulizia, rivolgersi allassistenza tecnica. PRELIEVO E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI Tutti i campioni devono essere prelevati e trasportati seguendo le disposizioni dei CDC, del Clinical Microbiology Procedures Handbook (Manuale di procedure microbiologiche cliniche) o il manuale delle procedure fornito dal laboratorio utilizzato.1,8 DIGESTIONE, DECONTAMINAZIONE E CONCENTRAZIONE Per la preparazione dei campioni, usare il metodo NALC-NaOH raccomandato nella pubblicazione dei CDC Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory.1 Alternativamente, usare il kit BBL MycoPrep per la preparazione di campioni micobatterici (vedere Disponibilità). NOTA - Se lanalisi con il dosaggio BD ProbeTec ET non viene seguita immediatamente, è possibile conservare i sedimenti NALC/NaOH nel modo seguente. (a) A 28 ºC fino a 5 giorni. (b) Per oltre 5 giorni, congelare a -20 ºC o a temperatura inferiore (senza ciclo temporizzato) fino a 3 mesi. Prima della preparazione per il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB, i sedimenti congelati devono essere scongelati a temperatura ambiente. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI A. Preparazione del campione BD ProbeTec ET per DTB Fuori dallarmadio di sicurezza biologica (BSC) 1. Prima delluso, i tamponi per la preparazione del campione devono essere a temperatura ambiente e mescolati accuratamente. Per evitare la contaminazione dei tamponi di stock, dispensare volumi sufficienti di tampone in contenitori sterili, opportunamente etichettati come segue. a. Tampone di lavaggio per DTB 1 - 1 mL per ciascun sedimento NALC-NaOH da preparare, più 12 mL extra per pipettare. b. Tampone di lisi per DTB 2 - 0,1 mL per ciascun sedimento NALC-NaOH e rispettivi controlli da preparare, più 0,51 mL extra per pipettare. c. Tampone di neutralizzazione per DTB 3 - 0,6 mL per ciascun sedimento NALC-NaOH e rispettivi controlli da preparare, più 0,51 mL extra per pipettare. d. Per evitare la contaminazione dei tamponi, non versare di nuovo nel flacone il tampone residuo. 2. Usare le etichette fornite con le provette portacampioni per etichettare una provetta da 2 mL per ciascun sedimento NALC-NaOH da preparare. 3. Stappare le provette portacampioni e dispensare in ciascuna provetta 1,0 mL di tampone di lavaggio per DTB 1. Richiudere le provette con il tappo. 4. Trasferire le provette nellarmadio di sicurezza biologica. B. Preparazione dei campioni di sedimento NALC-NaOH per il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB Dentro larmadio di sicurezza biologica NOTA - Prima di eseguire la decantazione dei campioni, preparare un contenitore per rifiuti liquidi a rischio biologico. 1. Agitare con vortex per 5 secondi il primo sedimento NALC-NaOH. 2. Usando pipettatore con un nuovo puntale anti-aerosol, trasferire 500 µL di sedimento NALC-NaOH nella provetta portacampioni debitamente etichettata contenente 1 mL di tampone di lavaggio per DTB 1. 3. Richiudere bene la provetta. 4. Ripetere i passaggi 13 per ciascun sedimento NALC-NaOH. 5. CAMBIARE I GUANTI. 6. Agitare con vortex per 5 secondi ogni provetta portacampioni. 7. Collocare ciascuna provetta nel rotore a tenuta di aerosol e fissare saldamente il coperchio a tenuta di aerosol. Pulire lesterno del rotore con teli o garze imbevuti di soluzione antibatterica. 41 8. Trasferire nella microcentrifuga il rotore a tenuta di aerosol. Centrifugare i campioni a 12.200 x g per 3 minuti. NOTA - È necessario seguire le condizioni di centrifugazione specificate, in quanto una centrifugazione insufficiente può dar luogo a risultati falsi negativi. 9. Immediatamente dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il rotore dalla microcentrifuga (senza disturbare la guarnizione di tenuta per aerosol) e rimetterlo nellarmadio di sicurezza biologica. 10. Togliere il coperchio a tenuta di aerosol e rimuovere immediatamente i campioni dal rotore, avendo cura di ridurre al minimo la miscelazione del supernatante e del sedimento. 11. Stappare la prima provetta e decantare il supernatante nel contenitore per rifiuti liquidi nellarmadio di sicurezza biologica. Esercitare un movimento regolare di inversione e terminare battendo leggermente verso il basso la provetta capovolta. NOTA - È possibile che il sedimento si separi in un secondo tempo. Proseguire subito con i passaggi 9, 10 e 11. 12. Richiudere bene con il tappo la provetta e collocarla nel cestello di provette portacampioni da 2 mL. 13. Ripetere i passaggi 11 e 12 per tutti i campioni. 14. CAMBIARE I GUANTI. C. Riscaldamento dei campioni Forno BD ProbeTec ET NOTA - Assicurarsi che le provette portacampioni siano ben chiuse con il tappo. Prima di riscaldare i campioni nel forno, esaminare visivamente i tappi delle provette per accertarsi che gli o-ring siano posizionati correttamente. Sostituire il tappo se lo-ring manca o appare deformato. Per istruzioni dettagliate, incluse le avvertenze e le precauzioni pertinenti, consultare il Manuale duso del sistema BD ProbeTec ET. 1. Mettere nel forno il cestello di provette portacampioni da 2 mL e chiudere lo sportello. 2. Selezionare RUN #01 (Ciclo n. 01). Premere OK. 3. Premere START (Avvio) per inizializzare il ciclo di analisi. 4. Quando inizia il ciclo di riscaldamento, eseguire i seguenti passaggi. a. Per preparare il bagno ad ultrasuoni BD ProbeTec ET procedere come segue. (1) Introdurre nella vasca linserto per bagno ad ultrasuoni. (2) Riempire il bagno ad ultrasuoni con acqua calda di rubinetto, fino alla riga indicatrice di massimo. (NOTA - Non usare acqua deionizzata.) (3) Impostare la temperatura a 65 ºC e accendere lincubatore. (4) Erogare energia ultrasonica per 60 minuti (impostazione predefinita) tenendo il bagno chiuso con il coperchio. b. Fissare il rotore standard nella microcentrifuga. 5. Trascorsi 15 minuti di ciclo di riscaldamento, controllare e registrare il valore indicato dal termometro esterno del forno, per accertarsi che la temperatura sia ≥ 95 ºC. 6. Al termine del ciclo di riscaldamento nel forno, si avverte un bip e il display LCD indica che il ciclo è completo (DONE). Sbloccare la serratura dello sportello premendo il tasto OPEN DOOR (sportello aperto) e rimuovere il cestello di provette portacampioni da 2 mL. NOTA - A questo punto, gli eventuali micobatteri presenti nel campione non sono più vitali e le successive manipolazioni possono essere effettuate fuori dallarmadio di sicurezza biologica. I campioni tuttavia vanno ancora trattati come potenzialmente a rischio biologico. D. Lisi dei campioni Bagno ad ultrasuoni BD ProbeTec ET AVVERTENZA - Non introdurre le dita o le mani nel bagno ad ultrasuoni quando le onde ultrasonore sono attivate (ON), in quanto questo può provocare una sensazione spiacevole e causare irritazione cutanea. È anche possibile che si verifichino danni prolungati a carico del tessuto molle. AVVERTENZA - Non usare un termometro a mercurio per verificare la temperatura del bagno ad ultrasuoni; utilizzare il termometro digitale appositamente fornito. NOTA - Per istruzioni dettagliate, incluse le avvertenze e le precauzioni pertinenti, consultare il Manuale duso del sistema BD ProbeTec ET. 1. Disporre le provette portacampioni nella microcentrifuga con il rotore standard. 2. Chiudere con il coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi. 3. Rimuovere le provette dalla centrifuga ed esaminarne i tappi alla ricerca di eventuale condensato. Se si nota la presenza di condensato, ripetere la centrifugazione. 4. Rimettere le provette nel cestello di provette portacampioni da 2 mL. 5. Togliere il tappo dalla prima provetta. Usando un pipettatore con puntale anti-aerosol, dispensare nella provetta 100 µL di tampone di lisi per DTB 2. Rimettere il tappo sulla provetta e stringerlo bene. 6. Ripetere la procedura per tutti i campioni usando un puntale nuovo per ogni campione. 7. CAMBIARE I GUANTI. 8. Agitare con vortex per 5 secondi ciascuna provetta.Assicurarsi che le provette siano ben chiuse con il tappo quando vengono rimesse nel cestello di provette portacampioni da 2 mL e spingerle verso il basso in modo che il bordo risulti alloggiato nella sagoma intagliata sul cestello. Questo serve ad orientare correttamente le provette per la massima esposizione allenergia ultrasonica. 42 9. Interrompere (OFF) lerogazione di energia ultrasonica e confermare che il livello dellacqua sia sceso tra le righe indicatrici di minimo e massimo che si trovano sullinserto del bagno ultrasonico. Togliere o aggiungere acqua calda di rubinetto come necessario. Controllare con il termometro digitale la temperatura del bagno ad ultrasuoni, per accertarsi che sia pari a 65 +/- 5 °C. 10. Trasferire nellinserto del bagno ad ultrasuoni il cestello di provette portacampioni da 2 mL. Rimettere il coperchio sul bagno ad ultrasuoni. 11. Impostare il cronometro del bagno ad ultrasuoni su 45 minuti e accendere lerogazione di energia ultrasonica. 12. Al termine della sonificazione, spegnere il bagno ad ultrasuoni e rimuovere il cestello di provette portacampioni da 2 mL. Mettere il cestello ad asciugare su dei fogli di carta assorbente. E. Neutralizzazione dei campioni 1. Disporre le provette portacampioni nella microcentrifuga con il rotore standard. 2. Chiudere con il coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi. 3. Rimuovere le provette dalla centrifuga ed esaminarne i tappi alla ricerca di eventuale condensato. Se si nota la presenza di condensato, ripetere la centrifugazione. 4. Disporre le provette nel supporto trasparente per pipettaggio. 5. Togliere il tappo dalla prima provetta. Usando un pipettatore con puntale anti-aerosol, dispensare nella provetta 600 µL di tampone di neutralizzazione per DTB 3. Rimettere il tappo sulla provetta e stringerlo bene. 6. Ripetere la procedura per tutti i campioni usando un puntale nuovo per ogni provetta. 7. CAMBIARE I GUANTI. 8. Agitare con vortex ogni provetta per 5 secondi. 9. Centrifugare ad impulsi le provette seguendo i passaggi 13 descritti qui sopra. 10. Rimettere le provette nel supporto trasparente per pipettaggio. 11. I campioni trattati sono ora pronti per essere analizzati con il sistema BD ProbeTec ET. NOTA - Se lanalisi non viene eseguita immediatamente, è possibile conservare nel modo seguente i campioni preparati. a) A 1833 ºC fino a 12 ore. b) A 28 ºC fino a 4 giorni. Prima dellanalisi, i campioni devono essere riscaldati nuovamente nel forno BD ProbeTec ET. c) Congelati a -20 ºC o a temperatura inferiore (senza ciclo temporizzato) fino a 3 mesi. Prima dellanalisi, i campioni congelati devono essere scongelati a temperatura ambiente e riscaldati nel forno BD ProbeTec ET. d) Una volta riscaldate le provette (vedi i passaggi b e c qui sopra), disporle nella microcentrifuga utilizzando il rotore standard. Chiudere con il coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi. Rimuovere le provette dalla centrifuga ed esaminarne i tappi alla ricerca di eventuale condensato. Se si nota la presenza di condensato, ripetere la centrifugazione. Rimettere le provette nel supporto trasparente per pipettaggio. I campioni sono ora pronti per essere analizzati con il sistema BD ProbeTec ET. PROCEDURA DEL TEST A. Preparazione dello strumento 1. Prima di iniziare il dosaggio, accendere lo strumento e lasciarlo riscaldare. a. Per riscaldare e stabilizzare lincubatore per riscaldamento e priming occorrono circa 90 minuti. Il setpoint per il componente di priming dellincubatore per riscaldamento e priming è di 72,5 °C. Il setpoint per il componente di riscaldamento dellincubatore è di 54 °C. b. Lo strumento BD ProbeTec ET è controllato dal software e per riscaldarsi richiede circa 30 minuti. 2. Prima di iniziare il dosaggio, controllare le temperature dellincubatore per riscaldamento e priming. Il termometro dellunità riscaldante per priming deve indicare 7273 °C. Il termometro dellunità riscaldante per riscaldamento deve indicare 53,554,5 °C. 3. Controllare la temperatura visualizzata sullo schermo del BD ProbeTec ET. La temperatura indicata deve essere di 47,555,0 °C. B. Pipettatore BD ProbeTec ET Per spiegazioni dettagliate relative alle funzioni del tastierino del pipettatore BD ProbeTec ET, consultare il Manuale duso del sistema BD ProbeTec ET. Per eseguire il dosaggio per DTB, sono necessari i seguenti programmi. Programma 1 trasferisce il liquido dai campioni preparati ai micropozzetti di priming. Programma 5 trasferisce il liquido dai micropozzetti di priming ai micropozzetti di amplificazione. Programmare il pipettatore nel modo seguente. Programma 1 1. Accendere il pipettatore. Il pipettatore emetterà un bip, lampeggerà ZERO e poi il numero di versione del software ed emetterà un altro bip. 43 2. Premere il tasto blu Prog (Programmazione). Premere il tasto Vol (Volume) fino a quando viene visualizzato 1 per selezionare il Programma 1. Premere Enter (Invio). 3. Per accedere alla modalità di programmazione, tenere premuto il tasto Prog. Premere il tasto Prog, e spingere contemporaneamente il tasto Funzione speciale con la punta di una pipetta o di una graffetta. 4. Premere Fill (Riempimento). Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 200. Premere Enter (Invio). 5. Premere Disp (Dispensazione). Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 150. Premere Enter (Invio). 6. Premere Purge (Spurgare). Premere Enter (Invio). 7. Premere Enter (Invio) una seconda volta per memorizzare il programma e uscire. Un bip dovrebbe indicare che la programmazione è completa. 8. Verificare il programma premendo il trigger per avanzare da ciascun passaggio al successivo e impostare per ciascun passaggio le velocità di aspirazione/dispensazione usando il tasto Vol. Ad ogni passaggio appare lindicatore di velocità. Usare il tasto Vol per regolare lindicatore di velocità in modo che visualizzi 2 quadratini per i passaggi di Fill (Riempimento) e Disp e 3 quadratini per il passaggio Purge (Spurgare). Programma 5 1. Premere il tasto Prog. Premere il tasto Vol fino a quando viene visualizzato 5 per selezionare il Programma 5. Premere Enter (Invio). 2. Per accedere alla modalità di programmazione, tenere premuto il tasto Prog e spingere contemporaneamente il tasto Funzione speciale con la punta di una pipetta o di una graffetta. 3. Premere Fill (Riempimento). Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 100. Premere Enter (Invio). 4. Premere Disp. Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 100. Premere Enter (Invio). 5. Premere Mix. Premere la freccia Su fino a quando si visualizza 50. Premere Enter (Invio). 6. Premere Enter (Invio) una seconda volta per memorizzare il programma e uscire. Un bip dovrebbe indicare che la programmazione è completa. 7. Verificare il programma premendo il trigger per avanzare da ciascun passaggio al successivo e impostare per ciascun passaggio le velocità di aspirazione/dispensazione/miscelazione usando il tasto Vol. Ad ogni passaggio appare lindicatore di velocità. Usare il tasto Vol per regolare lindicatore di velocità in modo che visualizzi 2 quadratini per le funzioni di aspirazione e dispensazione. Usare il tasto Vol per regolare la velocità di miscelazione in modo che visualizzi 3 quadratini. Revisione del programma Prima di iniziare la procedura, accendere il pipettatore per rivedere tutti i programmi. Per rivedere i programmi, accendere il pipettatore. Premere il tasto blu Prog. Premere il tasto Vol (Volume) fino a quando viene visualizzato il numero del programma da rivedere. Premere il tasto Enter (Invio). Usare il trigger del pipettatore per avanzare nel programma da un passaggio al successivo. Programma 1 - Questo programma aspira 200 µL e dispensa 150 µL. Il display del pipettatore deve visualizzare quanto segue. Fill 200 µL S II Dispense 150 µL S II Purge - S III Rivedere nello stesso modo il Programma 5. Programma 5 - Questo programma aspira 100 µL; dispensa 100 µL e miscela 50 µL tre volte. Il display del pipettatore deve visualizzare quanto segue. Fill 100 µL S II Dispense 100 µL S II Mix 50 µL S III Zero (lampeggia) C. Layout delle piastre Il rapporto di layout delle piastre viene generato dallo strumento BD ProbeTec ET una volta caricati nel sistema il tipo(i) di dosaggio, lidentificazione del campione, i numeri di lotto dei controlli e i numeri di lotto dei kit. Il rapporto di layout delle piastre mostra la disposizione fisica dei campioni e dei controlli per ciascuna piastra da analizzare. Questo orientamento viene usato sia per la piastra di micropozzetti di priming che per la piastra di micropozzetti di amplificazione. I micropozzetti di priming per il dosaggio per DTB sono disposti su strisce bianche compatte. I micropozzetti di amplificazione sono disposti su strisce arancione rigate. D. Preparazione dei controlli del dosaggio NOTA - Prima delluso, il diluente e i controlli BD ProbeTec ET per DTB, il tampone di lisi per DTB 2 e il tampone di neutralizzazione per DTB 3 devono essere a temperatura ambiente. Usare i tamponi precedentemente aliquotati per la preparazione dei campioni. Mescolare accuratamente prima delluso. 1. Per ciascuna serie (piastra) da analizzare, preparare una provetta di controllo negativo DTB e una provetta di controllo positivo per DTB. Se la piastra contiene reagenti DTB con numeri di lotto diversi, occorre testare i controlli per ciascun lotto. 2. Stappare la provetta di controllo negativo. a. Usando la pipetta con un nuovo puntale, dispensare 100 µL di tampone di lisi per DTB 2. b. Usando la pipetta con un nuovo puntale, dispensare 600 µL di tampone di neutralizzazione per DTB 3. 44 3. Richiudere bene la provetta con il tappo e agitare con vortex per 5 secondi. 4. Stappare la provetta di controllo positivo. a. Usando la pipetta con un nuovo puntale, dispensare 100 µL di tampone di lisi per DTB 2. b. Usando la pipetta con un nuovo puntale, dispensare 600 µL di tampone di neutralizzazione per DTB 3. 5. Richiudere bene la provetta con il tappo e agitare con vortex per 5 secondi. 6. Disporre le provette dei controlli nella microcentrifuga con il rotore standard. Chiudere con il coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi. Rimuovere le provette dalla centrifuga e disporle nel supporto trasparente per pipettaggio. E. Procedura di analisi 1. Rimuovere ed eliminare i tappi delle provette portacampioni e portacontrolli da usare per il primo ciclo di analisi. 2. CAMBIARE I GUANTI. 3. Preparare la piastra di micropozzetti priming come indicato nel rapporto di layout delle piastre. 4. Procedere come segue per richiudere e sigillare le buste dei micropozzetti di priming. a. Mettere la busta su una superficie piatta. Appiattire con una mano lestremità aperta. b. Mantenendo la pressione, far scorrere un dito lungo lesterno della chiusura, da un margine allaltro della busta. c. Assicurarsi che la busta sia sigillata. 5. Selezionare il Programma 1 sul pipettatore BD ProbeTec ET. 6. Sollevare i puntali delle pipette. Tirare completamente in fuori la manopola spaziatrice per espandere il pipettatore. NOTA - Per evitare perdite, assicurarsi che i puntali siano ben fissati sul pipettatore. NOTA - Nellaspirare i campioni, fare attenzione ad evitare di catturare pellet residui che potrebbero ostruire i puntali delle pipette e compromettere i risultati del test. 7. Aspirare 200 µL dalla prima colonna di campioni. 8. Abbassare con attenzione il pipettatore, portare i puntali delle pipette a contatto con le pareti dei pozzetti e dispensare 150 µL nella prima colonna di micropozzetti di priming (1A-H). NOTA - Per garantire accuratezza e precisione e per evitare la contaminazione crociata, è importante dispensare i liquidi contro le pareti interne dei micropozzetti. 9. Eliminare i puntali. Premere il grilletto di pipettaggio per reimpostare il pipettatore. 10. Prendere dei nuovi puntali, espandere il pipettatore e aspirare 200 µL dalla seconda colonna di campioni. 11. Abbassare con attenzione il pipettatore, portare i puntali delle pipette a contatto con le pareti dei pozzetti e dispensare 150 µL nella seconda colonna di micropozzetti di priming (2A-H). NOTA - Per evitare la contaminazione, non abbassare il pipettatore sui campioni o sui micropozzetti. I movimenti bruschi possono causare la dispersione di goccioline o aerosol. 12. Eliminare i puntali. NOTA - Eliminare con attenzione i puntali per evitare la dispersione di goccioline o aerosol che potrebbero contaminare larea di lavoro. 13. Continuare a trasferire gli altri campioni della serie. 14. Coprire la piastra di micropozzetti di priming con il rispettivo coperchio e lasciarla incubare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti. (Lincubazione può essere protratta fino a 6 ore.) NOTA - Richiudere con tappi nuovi i campioni trattati. CAMBIARE I GUANTI. 15. Al termine dellincubazione della piastra di priming, preparare la piastra di micropozzetti di amplificazione. Configurare i micropozzetti di amplificazione in una piastra, in modo che corrisponda alle indicazioni del rapporto di layout delle piastre (come per la piastra di priming). Richiudere e sigillare le buste dei micropozzetti di amplificazione come descritto al passaggio 4. 16. Togliere il coperchio dalla piastra di micropozzetti di priming e trasferirla nellincubatore di priming. Mettere IMMEDIATAMENTE la piastra di micropozzetti di amplificazione nellincubatore per pre-riscaldarla. 17. Impostare il cronometro su 10 minuti. (NOTA - Per questo passaggio, il tempo è di importanza critica.) 18. Trascorsi i 10 minuti (+/- 1 min.) di incubazione, selezionare il Programma 5 sul pipettatore. 19. Sollevare immediatamente i puntali delle pipette e trasferire 100 µL dalla colonna 1 dei micropozzetti di priming alla colonna 1 dei micropozzetti di amplificazione. Portare i puntali delle pipette a contatto con le pareti dei pozzetti e dispensare il liquido. Dopo la dispensazione, lasciare che il pipettatore mescoli automaticamente il liquido nei pozzetti. 20. Eliminare i puntali. Sollevare dei nuovi puntali e continuare a trasferire la miscela reattiva dai micropozzetti di priming ai micropozzetti di amplificazione, una colonna alla volta, usando nuovi puntali per ciascuna colonna. 21. Una volta trasferita lultima colonna, rimuovere la pellicola protettiva dal sigillante di amplificazione. (Un sigillante di amplificazione [1/2] può coprire un massimo di 6 colonne; se la piastra ha più di 6 colonne, è NECESSARIO usare un foglio intero di sigillante.) Afferrare per i bordi il foglio di sigillante e applicarlo sui micropozzetti, servendosi delle guide che si trovano sullincubatore. Premere sul sigillante per assicurarsi che tutti i micropozzetti siano completamente sigillati. 45 22. Sullinterfaccia utente BD ProbeTec ET, estrarre il portapiastre e aprire lo sportello e il coperchio della piastra. IMMEDIATAMENTE (entro 30 secondi) trasferire la piastra sigillata di micropozzetti di amplificazione allo strumento BD ProbeTec ET e iniziare il ciclo di analisi. (Per spiegazioni dettagliate, consultare il Manuale duso del sistema BD ProbeTec ET.) 23. Una volta iniziato il ciclo, completare la fase seguente della procedura di pulizia. a. Sigillare la piastra dei micropozzetti di priming con il sigillante di amplificazione e rimuoverla dallincubatore per riscaldamento e priming. (Per rimuovere la piastra, usare guanti resistenti al calore, in quanto la temperatura supera i 70 ºC.) b. Lasciar raffreddare la piastra sul banco per 5 minuti. Eliminare i micropozzetti di priming in un contenitore per rifiuti a rischio biologico. c. Pulire la piastra metallica. Sciacquare la piastra con ipoclorito di sodio all1% (v/v) contenente Alconox. Sciacquare la piastra con acqua distillata o deionizzata. Avvolgerla quindi in un telo pulito e lasciarla asciugare completamente prima di riutilizzarla. 24. Al termine del ciclo verranno stampati i risultati del test. 25. Estrarre il portapiastre dalla stazione, aprire lo sportello e rimuovere la piastra. Chiudere lo sportello e rimettere il portapiastre nello strumento. 26. Togliere dalla piastra i micropozzetti di amplificazione sigillati. ATTENZIONE - Non rimuovere dai micropozzetti il materiale sigillante. Per rimuovere tutti insieme i micropozzetti sigillati, afferrare la parte superiore e inferiore del sigillante e sollevare il tutto fuori dalla piastra. Mettere i micropozzetti sigillati nella busta per rifiuti e sigillarla. Sigillare la piastra. 27. Pulire la piastra metallica. Sciacquare la piastra con ipoclorito di sodio all1% (v/v) contenente Alconox. Sciacquare la piastra con acqua distillata o deionizzata. Avvolgerla quindi in un telo pulito e lasciarla asciugare completamente prima di riutilizzarla. 28. Dopo lultimo ciclo della giornata, eseguire le seguenti procedure di pulizia. a. Pulire le superfici del banco da lavoro con ipoclorito di sodio all1% (v/v) contenente Alconox. Lasciare la soluzione sulle superfici da lavoro per 23 minuti e poi ripassare con acqua distillata o deionizzata. b. Per pulire il cestello per provette portacampioni e il supporto trasparente per pipettaggio, immergerli in ipoclorito di sodio all1% (v/v) contenente Alconox per non oltre 60 secondi. Sciacquare abbondantemente con acqua distillata o deionizzata e lasciare asciugare allaria. c. Pulire le superfici esterne dellincubatore per riscaldamento e priming e dello strumento BD ProbeTec ET con ipoclorito di sodio all1% (v/v) contenente Alconox. Ripassare poi le superfici con acqua distillata o deionizzata. d. Pulire limpugnatura del pipettatore (SOLO LIMPUGNATURA) con ipoclorito di sodio all1% (v/v) contenente Alconox. Ripassare poi con acqua distillata o deionizzata e asciugare con un asciugamano pulito. e. Ricaricare il pipettatore. f. Eliminare la busta dei rifiuti sigillata e il materiale a rischio biologico in osservanza delle procedure stabilite per lo smaltimento dei rifiuti contaminati. Controllo di qualità Il set di controlli BD ProbeTec ET per DTB viene fornito separatamente. Includere un controllo positivo e un controllo negativo in ogni ciclo di dosaggio e in ogni kit di reagenti con un nuovo numero di lotto. La disposizione dei controlli può essere casuale. Il controllo positivo per DTB serve solo per il monitoraggio dei fallimenti del reagente, del completamento delle fasi essenziali delle procedure (pipettaggio e incubazione), dellamplificazione e dellindividuazione. Il controllo negativo per DTB serve per il monitoraggio della contaminazione del reagente e/o dellambiente. Per la validità dei risultati dei campioni, i risultati dellanalisi del controllo per DTB positivo e del controllo per DTB negativo devono essere rispettivamente positivo e negativo. Se i controlli non si comportano come previsto, il dosaggio viene considerato non valido e lo strumento non include i risultati nel referto del paziente. Se il controllo di qualità non è conforme ai risultati previsti, ripetere lintero ciclo di analisi utilizzando un nuovo set di controlli, nuovi micropozzetti e i campioni preparati. Se anche quando viene ripetuto, il controllo di qualità non fornisce i risultati previsti, rivolgersi allassistenza tecnica (vedere Interpretazione dei risultati). Per le istruzioni sulla preparazione dei controlli, consultare la sezione D della PROCEDURA DI ANALISI. Una volta preparati i controlli, proseguire con lanalisi come descritto nella sezione E della PROCEDURA DI ANALISI. Allinterno del micropozzetto è integrato un controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control IAC). Il controllo interno di amplificazione contiene un target di acido nucleico che viene amplificato in presenza della matrice del campione. Questo controllo serve a confermare la validità della reazione di amplificazione e ad identificare una possibile inibizione da parte del campione analizzato. Controllo della preparazione dei campioni Per testare lefficacia della preparazione dei campioni, occorre analizzare di routine un controllo procedurale, in osservanza delle disposizioni locali. Il controllo procedurale è composto da una sospensione di M. tuberculosis, (ad es., American Type Culture Collection, H37Ra ATCC 25177). Preparare la sospensione nel modo seguente. 1. Preparare una sospensione dellorganismo secondo lo standard 1 McFarland. 2. Diluire la sospensione McFarland 1:100 in albumina bovina (FractionV), (ad es., pipettare 0,1 mL di sospensione McFarland in 9,9 mL di albumina bovina e mescolare accuratamente). 46 3. Le aliquote da 1,0 mL possono essere congelate a -20 ºC o a temperatura inferiore (senza ciclo temporizzato). 4. Preparare le sospensioni cellulari come campione di routine da analizzare con il sistema BD ProbeTec ET. Monitoraggio della presenza di contaminazione da DNA Prima di eseguire per la prima volta il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB e successivamente almeno una volta al mese, effettuare la seguente procedura di analisi per individuare leventuale presenza di contaminazione da DNA sulle superfici dellarea di lavoro e delle attrezzature. Questo monitoraggio dellambiente è indispensabile per individuare la contaminazione prima che insorgano problemi. 1. Usare un tampone CultureSwab EZ per ciascuna area* da analizzare. 2. Etichettare una provetta portacampioni per ciascuna area da campionare con il tampone e pipettare in ogni provetta 100 µL di tampone di lisi per DTB 2 e 600 µL di tampone di neutralizzazione per DTB 3. 3. Intingere il primo tampone nella miscela tampone contenuta nella provetta portacampioni e passarlo sulla prima area muovendolo in varie direzioni. 4. Mescolare il tampone nella miscela tampone, comprimerlo, richiudere con il tappo la provetta e agitare con vortex per 5 secondi. Eliminare i tamponi. 5. Ripetere questo passaggio per ciascuna area campionata con tampone. 6. Disporre le provette del cestello per provette portacampioni e riscaldarle nel forno (Sezione C della PROCEDURA DI PREPARAZIONE DEL CAMPIONE). 7. Mentre le provette si riscaldano, usare dei teli puliti imbevuti di acqua per rimuovere la miscela tampone residua dalle superfici campionate con il tampone. 8. Dopo il riscaldamento, disporre le provette nella microcentrifuga con il rotore standard, chiudere con il coperchio e centrifugare ad impulsi per 10 secondi. 9. Rimuovere le provette dalla centrifuga ed esaminarne i tappi alla ricerca di eventuale condensato. Se si nota la presenza di condensato, ripetere la centrifugazione. 10. Rimettere le provette nel supporto trasparente per pipettaggio e proseguire con la PROCEDURA DI ANALISI. *Le aree da testare raccomandate includono: la superficie del forno, il bagno ad ultrasuoni, il cestello per provette portacampioni da 2 mL, il supporto trasparente per pipettaggio, lincubatore per riscaldamento e priming, le piastre di micropozzetti nere, limpugnatura del pipettatore, i tasti a sfioramento dello strumento, la tastiera dello strumento e il banco da lavoro. Se per una delle aree si ottiene un risultato positivo, pulirla con una soluzione fresca di ipoclorito di sodio all1% (v/v) e Alconox. Assicurarsi che la soluzione di candeggina copra lintera area e resti sulla superficie per almeno 2 minuti o fino a quando si asciuga. Se necessario, rimuovere leccesso di soluzione di candeggina con un telo pulito. Passare sullarea un telo pulito e imbevuto di acqua deionizzata o distillata e lasciare quindi asciugare la superficie. Ripetere lanalisi dellarea interessata fino a quando si ottengono risultati negativi. Se la contaminazione persiste, rivolgersi allassistenza tecnica per ulteriori informazioni. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Risultato del dosaggio DTB Rapporto consigliato Positivo Dosaggio con sonda positivo per la presenza di DNA del complesso M. tuberculosis. Coltura di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli AFB) ancora non determinata. Negativo Dosaggio con sonda negativo per la presenza di DNA del complesso M. tuberculosis. Coltura di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli AFB) ancora non determinata. Indeterminato Ripetere il dosaggio con sonda del campione preparato Se il risultato dellanalisi ripetuta è positivo o negativo, usare linterpretazione pertinente come descritto qui sopra. Se il risultato ripetuto è indeterminato, riportare Sia il dosaggio iniziale che quello ripetuto hanno fornito risultati indeterminati. Analizzare un nuovo campione. Coltura di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli AFB) ancora non determinata. LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA 1. Questo metodo è stato testato solo con campioni delle vie respiratorie, come lespettorato (indotto o escreato), i lavaggi broncoalveolari e laspirato bronchiale e tracheale. Non ne sono state valutate le prestazioni con altri campioni. 2. Un risultato negativo non esclude la possibilità che la concentrazione dellorganismo bersaglio sia inferiore alla sensibilità del test. 3. Come per altri test diagnostici, i risultati del dosaggio per DTB devono essere interpretati contestualmente agli altri dati clinici e di laboratorio a disposizione del medico. 4. Il dosaggio per DTB non differenzia i componenti del complesso M. tuberculosis - M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti. 5. Per fornire prestazioni ottimali, questo dosaggio richiede una tecnica corretta di prelievo e manipolazione dei campioni. 6. È necessario seguire le condizioni di centrifugazione specificate, in quanto una centrifugazione insufficiente può dar luogo a risultati falsi negativi. 47 7. Il dosaggio per DTB non riconosce le varianti del complesso M. tuberculosis in cui manca sequenza di inserzione IS6110. 8. Il dosaggio per DTB deve essere usato esclusivamente da personale che abbia ricevuto una preparazione adeguata per effettuare la procedura di dosaggio e utilizzare il sistema BD ProbeTec ET. 9. Il dosaggio DTB non può essere usato per valutare il successo o linsuccesso terapeutico, in quanto la presenza di acidi nucleici da organismi del complesso Mycobacterium tuberculosis può persistere anche dopo la terapia antibiotica. 10. Il dosaggio DTB non sostituisce i metodi di coltura quando lobiettivo è di analizzare la suscettibilità antibatterica 11. Il dosaggio DTB fornisce risultati qualitativi. Quindi non esiste alcuna correlazione tra lentità del valore MOTA (Method Other Than Acceleration Metodo diverso dallaccelerazione) e il numero di cellule presenti in un campione positivo. 12. La sequenza della sonda del complesso M. tuberculosis IS6110, è specifica per M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, e M. microti. 13. Il dosaggio per DTB riconosce le varianti di specie micobatteriche non tubercolari che possono contenere la sequenza IS6110. 14. Il valore predittivo del dosaggio dipende dalla prevalenza della malattia in una data popolazione. 15. Non sono stati determinati gli effetti di altre potenziali variabili, come la terapia antibiotica o i campioni coinfettati. RISULTATI PREVISTI Presso due centri di ricerca clinica in diverse aree geografiche, 1157 campioni prelevati da 986 pazienti sono stati analizzati con il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB. Una distribuzione di frequenza dei valori MOTA iniziali è illustrata nella Figura 1. I risultati del dosaggio BD ProbeTec ET per DTB sono presentati a confronto con i risultati di TB di riferimento e con gli strisci di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli AFB). Per risultato di TB di riferimento è stato considerato un reperto di coltura micobatterica o la diagnosi del paziente in base alla cartella clinica. La presenza o lassenza del complesso Mycobacterium tuberculosis viene determinata confrontando i valori BD ProbeTec ET per DTB MOTA dei campioni con valori soglia predefiniti. Il MOTA è un valore metrico usato per valutare lintensità del segnale generato dalla reazione. Lentità del valore MOTA non è indicativa del livello di organismi nel campione. Tutti i calcoli vengono eseguiti automaticamente dal software dello strumento. I campioni analizzati presso i due centri sono stati identificati con il dosaggio BD ProbeTec ET come positivi, negativi o indeterminati. Solo un campione ha fornito un risultato indeterminato allanalisi originale ed è poi risultato negativo quando il test è stato ripetuto. 48 Figura 1 - Frequenza di distribuzione dei valori MOTA per DTB 900 800 792 700 Frequenza 600 500 400 300 200 184 100 82 3 6 2 ≥ 80.000 36 1 40.000 59.999 60.000 79.999 12 20.000 39.999 < 3.400 0 10 3.400 19.999 31 TB di riferimento () TB di riferimento (+) DTB MOTA Risultato degli strisci e TB di riferimento Striscio Striscio Striscio Striscio (+) TB (+) (+) TB () () TB (+) () TB () 0 3.399 3.400 19.999 2 18 29 774 20.000 39.999 1 0 11 10 19 1 17 0 40.000 59.999 60.000 79.999 144 1 40 5 60 0 22 1 ≥ 80.000 1 0 1 0 PRESTAZIONI METODOLOGICHE Valutazione clinica Il dosaggio BD ProbeTec ET per DTB è stato valutato presso due centri in diverse aree geografiche in cui la prevalenza della tubercolosi era compresa tra il 9,2% e il 34,1%. Con il dosaggio per DTB sono stati analizzati 1157 campioni prelevati da 986 pazienti e i risultati sono stati confrontati al quelli ottenuti da coltura micobatterica. I risultati del dosaggio BD ProbeTec ET per DTB sono illustrati nella Tabella 1 (per campione) e nella Tabella 2 (per paziente). I risultati sono separati in base alla condizione dello striscio Per classificare un paziente vengono utilizzati tutti i campioni prelevati da quel paziente. Il numero di campioni per paziente è compreso tra uno e tre. Un paziente con uno o più risultati positivi per DTB viene considerato come DTB positivo. Un paziente con uno o più risultati di coltura positiva per il complesso MTB viene considerato come coltura-positivo. Tabella 1 - Risultati per DTB rispetto a risultati iniziali da coltura - per campione Risultati per DTB (+) () Risultati dello striscio Coltura (+) Coltura () Striscio (+) 223 4 Striscio () 88 19 Striscio (+) 2 18 Striscio () 29 774 Tabella 2 - Risultati per DTB rispetto ai risultati iniziali da coltura - per paziente Risultati per DTB (+) () Risultati dello striscio Coltura (+) Striscio (+) 192 Coltura () 3 Striscio () 82 16 Striscio (+) 2 17 Striscio () 23 651 Si sono verificati 54 risultati discrepanti per DTB rispetto a quelli da coltura iniziale. Per stabilire una diagnosi per tutti i risultati discrepanti sono state utilizzate le cartelle cliniche dei pazienti. Per risultato di TB di riferimento è stato considerato un reperto di coltura micobatterica o la diagnosi del paziente in base alla cartella clinica. I risultati del dosaggio BD ProbeTec ET per DTB rispetto ai risultati di TB di riferimento sono illustrati nella Tabella 3 (per campione) e nella Tabella 4 (per paziente). I risultati sono separati in base alla condizione dello striscio. 49 Tabella 3 - Risultati per DTB rispetto ai risultati di TB di riferimento - per campione Risultati per DTB (+) () Risultati dello striscio TB di riferimento (+) TB di riferimento () Striscio (+) 225 2 Striscio () 91 16 Striscio (+) 2 Striscio () 29 8 774 Tabella 4 - Risultati per DTB rispetto ai risultati di TB di riferimento - per paziente Risultati per DTB (+) () Risultati dello striscio TB di riferimento (+) Striscio (+) 193 TB di riferimento () 2 Striscio () 83 15 Striscio (+) 2 17 Striscio () 23 651 I parametri delle prestazioni previste sono illustrati nella Tabella 5, rispetto ai risultati da coltura iniziale e ai risultati di TB di riferimento. I parametri di sensibilità sono separati in base ai risultati dello striscio. Tabella 5 - Prestazioni previste del dosaggio per DTB BD ProbeTec ET rispetto ai risultati da coltura Sensibilità totale 90,9% Sensibilità striscio (+) 99,1% Sensibilità striscio () 75,2% BD ProbeTec ET rispetto ai risultati di TB di riferimento Sensibilità totale 91,1% Specificità 97,2% Sensibilità striscio (+) 99,1% Sensibilità striscio () 75,8% Specificità 97,8% Studi analitici Precisione I pannelli di precisione sono stati analizzati presso tre centri (due esterni e uno interno). Ciascun pannello ha incluso due campioni negativi, due campioni con bassa positività (95 CFU/mL) e due campioni con positività relativamente alta (1000 CFU/mL). I campioni positivi sono stati preparati aggiungendo ad un pool di sedimento NALC-NaOH negativo aliquote note di Mycobacterium tuberculosis. I campioni sono stati testati in triplicato in sei diversi cicli di analisi. In ogni ciclo è stato incluso un controllo di dosaggio positivo e uno negativo. Non essendo stata osservata una variabilità significativa tra i centri o da un giorno allaltro, i dati forniti da tutti i centri sono stati combinati e sono presentati nella Tabella 6. Tabella 6 Campione Positività moderatamente elevata (+) Bassa positività (+) Negativo () No. di osservazioni 108 108 108 % corretta 100 97,2 99,1 Sensibilità del test Il limite di rilevamento (LOD) del dosaggio per DTB viene definito come il numero minimo di target di acido nucleico riconoscibile dal sistema il 95% delle volte. È stato determinato che questo limite di rilevamento corrisponde a 204 copie della sequenza target IS6110 per reazione. Questa sequenza di inserzione può essere presente negli organismi del complesso Mycobacterium tuberculosis in un massimo di 23 copie per organismo. Quando sono stati analizzati 31 isolati appartenenti al complesso, il limite di rilevamenti è risultato pari a nove CFU per reazione o 125 CFU/mL. Il limite inferiore di sensibilità per uno striscio di batteri alcol-acido resistenti (acid-fast bacilli AFB) è di circa 1 x 104 CFU/mL. Specificità analitica La specificità del dosaggio per DTB è stata valutata analizzando centoventi (120) organismi a concentrazioni tra 106 e 108 CFU/mL. Questi organismi, che possono essere o non essere presenti nei campioni delle vie respiratorie, includevano 66 batteri, 39 micobatteri non tubercolari, sei lieviti e miceti e nove virus. Nessuno degli organismi testati ha evidenziato una reazione crociata con il dosaggio per DTB e non si è verificata alcuna inibizione del riconoscimento del controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control IAC). Sostanze interferenti Sono state analizzate con il dosaggio per DTB le sostanze potenzialmente interferenti reperibili nei campioni delle vie respiratorie. Le sostanze potenzialmente interferenti sono state valutate in assenza dellorganismo target. Nessuna delle sostanze testate ha evidenziato interferenza con il dosaggio per DTB e non si è verificata alcuna inibizione del riconoscimento del controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control IAC). 50 Sostanza analizzata Sangue intero (2,5%10%) Leucociti umani (100050.000 WBC/µL*) Lidocaina (2%) Spray fenolico per la gola (0,02 x dose normale) Soluzione per induzione di espettorato (3% NaCl) Farmaci antiasmatici (quattro volte la dose normale) Farmaci antitubercolari (nove volte la dose normale) Farmaci antiretrovirali (tre volte la dose normale) *I campioni contenenti ≥ 50.000 WBC/µL possono causare la separazione del sedimento NALC-NaOH durante la decantazione. DISPONIBILITÀ N. di cat. Descrizione 440610 Confezione di reagenti BD ProbeTec ET per lidentificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB), 96 test. Kit BD ProbeTec ET per la preparazione dei campioni per lidentificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB). Set di controlli BD ProbeTec ET per lidentificazione diretta del complesso Mycobacterium tuberculosis (DTB). Kit di accessori BD ProbeTec ET (copri priming, sigillanti per amplificazione e buste per rifiuti, 20 di ciascuno). Puntali per pipette, 6 x 120. Provette portacampioni e tappi BD ProbeTec ET, 2 mL, 200 per confezione. Tappi per provette portacampioni BD ProbeTec ET, 2 mL, 200 per confezione. Cestello per provette portacampioni BD ProbeTec ET, 2 mL. Supporto trasparente per pipettaggio. Strumento BD ProbeTec ET. Incubatore per priming e riscaldamento BD ProbeTec ET (120V). Pipettatore BD ProbeTec ET. Forno BD ProbeTec ET. Bagno ad ultrasuoni BD ProbeTec ET (90110 V c.a.). Kit di decontaminazione/digestione dei campioni BBL MycoPrep, dieci flaconi da 75 mL di soluzione NALC-NaOH e 5 confezioni di tampone fosfato. Kit di decontaminazione/digestione dei campioni BBL MycoPrep, dieci flaconi da 150 mL di soluzione NALC-NaOH e 10 confezioni di tampone fosfato. 440643 440631 440457 440458 440661 440679 440681 440698 440478 440480 440487 440680 440687 240862 240863 RIFERIMENTI Vedere la sezione References nel testo inglese. 51 AVAILABILITY Cat. No. Description 440610 440643 BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack, 96 tests. BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit. BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Control Set. BD ProbeTec ET Accessories Kit (20 Primer covers, Amplification sealers and Disposal bags). Pipette Tips, 6 x 120. BD ProbeTec ET Sample Tubes and Caps, 2 mL, 200/pk BD ProbeTec ET Sample Tube Caps, 2 mL 200/pk. BD ProbeTec ET Sample Tube Rack, 2 mL. Clear Pipetting Rack. BD ProbeTec ET Instrument. BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (120V). BD ProbeTec ET Pipettor. BD ProbeTec ET Oven. BD ProbeTec ET Sonic Bath (90110 VAC). BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, ten 75 mL bottles of NALC-NaOH solution and 5 packages of phosphate buffer. BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, ten 150 mL bottles of NALC-NaOH solution and 10 packages of phosphate buffer. 440631 440457 440458 440661 440679 440681 440698 440478 440480 440487 440680 440687 240862 240863 REFERENCES 1. Kent, P.T., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. USDHHS, Centers for Disease Control, Atlanta. 2. Bloom, B.R., and C.J.L.Murray. 1992. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer. Science 257:1055-1064. 3. Tenover, F.C., et al, 1993. The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? J. of Clin. Microbiol. 31:767-770. 4. Wayne, L.G. 1982. Microbiology of tubercle bacilli. Am. Rev. Respir. Dis. 12 (Suppl):31-41. 5. Isenberg, H.D. 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