ricerca di legionella

Numero 18
novembre 2010
ANALISI DELLE ACQUE AD USO UMANO: RICERCA DI LEGIONELLA
Legionella spp, batterio responsabile di una forma acuta di polmonite, deve il suo nome
all’epidemia che nel 1976 colpì un gruppo di veterani dell’American Legion a Filadelfia.
Microrganismo ubiquitario, è principalmente associato alla presenza di acqua: è stato isolato in
ambienti idrici naturali (laghi e corsi d’acqua, sorgenti termali, falde idriche ed ambienti umidi in
generale) ed artificiali (impianti idrici, fontane, piscine, vasche idromassaggio, impianti di
condizionamento). L’infezione si trasmette attraverso l’inalazione degli aerosol contenenti il
batterio.
Legionella pneumophila, ed in particolare il serogruppo 1, è responsabile della maggioranza dei
casi.
Le condizioni che ne favoriscono lo sviluppo sono:
- temperatura compresa tra 25 e 45°C
- situazioni di ristagno dell’acqua
- presenza di biofilm
- presenza di elementi in tracce (ferro in particolare).
Va comunque tenuto presente che Legionella sopravvive anche in condizioni
ambientali sfavorevoli, sotto forma di parassita di protozoi ciliati ed amebe.
Dal punto di vista microbiologico, Legionella viene definita come un microrganismo Gramnegativo, in grado di crescere in non meno di 2 giorni su terreno tamponato contenente
estratto di lievito, carbone, L-cisteina e ferro, formando colonie spesso bianche, viola-blu o
verdastre. La crescita in genere non si osserva in assenza di L-cisteina.
Le colonie assumono un aspetto caratteristico a vetro smerigliato se osservate con
stereomicroscopio a bassa intensità. Alcune colonie sviluppano fluorescenza se sottoposte a
luce UV.
Queste caratteristiche vengono tenute in considerazione per la ricerca e l’identificazione di
Legionella nei campioni analizzati.
La Normativa di Riferimento originaria per la ricerca di Legionella nelle acque
ad uso umano con la tecnica della membrana filtrante è la ISO 11731: 1998,
attualmente in revisione. Nel 2004 è stata inoltre introdotta la ISO 117312:2004, valida soltanto per acque con una bassa contaminazione batterica.
In questo numero affronteremo separatamente le procedure previste dalle due normative di
riferimento, dando infine spunti pratici in riferimento ai materiali da utilizzare.
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PROCEDURA DI ANALISI SECONDO ISO 11731-1998
La procedura che vedremo di seguito può essere applicata a tutti i tipi di campioni ambientali di
acque, incluse acque potabili, industriali e naturali, ed alle matrici associate (sedimenti, depositi e
fanghi).
RACCOLTA, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
L’acqua da analizzare (in genere in volume pari a 1 litro) va campionata in
bottiglie sterili, nella quali va aggiunto, in caso di acque clorate, potassio o
sodio tiosolfato.
E’ buona norma analizzare l’acqua raccolta immediatamente, preferibilmente
il giorno stesso del campionamento; questo è tanto più importante per quei
campioni contenenti cloro o altri disinfettanti.
Considerando che spesso il luogo di campionamento è distante dal luogo in cui viene effettuata
l’analisi, il trasporto deve essere fatto in modo da minimizzare i tempi (non più di due giorni), ad
una temperatura compresa tra i 6 e i 18 °C , al riparo dalla luce e dal calore.
Una volta arrivato in laboratorio, il campione va analizzato entro 2 giorni dalla sua raccolta,
possibilmente non oltre i 5 giorni, mai oltre i 14 giorni, conservandolo a 6±2°C .
La temperatura di conservazione del campione appare particolarmente critica in quanto incide
sulla conta vitale del microrganismo, che può aderire alle pareti del contenitore o modificare le sue
caratteristiche di crescita. In campioni conservati tra 0 e 6°C si evidenzia una diminuzione del
numero di microrganismi vitali, mentre la crescita viene stimolata a temperature superiori ai 20°C.
Perciò, per minimizzare queste modifiche, la temperatura di conservazione pari a 6±2°C appare
quella preferibile.
PROCEDURA DI ANALISI
Il campione viene inizialmente concentrato, sottoponendolo a filtrazione su membrana o a
centrifugazione. Quindi, viene suddiviso in tre aliquote: due vengono sottoposte ad un trattamento
di decontaminazione (con acido o con calore), per abbattere l’ eventuale flora interferente; una
verrà invece utilizzata tal quale. Successivamente, i campioni vengono trasferiti su piastra con
agar selettivo per Legionella ed incubati.
Dopo l’incubazione, vengono valutate le caratteristiche morfologiche delle colonie formatesi. Le
colonie sospette vengono quindi sottoposte alle prove di conferma.
Possiamo schematizzare, suddividendo la procedura in cinque fasi principali:
1.
2.
3.
4.
5.
Concentrazione del campione
Decontaminazione
Crescita su terreno selettivo
Esame delle piastre dopo incubazione
Test di conferma
Concentrazione del campione
Questa rappresenta la fase più delicata della procedura, in quanto va ad influenzare in modo
significativo il recovery finale del microrganismo.
Può essere utilizzata la tecnica di filtrazione su membrana o la centrifugazione
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-Filtrazione su membrana
Il campione di acqua viene filtrato sterilmente attraverso una membrana di
nylon o policarbonato, con diametro da 47 mm a 142 mm e pori di 0.22 o
0.45 µm. Si utilizza a questo scopo un sistema filtrante collegato ad una
pompa a vuoto, avendo cura di sterilizzare in autoclave la membrana, se non
sterile, posizionata nel blocco filtrante. Se il concentrato ottenuto dopo
filtrazione risulta comunque torbido o colorato, è preferibile utilizzare la
tecnica di centrifugazione.
Dopo filtrazione, la membrana viene posta in un contenitore sterile con tappo a vite. Per garantire il
recupero di tutti i microrganismi, si aggiungono 5-25 ml di diluente sterile (soluzione salina di
Page o Ringer) o di acqua campione, quindi si agita vigorosamente per almeno 2 minuti,
eventualmente dopo aver anche sminuzzato la membrana con forbici sterili.
In alternativa, il contenitore può essere sottoposto a trattamento con ultrasuoni da 2 a 10 min,
assicurandosi che il livello del diluente sia al di sotto del livello dell’acqua presente nel bagnetto a
ultrasuoni.
Si può anche utilizzare un terzo metodo, che prevede il raschiamento della membrana: in questo
caso, la membrana può essere posta in capsula petri (da 60 mm se la membrana ha diametro 47
mm) con 5-10 ml di diluente sterile o di acqua campione; quindi, con l’aiuto di bacchette sterili a
punta arrotondata, si procede per almeno due volte al raschiamento dell’intera superficie, per
garantire il recupero di tutti i microrganismi dalla membrana.
-Centrifugazione
Questa tecnica è utilizzabile per piccole quantità di campione (circa 200 ml) o quando il
concentrato ottenuto dopo filtrazione risulta comunque torbido.
Il campione viene posto in un contenitore sterile con tappo a vite e centrifugato a 6000 g per 10
min o a 3000 g per 30 min, mantenendo la temperatura tra 15 e 25°C. Il supernatante viene
rimosso, mentre il sedimento viene risospeso in 2-20 ml di diluente e rappresenta il campione
concentrato da analizzare di seguito.
Decontaminazione
Questa procedura è necessaria per eliminare la flora interferente e va condotta suddividendo il
campione concentrato precedentemente in tre aliquote: una da utilizzare tal quale, una da
sottoporre a trattamento termico, una da sottoporre a trattamento con acido.
Per il trattamento termico, è sufficiente porre una piccola porzione (1 ± 0.5 ml) di campione
concentrato in un contenitore sterile e sottoporlo a riscaldamento (50±1°C) in bagnetto per 30
min.
Per il trattamento con acido, si possono utilizzare due metodiche:
-centrifugare il campione (1-10 ml) come visto sopra, quindi eliminare la metà del surnatante e
risospendere il sedimento sottoponendolo a vigorosa agitazione. Rimpiazzare poi con un apposito
tampone acido il volume eliminato ed lasciare fermo il tutto per 5 min dopo leggero mescolamento
-più semplicemente, utilizzare un apposito tampone acido 10x e diluirlo direttamente 1:10 con il
campione, ottenendo così una soluzione a pH 2.2; quindi lasciare fermo per 5 min.
Crescita su terreno selettivo
Aliquote di 01-0.5 ml di ciascuno dei tre campioni vanno inoculate su piastre con
terreno selettivo GVPC agar, distribuendole uniformemente con una spatola
sterile. I campioni trattati vanno inoculati immediatamente dopo la fine del
trattamento acido o termico.
Le piastre vanno poi incubate a 36+/-1°C per 10 giorni . Per evitare la disidratazione delle piastre
durante questo periodo è bene porre sul fondo dell’incubatore un vassoio con acqua. La presenza
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di CO2 (2.5%) durante l’incubazione può migliorare la crescita di alcuni ceppi di Legionella ma non
è essenziale.
Esame delle piastre dopo incubazione
E’ bene esaminare le piastre con microscopio bioculare in almeno tre occasioni durante il periodo
di incubazione, a intervalli di 2-4 giorni. Legionella cresce infatti lentamente è può essere
mascherata dalla crescita di altri microrganismi.
Le colorazioni assunte dalle colonie delle varie specie possono essere molto
diverse: generalmente bianche o grigie, ma anche blu, porpora, marroni, rosa,
verdognole o rosso scuro. Osservate allo stereomicroscopio con luce incidente
a bassa intensità, tutte però mostrano il caratteristico aspetto a vetro
smerigliato.
Molte specie, osservate con microscopio a UV (ad una lunghezza d’onda di 360 2+/-nm), emettono
fluorescenza con colori caratteristici per ogni specie. Per evitare l’uccisione delle colonie è bene
però sottoporre le piastre alle radiazioni UV per il minimo tempo necessario.
Test di conferma
Per confermare le colonie sospette si sfrutta la capacità di Legionella di crescere solo in terreno
con cisteina. A questo scopo, si selezionano casualmente per ogni campione almeno 3 colonie
sospette, per effettuare una subcoltura di ognuna in BCYE agar e in BCYE-Cys agar (stesso
terreno ma privo di cisteina). In alternativa al BCYE-Cys agar, può essere utilizzato Nutrient Agar o
Blood Agar. L’incubazione va poi effettuata a 36+/-2°C per almeno 2 giorni , confermando infine
come Legionella le colonie che crescono solo in BCYE agar.
Fanno eccezione Legionella oakridgensis e Legionella spiritensis, che richiedono L-cisteina e ferro
per l’isolamento primario ma possono crescere debolmente anche in assenza di cisteina.
Possono essere poi utilizzati vari metodi di conferma addizionali per l’identificazione delle specie di
Legionella presenti: cromatografia gas-liquido, immunofluorescenza, agglutinazione al lattice tra
questi.
PROCEDURA DI ANALISI SECONDO ISO 11731-2:2004
La procedura che vedremo di seguito è valida soltanto per acque con una bassa
contaminazione batterica, in quanto la sovrapposizione di altri microrganismi sulle membrane
filtranti renderebbe difficoltosa la ricerca di Legionella, inibendone la crescita.
Il campione viene sottoposto innanzitutto a filtrazione su membrana per essere concentrato. La
procedura di filtrazione prevede anche una fase di lavaggio del filtro con un apposito tampone
acido, per minimizzare la crescita di flora interferente. Quindi, il trasferimento su piastra con agar
selettivo per legionella e l’incubazione.
Dopo l’incubazione, vengono valutate le caratteristiche morfologiche delle colonie formatesi. Le
colonie sospette vengono quindi sottoposte alle prove di conferma
Possiamo schematizzare suddividendo la procedura in quattro fasi principali:
1.
2.
3.
4.
Filtrazione del campione con decontaminazione
Crescita su terreno selettivo
Esame delle piastre dopo incubazione
Subcultura per conferma delle colonie
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Filtrazione del Campione con decontaminazione
Il campione viene sottoposto a filtrazione utilizzando preferibilmente
membrane nere in esteri di cellulosa, con diametro 47 mm e pori 0.45
µm, con griglia.
Visto che la crescita di Legionella sarebbe inibita dalla presenza di altri
microrganismi sulla membrana, la filtrazione prevede anche un lavaggio della
membrana filtrante con tampone acido per abbattere la flora batterica
presente.
Si procede come segue:
-sottoporre il campione a filtrazione utilizzando un sistema filtrante collegato ad una pompa a
vuoto, ponendo il lato quadrettato della membrana verso l’alto
- dopo la filtrazione del campione, bloccare il flusso e aggiungere direttamente nel bicchiere di
filtrazione 30± 5 ml di tampone acido, lasciando agire a contatto con la membrana per 5 minuti
E’ fondamentale che tutta l’area interessata venga ben lavata con il tampone per evitare che si
mantengano aree potenzialmente contaminate
-riaprire il flusso e consentire la filtrazione del tampone
-lavare la membrana con 20+/- 5 ml di soluzione salina di Page
Crescita su terreno selettivo
La membrana va rimossa dall’apparato di filtrazione con pinzette sterili e posta
direttamente su piastre con BCYE agar o GVPC agar, facendola ben aderire al
terreno in modo da evitare la formazione di bolle d’aria.
Le piastre vanno poi incubate a 36+/-2°C per 10 giorni . Per evitare la disidratazione
delle piastre durante questo periodo è bene porre sul fondo dell’incubatore un
vassoio con acqua o, in alternativa, incubare le piastre in buste di plastica o contenitori chiusi.
La presenza di CO2 (2.5%) durante l’incubazione può migliorare la crescita di alcuni ceppi di
Legionella ma non è essenziale.
Esame delle piastre dopo incubazione
E’ bene esaminare le piastre con microscopio bioculare almeno due volte, cominciando dal giorno
3 o 4 di incubazione, registrando le colonie sospette
Rispetto alla crescita diretta su agar, la crescita su membrana ha alcune caratteristiche peculiari:
-Legionella cresce più lentamente;
-le colonie che si formano sono più piccole;
-alcune specie possono non crescere affatto
Come visto precedentemente, le colorazioni assunte dalle colonie delle varie specie possono
essere molto diverse: generalmente bianche o grigie, ma anche blu, porpora, marroni, rosa,
verdognole o rosso scuro. Osservate allo stereomicroscopio con luce incidente a bassa intensità,
tutte però mostrano il caratteristico aspetto a vetro smerigliato.
Molte specie, osservate con microscopio a UV (ad una lunghezza d’onda di 360
2+/-nm), emettono fluorescenza con colori caratteristici per ogni specie. Per
evitare l’uccisione delle colonie è bene però sottoporre le piastre alle radiazioni UV
per il minimo tempo necessario.
Conferma delle colonie sospette
Anche in questo caso, per confermare le colonie sospette si sfrutta la capacità di Legionella di
crescere solo in terreno con cisteina. A questo scopo, si selezionano casualmente per ogni
campione almeno 5 colonie sospette, per effettuare una subcoltura di ognuna in BCYE agar e in
BCYE-Cys agar (stesso terreno ma privo di cisteina). In alternativa al BCYE-Cys agar, può essere
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utilizzato Nutrient Agar o Blood Agar. Se sono presenti diversi tipi di Legionella, vanno selezionate
almeno due colonie per tipo. L’incubazione va poi effettuata a 36+/-2°C per almeno 2 giorni ,
confermando infine come Legionella le colonie che crescono solo in BCYE agar.
Fanno eccezione Legionella oakridgensis e Legionella spiritensis, che richiedono L-cisteina e ferro
per l’isolamento primario ma possono crescere debolmente anche in assenza di cisteina.
Come test addizionale di conferma, può essere utilizzato il test di agglutinazione al lattice, in
grado di rilevare specificamente Legionella pneumophila (serogruppo 1 e serogruppi 2-16) e le
altre specie di Legionella più comuni.
CONTROLLO QUALITA’ DEI TERRENI
Entrambe le normative rivolgono una particolare attenzione alla qualità dei terreni selettivi utilizzati,
con particolare riguardo ai loro ingredienti (l’alfa-chetoglutarato nel BCYE, ad esempio). Anche
piccole variazioni da lotto a lotto possono infatti influenzare la performance del terreno. Perciò è
importante che su ogni lotto nuovo di terreno venga effettuato il test di fertilità seguendo la
crescita di Legionella pneumophila ser. 1 a 36+/-2°C per 3 giorni .
Si utilizzano a questo scopo in parallelo piastre di GVPC agar per le quali sia già stata verificata
la fertilità con il ceppo di Legionella indicato e piastre di GVPC agar appartenenti al nuovo lotto.
Si può procedere in due modi:
- inoculare su entrambe un campione di acqua contaminato con Legionella
- utilizzare un ceppo liofilizzato standard di Legionella pneumophila ser. 1 e coltivarlo su
BCYE agar per ottenere un ceppoteca da utilizzare poi per i test di fertilità. Sospendere in glycerol
broth una quantità di colonie tale da ottenere una torbidità visibile ad occhio nudo ed aliquotare la
sospensione in volumi da 1 ml per conservarla a -20+/-5°C; piastrare un’aliquota della
sospensione su BCYE agar per effettuare i test di identificazione delle specie di Legionella
presenti. Possono essere utilizzate subcolture con un massimo di 10 passaggi dalla coltura
stock.
Per l’utilizzo, riportare una o più aliquote a temperatura ambiente, agitarle dolcemente, lasciarle
ferme 5-10 minuti e inoculare il volume necessario (ad esempio 0.1 ml) sulle piastre di GVPC da
verificare.
Dopo l’incubazione delle due piastre di GVPC agar, comparare i risultati verificando il numero di
colonie e la loro morfologia.
MATERIALI
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di afferrare l'estremo bordo della membrana evitando il danneggiamento
dell'area di campionamento.
Test di agglutinazione al lattice, per la conferma di Legionella pneumophila ser. 1
o ser. 2 e di Legionella spp.
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campionamento acque, con e senza sodio tiosolfato, sterili
irraggiati
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