1°lab - SDS

1° laboratorio Biochimica – Laurea in Scienze Biologiche
SDS-PAGE, colorazione gel e calcolo del peso molecolare di una proteina
GEL POLIACRILAMIDE
Running gel (10%):
H2O
Acrilamide
1,5 M Tris pH 8,8
SDS
TEMED (catalizzatore)
APS (iniziatore)
TOT
Stacking gel:
H2O
Acrilamide
1 M Tris pH 6,8
SDS
TEMED
APS
3,8 ml
2 ml
2 ml
0,08 ml (80 ul)
0,008 ml (8 ul)
0,08 ml (80 ul)
8 ml
Tempo di polimerizzazione: circa 8-10 minuti
TOT
2,3 ml
0,3 ml (300) ul
0,38 ml (380 ul)
0,03 ml (30 ul)
0,005 ml (5 ul)
0,03 ml (30 ul)
3 ml
Tempo di polimerizzazione: circa 6-8 minuti
Loading buffer (Buffer di preparazione dei campioni):
Soluzioni
SDS
Glicerolo
Tris pH 6,8
H2O
Blu di bromofenolo
Concentrazione finale 1X
2%
10%
60 mM
Funzione
Carica negativa proteine
Addensante
Sistema tampone
Tracciante elettroforetico
Preparazione campione e ordine campioni: 20 ul campione in Loading buffer
1 – Marcatore di PM (3 ul)
2 – 0,125 mg/ml  1,25 ng in 20 ul caricati
3 – 0,25 mg/ml  2,5 ng in 20 ul caricati
4 – 0,5 mg/ml  5 ug in 20 ul caricati
5 – 1 mg/ml  10 ug in 20 ul caricati
Preparazione dei campioni:
Corsa elettroforetica: 200 V per 45 minuti
Taglio del gel:
Colorazione (Blu di Coomassie):
- 3 lavaggi da 5 minuti con H2O
- Aggiunta 6 ml di colorante
(incubazione 25 minuti)
- 1 lavaggio da 15 minuti con H2O
uffer di corsa:
- Tris 25 mM
- Glicina 200 mM
- SDS 0,1%
Determinazione PM della proteina e interpretazione dei risultati
I dati ottenuti in laboratorio dalla colorazione del gel ci consentono di calcolare la distanza
percorsa da ogni banda del marcatore e risalire, quindi, al peso molecolare della proteina
incognita caricata inizialmente.