Capitolo 5 Materiali e metodi

Capitolo 5
Materiali e metodi
5.1
Animali
Gli esemplari di gambero di fiume turco, Astacus leptodactylus, della lunghezza di circa 10–12 cm, sono stati acquistati da un rivenditore locale il
quale li importa direttamente dal luogo di allevamento in Turchia.
5.2
Stabulazione
Dopo un periodo di acclimatazione di una settimana, nel quale gli animali vivevano in vasche da 120 litri, e venivano nutriti ogni due giorni, sono
state separate le femmine dai maschi e le prime divise in tre gruppi, omogenei per grandezza, e numerate. Ogni gruppo sperimentale è stato messo
in un’apposita vasca separata dalle altre e della capacità di 70 litri ciascuna.
Ciascun animale chiuso in un ulteriore gabbia formata da rete plastica della grandezza di 30x30 cm. L’isolamento di ciascun animale permetteva una
distribuzione omogenea del mangime e quindi una standardizzazione dell’a-
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Materiali e metodi
limentazione, nonchè un miglior controllo degli animali, in caso ad esempio
di muta coincidente (mutando carapace gli individui perdono la marcatura e
quindi non sono riconoscibili). La circolazione dell’acqua nelle tre vasche era
continua, con un flusso di circa 10 litri all’ora. L’acqua era di provenienza
diretta dall’acquedotto e non veniva previamente trattata, la temperatura
era costante sui 16–18◦ C. I fotoperiodo artificiale era regolato su 10 ore di
luce e 14 di oscurità.
5.3
Alimentazione
I gamberi venivano alimentati ogni due giorni alternativamente con i due
mangimi della Sera, Viformo e O-Nip. La dose individuale era di un tab, o
pastiglia, ciascuno, distribuzione omogenea resa possibile dall’isolamento di
ciascun individuo in gabbie singole.
5.4
Trattamento
Le femmine, sono state divise in tre gruppi omogenei: controlli, epeduncolate e trattate con anticorpo antiGIH. Ad ogni gruppo appartenevano 12
individui circa della stessa grandezza (10–12 cm). Gli animali sono stati misurati e numerati (mediante pennarello indelebile sul dorso del carapace). Il
trattamento è iniziato con l’epeduncolazione e le prime iniezioni di ormone
il 23 maggio e si è concluso il 14 luglio, data dell’ultimo prelievo e della dissezione degli animale per prelevare ovari e epatopancreas.
Iniezioni e prelievi di emolinfa venivano effettuati con siringhe sterili da
1 ml nel tessuto sottostante le giunture tra i segmenti addominali.
5.4 Trattamento
5.4.1
55
Epeduncolati monolateralmente
Gli individui da epeduncolare sono stati messi previamente in ghiaccio
per alcuni minuti onde indurre uno stato di anestesia. Quindi si è proceduto
alla rimozione del peduncolo (per scelta sempre quello destro) tramite taglio
effettuato mediante forbicine sterili. Il taglio veniva operato alla base del
peduncolo stesso per eliminare tutte le strutture sedi della sintesi ormonale. Così operati i gamberi venivano rimessi immediatamente in acqua nelle
rispettive gabbie senza nessun ulteriore trattamento per favorire la cicatrizzazione. A parte i prelievi settimanali gli animali appartenente a questo
gruppo non erano soggetti ad ulteriori trattamenti.
5.4.2
Trattati con anticorpo antiGIH
L’anticorpo utilizzato è un anticorpo policlonale sviluppato in coniglio
contro GIH di scampo, Nephrops norvegicus [20]. La concentrazione iniziale
dello stesso era di 50 µg su millilitro.
Tre volte a settimana gli animali del gruppo venivano iniettati con una
soluzione di 4 µl di anticorpo portati a 100 µl in PBS (concentrazione finale
di 2 µg/ml). Esattamente come gli altri due gruppi subivano un prelievo
di emolinfa una volta alla settimana. I prelievi avvenivano immediatamente
prima delle iniezioni.
5.4.3
Controlli
Al gruppo di controllo venivano iniettati 100 µl di PBS tre volte la settimana (il lunedì, il mercoledì ed il venerdì) esattamente come al gruppo dei
trattati veniva iniettato l’anticorpo. Ad ogni componente ciascun gruppo una
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Materiali e metodi
volta alla settimana (il mercoledì) venivano prelevati circa 500 µl di emolinfa
(il prelievo veniva effettuato prima delle iniezioni).
5.5
Mortalità
Dei 12 individui di partenza di ciascun gruppo ne sono rimasti 9 nel gruppo di controllo (mortalità del 25%), 10 nel gruppo dei trattati con l’ormone
(mortalità del 16.67%) mentre nessun animale del gruppo degli epeduncolati
è morto durante l’esperimento.
5.6
Prelievo dell’emolinfa
Una volta alla settimana (il mercoledì) ai gamberi di ciascun gruppo veniva prelevata l’emolinfa nella quantità di circa 500 µl. In seguito a centrifugazione (12.000 giri per 1 minuto), necessaria per separare la parte cellulare
responsabile della coagulazione, il surnatante veniva diviso in due aliquote,
facendo attenzione ad eliminare il pellet. All’aliquota destinata all’analisi
elettroforetica veniva aggiunta un’antiproteasi ed entrambi i campioni venivano, previa etichettatura, conservati a -20◦ C fino al successivo utilizzo. Alla
fine sono stati raccolti nove campioni di emolinfa per ciascun gambero nelle seguenti date: 23/05, 27/05, 03/06, 10/06, 17/06, 24/06, 01/07, 08/07,
14/07.
5.7 Dissezione
5.7
57
Dissezione
Alla fine del trattamento tutti gli animali soggetti alla sperimentazioni
sono stati sacrificati, per poter effettuare la pesatura degli ovari e degli epatopancreas. Una parte di questi organi è stata pure prelevata e conservata in
fissativo Bouin, acido picrico in soluzione acquosa satura, formalina ed acido
acetico glaciale (15:5:1), per eventuali analisi microscopiche in caso di risultati evidenti. Per lo stesso motivo sono stati prelevati anche un peduncolo
dai controlli e dai trattati nonchè quello restante degli epeduncolati.
5.8
Analisi chimica dell’emolinfa
Le analisi chimiche per determinare le concentrazioni nell’emolinfa, di
proteine, glicemia, colesterolo e trigliceridi, sono state effettuate con lo strumento Screen Point della Hospitex Diagnostics che si basa su un sistema di
lettura fotometrica. I reagenti da utilizzare si trovano già in fase predosata e
l’unica accortezza risiede nella taratura dello strumento prima dell’utilizzo.
La misura della densità è stata fatta tramite rifrattometro ottico.
5.9
Analisi elettroforetica dell’emolinfa
L’analisi elettroforetica dell’emolinfa è stata condotta con due metodologie, l’SDS-PAGE e il PhastSystemTM .
Gli standard di peso molecolare utilizzati sono stati: miosina (200 kDa),
β-galattosidasi (116.3 kDa), fosforilasi B (97.4 kDa), albumina del siero bovina (BSA) (66.3 kDa), glutammico deidrogenasi (55.4 kDa), lattico deidro-
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Materiali e metodi
genasi (36.5 kDa) e carbonico deidrogenasi (31.0 kDa).
Quando necessario, per eventuali confronti, ai campioni degli individui
femmina da analizzare è stato aggiunto anche un campione di emolinfa prelevata da un maschio della stessa specie.
5.10
SDS-PAGE
L’SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis, elettroforesi in gel di
poliacrilammide) permette, denaturando le proteine con il detergente anionico sodio dodecil solfato (SDS), la separazione delle stesse esclusivamente
sulla base delle dimensioni delle catene polipeptidiche, quindi sul loro peso
molecolare. Le condizioni denaturanti separano inoltre le varie subunità che
costituiscono le proteine.
5.10.1
Preparazione del gel
Stacking gel (4%)
1.272 ml H2 O
500 µl Tris HCl 0.5M pH 6.8
20 µl SDS 10%
200 µl Acryl/Bis 40% (37.5:1)
4 µl TEMED
4 µl APS 25%
2 ml volume finale
5.10 SDS-PAGE
Running gel (7.5%)
2.748 ml H2 O
1.25 ml Tris HCl 1.5M pH 8.8
50 µl SDS 10%
0.937 ml Acryl/Bis 40% (37.5:1)
5 µl TEMED
10 µl APS 25%
5 ml volume finale
5.10.2
Tamponi
SDS Running Buffer (10X)
30 g Tris Base
144 g Glicina
10 g SDS
1 l volume finale
Sample Buffer (2X)
10 ml Tris HCl 0.5M pH 6.8
8 ml Glicerolo
16 ml SDS 10%
59
60
Materiali e metodi
0.937 ml Acryl/Bis 40% (37.5:1)
4 ml β-mercapto-etanolo
200 µl BBF 0.05%
2 ml H2 O
40 ml volume finale
5.10.3
Preparazione dei campioni
I campioni di emolinfa a cui era stata aggiunta antiproteasi sono stati
scongelati e portati alla diluizione scelta (1/20) in PBS. Quindi si è aggiunto
un egual volume di Sample Buffer 2X e sono stati bolliti per 8 minuti. In
ciascun pozzetto venivano caricati 5 µl di campione così preparato.
5.10.4
Corsa elettroforetica
Il voltaggio applicato per lo stacking era di 80V e veniva mantenuto per
circa 30 minuti. Per il running era invece di 120V e la corsa veniva protratta
per 80 minuti circa. In ogni caso le valutazioni sui tempi necessari si facevano
osservando il fronte di migrazione (colorante presente nel buffer).
5.11
Colorazione argentica
L’uso di questa tecnica di colorazione è stato reso necessario in quanto
risulta molto sensibile a concentrazioni basse di proteina. L’uso di alte diluizioni di emolinfa, e di conseguenza basse concentrazioni di proteina, è dovuto
5.11 Colorazione argentica
61
al fatto che la maggior parte delle proteine dell’emolinfa è data dall’emocianina che durante elettroforesi migra in una grossa banda, tra i 70 e gli 80
kDa circa, che tende a coprire le bande delle altre proteine.
5.11.1
Protocollo colorazione argentica
100 ml di fissativo per 10’
100 ml milliQ per 5’
100 ml milliQ per 5’
100 ml 0,02% Na2 S2 O3 per 1’
100 ml milliQ per 20”
100 ml milliQ per 20”
100 ml 0,1% AgNO3 per 10’
100 ml milliQ per 30”
50 ml di sviluppo per 30”
100 ml di sviluppo per 1-3’1
100 ml acido citrico 0,115M per 10’
100 ml milliQ per 10’
100 ml milliQ per 30’
fissativo:
1
in base allo sviluppo desiderato
62
Materiali e metodi
• 40% alcool metilico;
• 13,5% formalina.
sviluppo:
• 3% sodio carbonato;
• 0,05% formalina;
• 0,000016% Na2 S2 O3 .
Le quantità di reagenti usati permettono la colorazione di un gel alla volta. Aggiunti i reagenti il gel va mantenuto in continuo movimento tramite
agitatore. La fase dello sviluppo viene bloccata al raggiungimento della colorazione desiderata aggiungendo il bloccante (acido citrico) direttamente alla
soluzione di svuluppo2 .
5.11.2
Protocollo SilverQuestTM Silver Staining Kit
100 ml milliQ per 3”
100 ml di fissativo per 20’
30 ml etanolo, 70 ml milliQ per 10’
30 ml etanolo, 70 ml milliQ per 10’
30 ml etanolo, 10 ml sensibilizzante, 60 ml milliQ per 10’
30 ml etanolo, 70 ml milliQ per 10’
100 ml milliQ per 30”
2
lo sviluppo non viene bloccato immediatamente
5.12 PhastSystemTM
63
100 ml milliQ per 10’
1 ml colorante, 99ml milliQ per 15’
100 ml milliQ per 1’
10 ml di sviluppo, 1 goccia di enhancer, 90 ml milliQ per 4-8’3
10 ml di bloccante per 10’4
100 ml milliQ per 10’
Le quantità di reagenti indicate sono necessarie per la colorazione di un solo
gel alla volta. E’ indispensabile l’utilizzo contenitori di vetro bel lavati e il
mantenimento in costante agitazione del gel durante tutti i passaggi.
5.12
PhastSystemTM
Il sistema PhastSystemTM della Pharmacia permette una separazione elettroforetica e successiva colorazione automatizzate e rapide. Lo strumento è
composto da due unità, la Separation and Control Unit, che permette la separazione elettroforetica nonchè la programmazione dei vari passaggi, e la
Developing Unit, dove avviene la colorazione dei gel.
5.12.1
Elettroforesi
I gel di poliacrilammide del sistema PhastGelTM sono già pronti e misurano 43 x 50 x 0.45 mm, si sono utilizzati supporti PhastGel Homogeneous 7.5
3
4
in base allo sviluppo desiderato
aggiunto direttamente allo sviluppo
64
Materiali e metodi
(concentrazione omogenea di poliacrilammide al 7.5%). Il buffer è sostituito
da dei blocchi di agarosio, PhastGel Buffer Strips SDS (0.20 M tricina, 0.20
M Tris, 0.55% SDS, pH 8.1 ). Il programma di separazione utilizzato è quello
standard per gel SDS al 7.5%.
I campioni, fino ad 8 per ogni gel, venivano depositati con gli appositi
applicatori capaci di caricare sul gel contemporaneamente 1 µl di ciascun
campione. La preparazione dei campioni era identica a quella per l’SDSPAGE (paragrafo 5.10.3), cambiava solo la diluizione dell’emolinfa, in questo
caso era di 1 a 30 sempre in PBS.
La corsa, non essendo sempre ben distinguibile il fronte di migrazione,
veniva fermata al raggiungimento di 60 AVh (dopo circa 30 minuti).
5.12.2
Colorazione argentica
Protocollo per la colorazione argentica modificato e basato sul PhastGelTM
Silver Kit da utilizzare con il PhastSystemTM . Il PhastSystemTM presenta
una celletta dove possono essere colorati fino a due gel alla volta. I reagenti
vengono pompati nella cella tramite appositi tubi direttamente dalle bottiglie
e tenuti alla temperatura voluta per il tempo necessario (il tutto è programmabile dall’unità di controllo).
50 ml etanolo, 10 ml acido acetico, 40 ml milliQ a 50◦ C per 2’
33.3 ml glutaraldeide 25%, 66.7 ml milliQ a 50◦ C per 6’
100 ml milliQ a 50◦ C per 2’
100 ml milliQ a 50◦ C per 2’
5.13 Analisi statistica
65
0.25 g AgNO3 , 100 ml milliQ a 40◦ per 13’
100 ml milliQ a 30◦ C per 30”
100 ml milliQ a 30◦ C per 30”
5 g sodio carbonato, 50 µl formaldeide 37%, 200 ml milliQ a 30◦ C per 30”
5 g sodio carbonato, 50 µl formaldeide 37%, 200 ml milliQ a 30◦ C per 4’
5 ml acido acetico, 95 ml milliQ a 50◦ C per 2’
2.5 ml glicerolo, 10 ml acido acetico, 87.5 ml milliQ a 50◦ C per 3’
Le soluzioni vanno preparate di volta in volta per evitare precipitazioni
ed eventuali contaminazioni (per la pulizia dei tubicini il sistema prevede
infatti un risciacquo che avviene direttamente nelle soluzioni utilizzate).
5.13
5.13.1
Analisi statistica
Test t di Student
Questo particolare test viene utilizzato per il confronto delle medie di due
campioni dipendenti con una differenza attesa (nel nostro caso confronti tra
due gruppi con due trattamenti diversi o tra un controllo e un trattamento).
Sono condizioni di validità della distribuzione t di Student, e quindi dei test
che la utilizzano: che la distribuzione dei dati sia normale e che le osservazioni
siano raccolte in modo indipendente. Condizioni sempre verificate prima
della sua applicazione. Il metodo utilizzato prevede la distribuzione a due
code e richiede la condizione di omoschedasticità, cioè che le due varianze
66
Materiali e metodi
siano statisticamente uguali. I campioni sono dipendenti in quanto i dati
sono auto-appaiati (misure effettuate sullo stesso animale).
5.13.2
ANOVA
L’analisi della varianza (ANOVA, ANalysis Of VAriance) ad un criterio
di classificazione, o ad una via, permette il confronto simultaneo tra le medie
di più di due gruppi, formati da soggetti sottoposti a trattamenti differenti o
con dati raccolti in condizioni diverse. Al fine di evidenziare tutte le possibili
differenze significative tra le medie non è corretto ricorrere al test t di Student
per ripetere l’analisi tante volte quante sono i possibili confronti a coppie
tra i singoli gruppi. Con il metodo del t di Student si utilizza solo una
parte dei dati e la probabilità α prescelta per l’accettazione dell’ipotesi nulla,
la probabilità di commettere l’errore di rifiutare l’ipotesi nulla quando in
realtà è vera, è valida solamente per ogni singolo confronto. Se i confronti
sono numerosi, la probabilità complessiva che almeno uno di essi si dimostri
significativo solo per effetto del caso è maggiore [64]. L’ANOVA permette
il confronto simultaneo tra le medie, mantenendo invariata la probabilità α
complessiva prefissata.
Se in base all’analisi della varianza si rifiuta l’ipotesi nulla (identità delle
medie), è interessante verificare tra quali medie la differenza sia significativa.
Per effettuare confronti singoli è appropriato l’utilizzo del test di Tukey o
HSD (Honestly Significant Difference) test.
5.14 Software utilizzato
5.14
67
Software utilizzato
L’analisi statistica dei dati è stata effettuata con il programma OriginLab OriginPro 7.5, mentre l’elaborazione dei grafici è stata realizzata con il
programma SigmaPlot 9.0.
Per l’estrapolazione dei dati relativi ai pesi molecolari delle proteine separate con i due metodi elettroforetici si è utilizzato il software ImageJ 1.36b.
Le immagini sono state create o modificate con Adobe Photoshop CS2.
Questa tesi è stata scritta e compilata con LATEX 2ε .