diastat anti-ro - Technogenetics

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diastat anti-ro - Technogenetics
BEIA Rubella IgG Quant
22294
Edizione
20/04/2013
Solo per uso professionale
TECHNOGENETICS SRL
N° 00502
Pag. 1 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA Rubella IgG Quant è un test immunoenzimatico
quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma
degli anticorpi di classe IgG specifici verso il virus Rubella.
SIGNIFICATO CLINICO
La rosolia è causata da un virus RNA classificato come rubeovirus
appartenente alla famiglia dei togavirus. L'infezione puo' essere
asintomatica o provocare un modesto esantema. Se contratta
durante la gravidanza causa la "rosolia congenita" che può
provocare seri danni al feto. La maggior parte dei casi di rosolia
congenita si verifica come conseguenza di un’infezione materna
primaria, anche se sono segnalati casi estremamente rari di rosolia
congenita in nati da madri con pregressa immunità, quindi in
conseguenza di reinfezioni. Come conseguenza di una infezione
materna al I trimestre si può avere aborto, morte fetale, infezione
placentare, ma può anche non verificarsi alcuna infezione del feto.
La placenta costituisce una valida barriera all’infezione fetale dalla
12ª alla 28ª settimana di gestazione, mentre la protezione è meno
valida al I e III trimestre (in particolare nell’ultimo mese di
gravidanza) e di conseguenza il virus può causare un’infezione
placentare persistente anche senza infezione fetale. La sindrome
della rosolia congenita (SRC) non è una malattia statica. E' stato
dimostrato che ¾ dei bambini infetti sono asintomatici alla nascita e
solo successivamente presenteranno delle sequele. La diagnosi si
basa su indagini sierologiche e colturali dal momento che la
sintomatologia clinica non permette di porre diagnosi di certezza. La
ricerca di anticorpi (IgG ed IgM) può essere fatta in tempi molto
rapidi mediante latex-agglutinazione, emoagglutinazione passiva,
immunofluorescenza o metodi immunoenzimatici. La presenza di
IgG indica uno stato di immunità. La presenza di IgM a titoli elevati
o moderati permette di porre diagnosi di infezione recente, tuttavia
a basso titolo le IgM possono essere presenti anche in casi di
reinfezione. La diagnosi in gravidanza risulta molto facilitata se è
noto lo stato immunitario pregravidico; se questo dato non è
Pag. 2 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
disponibile è comunque opportuno avere un dato all’inizio della
gravidanza. Non esiste alcuna terapia specifica dell’infezione in
atto, né alcuna possibilità di prevenire la trasmissione maternofetale del virus nel caso di infezione in gravidanza. Tentativi di
trattamento della SRC con vari farmaci (interferon, amantidina,
isoprinosina) non hanno mostrato un’effettiva utilità. La
vaccinazione per la rosolia costituisce l’unica strategia efficace per la
prevenzione della rosolia congenita.
Il dosaggio delle IgG è pertanto utile per distinguere gli individui
che hanno già contratto l'infezione da quelli non immuni.
La determinazione delle IgG e IgM specifiche rappresenta un test di
I livello.
Nel caso di positività alle IgM / IgG, in alcuni casi è necessario
procedere ad ulteriori indagini eseguendo test di II livello quali il
test dell'Avidità.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA Rubella IgG Quant è un dosaggio immunoenzimatico
in micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con
l'antigene Rubella. I campioni da esaminare vengono incubati nei
micropozzetti; le IgG del campione si legano formando un
complesso antigene-anticorpo. Dopo eliminazione mediante
lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la
presenza di IgG anti-Rubella viene rilevata attraverso il legame con
un anticorpo monoclonale anti-IgG coniugato con perossidasi.
Dopo allontanamento del coniugato enzimatico non legato viene
aggiunto il substrato-TMB che, per azione dell’enzima presente sulla
fase solida, sviluppa una colorazione azzurra.
L’aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione
e provoca il viraggio del colore dall’azzurro al giallo.
La densità ottica letta a 450/620 è direttamente proporzionale alla
quantità di IgG specifiche presenti nel campione in esame.
Nei kit BEIA Rubella IgG Quant la concentrazione degli anticorpi
di classe IgG viene calcolata mediante l'utilizzo di una curva di
calibrazione ed espressa in in Unità Internazionali/mL (Unità
Internazionali/mL – 2nd British Standard cod. 67/182)
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CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CAL
0
B
Calibratore 0 (0 UI/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibratore 1 ( 8 UI/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
Calibratore 2 ( 25 UI/mL)
1 x 2 mL
CAL
3
C3
Calibratore 3 ( 75 UI/mL)
1 x 2 mL
CAL
4
C4
Calibratore 4 ( 250 UI/mL)
1 x 2 mL
DIL
SPE
D
Diluente Campioni BEIA System
1 x 120 mL
E
Coniugato
1 x 13,5 mL
CONJ
BUF
WASH 20X
F
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
SUBS
TMB
G
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
H
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
Istruzioni per l’uso
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
E.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con Rubella virus inattivato, in busta
ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta
e richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli.
Calibratore 0 UI/ml
Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-Rubella. Contiene
0,09%
p/p
di
sodio
azide
come
conservante.
Reagente pronto all’uso.
Calibratori 8, 25,75 e 250 UI/mL
Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgG antiRubella. Contengono 0,09% p/p di sodio azide come
conservante. Reagenti pronto all’uso.
Diluente Campioni BEIA System
Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09%
p/p di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente
pronto all’uso.
Coniugato
Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-IgG umane,
marcato con perossidasi. Reagente pronto all’uso.
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F.
Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene
0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti.
G. Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante
(rosa). Reagente pronto all’uso.
H. Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all’uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata
sull’etichetta.
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il SubstratoTMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit
della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI





Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µL.
Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI

Prima dell’uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l’analisi.
Pag. 5 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013








Evitare l’essiccamento dei micropozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione
del campione.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA).
Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni
possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario, aliquotare i
campioni e congelarli a -20°C. Evitare ripetuti scongelamenti e
congelamenti. Si sconsiglia l’uso di campioni lipemici, torbidi ed
emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il
Diluente Campioni BEIA System prima del dosaggio. Vedi
esecuzione del test.
Pag. 6 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Tampone di Lavaggio
Diluire il tampone di Lavaggio (20x) con acqua distillata o
deionizzata prima dell’uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile
15 giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la
data di scadenza riportata sull’etichetta originaria. Nel Tampone di
Lavaggio concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che
si solubilizzano portando il reagente a 37°C prima della diluizione.
Si raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per
eseguire i lavaggi dell’analisi in corso.
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti
al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
1.
2.
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti
a 18-25°C).
Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni
BEIA System (esempio 10 µL di siero e 800 µL di Diluente
Campioni BEIA System). Agitare su Vortex.
Prelevare il numero di strip necessario per l’analisi in funzione
del numero di campioni in esame e dei Calibratori (vedi il
paragrafo “Schema del dosaggio”). Richiudere accuratamente la
busta. Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero
in esame prediluito e dei Calibratori.
Pag. 7 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
3.
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
4. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
5. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Coniugato.
6. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
7. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
8. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
9. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 15
minuti.
10. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
pozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
11. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :

il rapporto tra la DO del Calibratore 4 (250 UI/mL) e la DO del
Calibratore 1 (8 UI/mL) deve essere > 3.0.

il rapporto tra la DO del Calibratore 0 (0 UI/mL) e la DO del
Calibratore 1 (8 UI/mL) deve essere < 0.6.
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di
Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di
instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al
laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed
alla gestione di eventuali non conformità.
CALCOLO DEI RISULTATI
Calcolare la media dei valori di densità ottica per ogni calibratore e
campione (i duplicati dovrebbero presentare un CV minore del
20%).
Pag. 8 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
Elaborare la curva di calibrazione riportando la media delle densità
ottiche di ogni calibratore sull’asse delle ordinate e le corrispondenti
concentrazioni sull’asse delle ascisse. Disegnare la migliore curva
che passi attraverso i punti della calibrazione. Per calcolare la
concentrazione di IgG anti-Rubella di ogni campione riportare il
valore della densità ottica sull’asse delle ordinate e collegare con
una linea retta alla curva di calibrazione. Al punto di intersezione,
collegare con una linea verticale all’asse delle ascisse e leggere il
corrispondente valore di IgG anti-Rubella. Qualora si disponesse di
un sistema di calcolo automatico si consiglia di utilizzare una delle
seguenti funzioni matematiche: spline cubica, iperbolica e lineare
punto a punto. I seguenti valori devono essere considerati solo come
un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti
dall’utilizzatore. Esempio di calcolo con interpolazione spline
cubica:
Calibratori
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Campione A
Campione B
Campione C
UI/mL
0
8
25
75
250
Densità Ottica
0.070
0.338
0.872
1.842
2.771
0.243
0.566
2.677
UI/mL
5.2
15.0
196.1
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
UI/mL
INTERPRETAZIONE
> 15
Il campione è da considerare POSITIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgG anti-Rubella
8
Il campione è da considerare NEGATIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgG anti-Rubella
815
Il campione è da considerare DUBBIO per la
presenza di anticorpi di classe IgG anti-Rubella
Pag. 9 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
Va tenuto presente che:
- il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di
classe IgG. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato
infettivo;
- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo
test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili.
Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello;
1 risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la
ripetizione del test sullo stesso campione; con la
ripetizione del test su un prelievo successivo; col
confronto con un test di riferimento.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ
Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le
prestazioni del kit BEIA Rubella IgG Quant nei confronti di un kit
già immesso sul mercato con prestazioni accettabili (EIA Rubella
IgG).
BEIA
Rubella IgG Quant
+
-
EIA Rubella IgG
+
145
0
0
98
Da questi dati si ottiene:
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Concordanza
100%
100%
100%
Pag. 10 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
LIMITE DI RILEVAZIONE
Prove condotte in replicato sul Calibratore 0 indicano il limite di
rilevazione in 0.3 UI/mL.
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
valutando un campione negativo con concentrazione 6 UI/mL e due
campioni positivi a due concentrazioni 15 UI/mL e 200 UI/mL. I
campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12
sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori
al 10% per il campione negativo ed inferiori al 8% per i due
campioni positivi.
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti
dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgG specifiche.
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA








Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le
operazioni previste per l’esecuzione del test.
Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.
Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.
Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni
indossando guanti monouso e camici.
Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.
Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici
di lavoro eventualmente contaminate.
Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il
dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento
secondo le norme vigenti.
Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell’ambiente di lavoro e degli operatori.
Pag. 11 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati
e trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV.
Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non
possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si
raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare
un medico.
SCHEMA DEL DOSAGGIO












Preparare i reattivi
Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System
Dispensare
100 L di ogni Calibratore (0-250 UI/mL) in doppio
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Coniugato
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Incubare 15 minuti a T.A. (18-25°C)
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Cal 0
Cal 0
Cal 8
Cal 8
Cal 25
Cal 25
Cal 75
Cal 75
2
Cal 250
Cal 250
P1
P2
P3
….
….
….
3
4
….
Pag. 12 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
BEIA Rubella IgG Quant
22294
Version
20/04/2013
For professional use only
TECHNOGENETICS SRL
Pag. 13 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
INTENDED USE
The BEIA Rubella IgG Quant kit is a quantitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgG antibodies to
Rubella virus, in human serum or plasma samples.
CLINICAL RELEVANCE
Rubella is a viral illness caused by a RNA virus classified as
rubeovirus and belonging to the togaviruses family.
Infection can be asymptomatic or can cause a mild rash. Rubella,
contracted during pregnancy causes «congenital rubella» which
poses a serious threat to the fetus.
Most cases of congenital rubella are due to a primary maternal
rubella infection even though rare cases have been reported in
which infants with congenital rubella syndrome were born to
mothers who were reinfected during pregnancy.
Rubella infection in the first three months of pregnancy can lead to
miscarriages, stillbirths, placental infection but it is also possible that
it doesn’t result in any birth defects.
Maternal placenta is a valid barrier to infection from 12 th to 28th
week of pregnancy, while during the first three months infection can
cross it; protection drops again in the third trimester, in particular
during the last month, when rubella virus can cause a persistent
placental infection even though the fetus is not infected.
Congenital rubella syndrome (CRS) is not a static condition. It has
been proved that the 25% of the infected babies appear normal at
birth and have health problems later. Diagnosis can be formulated
against serological and soprino evidence and cannot be based only
on clinical symptoms suggestive of this infection. The determination
of anti-rubella virus antibodies can be easily and quickly performed
by
latex
agglutination,
passive
hemoagglutination,
immunofluorescence or enzyme immunoassays. The presence of
IgG antibodies is indication of an immune condition. High or
moderate titers of IgM antibodies suggest a recent infection
although low IgM titers can also be found in cases of rubella
reinfection.
Pag. 14 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
Diagnosis during pregnancy is easy if there is documented evidence
of immunity state to rubella before pregnancy; women who missed
being tested prior to pregnancy should be tested early during
pregnancy.
There is no effective treatment for rubella during pregnancy, nor
there is an effective way to prevent the likelihood of the illness
passed from the mother to the fetus.
Any attempts of treatment with various drugs such as interferon,
amantidine, soprinosine have proven useless.
Vaccination is the only effective way to prevent rubella in
susceptible women so that their future children will be protected
from the congenital rubella syndrome. The determination of IgG
antibodies is thus useful in order to discriminate immune
individuals from recently infected ones.
The determination of specific IgG and IgM antibodies is a first level
test. If both IgG and IgM antibodies are found, second level test like
the Avidity test should be performed.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA Rubella IgG Quant kit is a quantitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgG
antibodies to Rubella virus, in human serum or plasma.During the
first incubation, only anti-Rubella specific antibodies present in
serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with
the Rubella antigen. After the first incubation the wells are washed
to remove non-reactive serum components. During the second
incubation a monoclonal antibody anti-human IgG conjugated with
horseradish peroxidase (HRP) is added. After a second washing
cycle, a Substrate-TMB solution is dispensed into the wells in order
to detect specific antibodies during a subsequent incubation. The
enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution which
changes to yellow the blue colour developed into the wells. The
amount of colour is directly proportional to the specific IgG antirubella concentration in the patient samples. The calibrator
concentrations are referenced to the 2nd British Standard cod. 67/182
(International Units/mL).
Pag. 15 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Component
SORB
A
Coated Strip
12x8x1
CAL
0
B
Calibrator 0 (0 IU/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibrator 1 ( 8 IU/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
Calibrator 2 ( 25 IU/mL)
1 x 2 mL
CAL
3
C3
Calibrator 3 ( 75 IU/mL)
1 x 2 mL
CAL
4
C4
Calibrator 4 ( 250 IU/mL)
1 x 2 mL
DIL
SPE
D
Sample Diluent BEIA System
1 x 120 mL
E
Conjugate
1 x 13,5 mL
CONJ
BUF
WASH 20X
F
Wash Buffer
1 x 100 mL
SUBS
TMB
G
Substrate-TMB
1 x 13,5 mL
H
Stop Solution
1 x 25 mL
Package Insert
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
E.
F.
Coated strips
Breakable strips coated with inactivated Rubella virus packed in
sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal.
Calibrator 0 IU/mL
Negative human serum for IgG antibodies anti-Rubella. Contains
0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent.
Calibrators 8-25-75-250 IU/mL
Human serum, containing IgG antibodies anti-Rubella with
different known concentrations. Contain 0.09% w/w of Sodium
azide as preservative. Ready to use reagent.
Sample Diluent BEIA System
Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w Sodium
azide and Tween 20. Ready to use reagent
Conjugate
Monoclonal anti-human IgG antibody conjugated with horseradish
peroxidase. Ready to use reagent.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di
Kathon CG and Tween 20. See “Preparation of reagents”.
Pag. 16 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
G.
H.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered
solution. Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution.
Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use
reagents after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop
Solution are common to all BEIA kits.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L .
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
WARNINGS AND PRECAUTIONS







Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use.
Only take the quantity necessary for the assay.
Avoid wells drying.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour,
discard the reagent.
For repeated assays, each time provide for new diluted
samples.
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

Every analytical run should include control samples in order
to validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and
microplate reader are required.
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For
longer storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C.
Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed,
lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be
pre-diluted with Sample Diluent BEIA System prior to assay. See
assay protocol.
PREPARATION OF REAGENTS
Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when
stored at 2-8 °C; in any case, do not use it after expiry date printed
on the original label. If crystallization occurs in the concentrated
Wash Buffer, warm the solution to 37 °C before diluting. Only dilute
the quantity necessary for the assay.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually,
perform the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
Pag. 18 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
3.
4.
5.
Empty the wells
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
ASSAY PROTOCOL
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least
30-60 minutes at 18-25 °C.
1.
Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample Diluent
BEIA System (i.e. 10 µL of serum and 800 µL of Sample Diluent
BEIA System). Shake on Vortex.
2.
Select the number of strips required for the assay according to the
number of samples to be assayed and the Calibrators (see
paragraph “Summary of protocol” below). Reseal the pouch.
3.
Dispense 100 µL of each Calibrator and of the diluted samples.
4.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30 minutes.
5.
Perform a washing cycle following the suggested procedure (see
Washing Cycles).
6.
Dispense 100 µL of Conjugate in each well.
7.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30 minutes.
8.
Perform a washing cycle following the suggested procedure (see
Washing Cycles).
9.
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
10.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 15 minutes.
11.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop Solution
into each well.
12.
Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm.
CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:

The ratio of the OD for Calibrator 4 (250 IU/mL) to the OD for
the Calibrator 1 (8 IU/mL) must be > 3,0

The ratio of the OD for Calibrator 0 (0 IU/mL) to the OD for
the Calibrator 1 (8 IU/mL) must be < 0,6
Pag. 19 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results
cannot be reported without a documented critical review of the
data. The non conformity must be addressed and treated according
to each laboratory’s Quality Assurance procedures. Each lab should
establish and follow its own internal Quality Control procedures
and use the QC results to validate runs and manage non
conformities.
CALCULATION OF RESULTS
Calculate the average O.D. values for each set of duplicate
calibrators and samples (duplicates should have a CV < 20%).
Create a calibration curve by plotting the mean of O.D. for each
calibrator concentration on the ordinate against the IgG anti-Rubella
concentration on the abscissa. Draw a best fit curve through the
points of the graph. To determine the concentration of IgG antiRubella for each sample, first find the O.D. value on the ordinate
and extend a horizontal line to the calibration curve. At the point of
intersection, extend a vertical line to the abscissa and read the
corrisponding IgG anti-Rubella concentration. If an automated
processor is available it’s advise to select among the following curve
fit types: cubic spline, hyperbolic and point-to-point straigth line.
The data below show typical results for the test. These data are
intended as an example only and should not be used to calculate
results from another run.
Example of calculation with cubic spline fit:
Calibrators
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Sample A
Sample B
Sample C
IU/mL
0
8
28
75
250
O.D.
0.070
0.338
0.872
1.842
2.771
0.243
0.566
2.677
IU/mL
5.2
15.0
196.1
Pag. 20 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative of
the European population, suggest the following interpretative criteria:
IU/mL
INTERPRETATION
> 15
Sample should be considered POSITIVE for the
presence of IgG anti-Rubella antibodies.
Sample should be considered NEGATIVE for the
presence of IgG anti-Rubella antibodies.
Sample should be considered BORDERLINE for the
presence of IgG anti-Rubella antibodies.
8
815
Please consider that:
- the test only detects specific IgG antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test result but
should be grounded on all the available clinical data; discrepancies in
clinical data should be clarified prior to final decisions, also, if necessary,
by confirmatory or 2nd level tests;
- results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same patient;
comparing the results with those of a reference test.
PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance specifications of
the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is
within such specifications, as intended by the manufacturer.
SPECIFICITY AND SENSITIVITY
The diagnostic sensitivity and specificity were evaluated comparing the
BEIA Rubella IgG Quant results versus an established EIA commercial kit
(EIA Rubella IgG) with acceptable performances.
EIA Rubella IgG
+
BEIARubella IgG
145
0
+
Quant
0
98
-
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From which the following table can be calculated:
Relative Sensitivity
Relative Specificity
Agreement
100%
100%
100%
DETECTION LIMIT:
Trials in replicate on the Calibrator 0 lead to calculate the detection limit
in 0.3 IU/mL.
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with hemoglobin up to 10
mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL. Lipemic,
turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using one
negative sample with concentration of 6 IU/mL and two positive
samples, containing different concentration : 15 IU/mL and 200 IU/mL.
These samples were tested 6 times per single run in 12 different analytical
runs. Coefficients of variation lower than 10% have been obtained for the
negative sample and 8% for the positive samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens may
affect the detectable levels of specific IgG.
GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE








Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.
Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.
Do not pipette solutions or samples by mouth.
Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and
samples. Avoid direct contact.
Wash hands thoroughly after assay.
Thoroughly clean working area with proper detergent solutions.
Collect solid and liquid waste material in proper containers and
provide for disposal according to the local regulations.
Periodically check contamination level of operators and rooms.
Pag. 22 - 24 BEIA Rubella IgG Quant Ed. 20/04/2013
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HbsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since no
known test can guarantee, however, that products derived from
human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious
diseases, these reagents should be handled as hazardous material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritating to eyes and skin.
S26
In case of contact with eyes, rinse immediately with
plenty of water, and seek for medical advice.

SUMMARY OF PROTOCOL












Prepare reagents
Pre-dilute samples 1:81 with Sample Diluent
Dispense:
100L of Calibrators (0-250 IU/mL) in duplicate
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Conjugate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Incubate 15 minutes at R.T. (18-25°C)
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Cal 0
Cal 0
Cal 8
Cal 8
Cal 25
Cal 25
Cal 75
Cal 75
2
Cal 250
Cal 250
P1
P2
P3
….
….
….
3
4
….
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REFERENCE - BLIOGRAFIA
- Best J.M. and O’Shea S.1995. Rubella virus, p. 583-600. In E.H. Lennette,
D.A. Lennette and E.T. Lennette( ed ). Diagnostic procedures for viral,
rickettsial and chlamydial infections, 7th Ed. American Public Health
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- Best J.M. 1991. Rubella vaccines : past,present and future. Epidemiol.
Infect. 107: 17-30
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and L. Collier (ed ),
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ed, vol. 1, Arnold, London, England.
- Center for Disease Control : Rubella and congenital rubella syndromeUnited States, 1983-1984, Morbid Mortal Week Rep 33: 528-530, 1984.
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structural proteins E1, E2 and C. J. Clin. Microbiol. 30,9, 2323-2329.
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outbreak. Lancet 336:1071
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infection. Rev. Infect. Dis. 7 : 80-85
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confirmed maternal rubella at successive stages of pregnancy. Lancet
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- National Committee for Clinical Laboratory Standards . 1992.
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products intended for the detection and quantitation of rubella IgG
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for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.
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