diastat anti-ro - Technogenetics

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BEIA Rubella IgM Mab Quant
22292
Edizione
20-04-2013
Solo per uso professionale
TECHNOGENETICS SRL
N° 00501
Pag. 1 - 28 BEIA Rubella IgM Mab Quant Ed. 20-04-2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA Rubella Mab IgM Quant è un test immunoenzimatico
qualitativo/quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o
nel plasma degli anticorpi di classe IgM specifici verso il virus della
rosolia.
SIGNIFICATO CLINICO
La rosolia è causata da un virus RNA classificato come rubeovirus
appartenente alla famiglia dei togavirus. L'infezione puo' essere
asintomatica o provocare un modesto esantema. Se contratta
durante la gravidanza causa la "rosolia congenita" che può
provocare seri danni al feto. La maggior parte dei casi di rosolia
congenita si verifica come conseguenza di un’infezione materna
primaria, anche se sono segnalati casi estremamente rari di rosolia
congenita in nati da madri con pregressa immunità, quindi in
conseguenza di reinfezioni. Come conseguenza di una infezione
materna al I trimestre si può avere aborto, morte fetale, infezione
placentare, ma può anche non verificarsi alcuna infezione del feto.
La placenta costituisce una valida barriera all’infezione fetale dalla
12ª alla 28ª settimana di gestazione, mentre la protezione è meno
valida al I e III trimestre (in particolare nell’ultimo mese di
gravidanza) e di conseguenza il virus può causare un’infezione
placentare persistente anche senza infezione fetale. La sindrome
della rosolia congenita (SRC) non è una malattia statica. E' stato
dimostrato che ¾ dei bambini infetti sono asintomatici alla nascita e
solo successivamente presenteranno delle sequele. La diagnosi si
basa su indagini sierologiche e colturali dal momento che la
sintomatologia clinica non permette di porre diagnosi di certezza. La
ricerca di anticorpi (IgG ed IgM) può essere fatta in tempi molto
rapidi mediante latex-agglutinazione, emoagglutinazione passiva,
immunofluorescenza o metodi immunoenzimatici. La presenza di
IgG indica uno stato di immunità. La presenza di IgM a titoli elevati
o moderati permette di porre diagnosi d’infezione recente, tuttavia a
basso titolo le IgM possono essere presenti anche in casi di
reinfezione. La diagnosi in gravidanza risulta molto facilitata se è
noto lo stato immunitario pregravidico;
se questo dato non è disponibile è comunque opportuno avere un
dato all’inizio della gravidanza. Non esiste alcuna terapia specifica
dell’infezione in atto, né alcuna possibilità di prevenire la
trasmissione materno-fetale del virus nel caso di infezione in
gravidanza. Tentativi di trattamento della SRC con vari farmaci
(interferon, amantidina, isoprinosina) non hanno mostrato
un’effettiva utilità. La vaccinazione per la rosolia costituisce l’unica
strategia efficace per la prevenzione della rosolia congenita. La
determinazione delle IgG e IgM specifiche rappresenta un test di I
livello. Nel caso di positività alle IgM / IgG, in alcuni casi è
necessario procedere ad ulteriori indagini eseguendo test di II livello
quali il test dell'Avidità.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA Rubella IgM Mab Quant è un dosaggio ELISA basato
sulla tecnica “a cattura”. I campioni da esaminare vengono incubati
nei micropozzetti sensibilizzati con anticorpi monoclonali anti-IgM
umane. Le IgM del campione vengono catturate dagli anticorpi
presenti sulla fase solida. Dopo eliminazione mediante lavaggio dei
componenti del siero non legati alla fase solida, la presenza di IgM
anti-Rubella viene rilevata attraverso il legame con un complesso
costituito da antigene Rubella - anticorpo monoclonale anti-E1 di
topo coniugato con perossidasi. Dopo allontanamento del
complesso non legato viene aggiunto il Substrato-TMB che, per
azione dell’enzima presente sulla fase solida, sviluppa una
colorazione azzurra. L’aggiunta di una soluzione di acido solforico
1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore dall’azzurro al
giallo. La densità ottica
letta a 450/620 è direttamente
proporzionale alla quantità di IgM specifiche presenti nel campione
in esame. Nel kit
BEIA RUBELLA IgM Mab Quant la
concentrazione degli anticorpi di classe IgM viene calcolata
mediante l'utilizzo di una curva di calibrazione ed espressa in Unità
Arbitrarie/mL.
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CAL
0
B
Calibratore 0 (0 UA/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibratore 1 ( 10 UA/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
1 x 2 mL
CAL
3
C3
1 x 2 mL
CAL
4
C4
1 x 2 mL
DIL
SPE
D
Diluente Campioni BEIA System
1 x 120 mL
E
Antigene Rubella
1 x 6 vials
F
Diluente Complesso
1 x 22 mL
G
Coniugato
1 x 0.5 mL
AG
DIL
COMP
CONJ
BUF
WASH 20X
H
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
SUBS
TMB
I
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
J
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
Istruzioni per l’uso
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con anticorpi monoclonali anti-IgM umane,
in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate
nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in pozzetti
singoli.
Calibratore 0 UA/mL
Siero umano negativo per anticorpi IgM anti-Rubella.
Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente
pronto all'uso.
Calibratori 10, 20, 50 e 100 UA/mL
Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgM antiRubella. Contengono 0,09% p/p di sodio azide come
conservante. Reagenti pronti all’uso.
Diluente Campioni BEIA System
Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09%
p/p di sodio azide come conservante e Tween 20.
Reagente pronto all'uso
E.
F.
G.
H.
I.
J.
Antigene Rubella
6 flaconi, in forma liofilizzata, contenenti Antigene Rubella
Vedi preparazione dei reagenti.
Diluente Complesso
Soluzione proteica tamponata, tensioattivi e conservanti.
Reagente pronto all'uso.
Coniugato
Soluzione concentrata contenente anticorpo monoclonale antiE1 Rubella marcato con perossidasi. Vedi preparazione dei
reagenti.
Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene
0,1 % Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti.
Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante
(rosa). Reagente pronto all'uso.
Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico.
Reagente pronto all'uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza del kit riportata
sull’ etichetta.
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il SubstratoTMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit
della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI
 Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
 Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
 Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 1000 µL.
 Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
 Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI









Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi.
Evitare l'essiccamento dei pozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione
del campione.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina o EDTA).
Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni
possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario aliquotare i
campioni e congelarli a -20°C.
Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l’uso di
campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere
diluiti 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System prima del
dosaggio
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Tampone di Lavaggio
Diluire il Tampone di Lavaggio(20x) 1:20 con acqua distillata o
deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile
15 giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la data di
scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di lavaggio
concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si
solubilizzano portando il reagente a 37°C prima della diluizione. Si
raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per
eseguire i lavaggi dell'analisi in corso.
Complesso Antigene Rubella- Mab-HRP
Ricostituire ogni flaconcino di Antigene liofilo con 3 mL di Diluente
Complesso. Per una corretta ricostituzione, si consiglia di aggiungere
il volume prescritto di Diluente Complesso, richiudere il flaconcino,
lasciarlo 15 minuti a temperatura ambiente
ed agitarlo
delicatamente, evitando la formazione di schiuma, fino a completa
dissoluzione del liofilo. Diluire il Coniugato 1:61 con la soluzione di
Antigene Rubella (e.g. aggiungere 50 µl di Coniugato al flaconcino
ricostituito, contenente 3 ml di antigene Rubella). Preparare
esclusivamente la miscela Ag-Mab-Coniugato necessaria per
eseguire l’analisi in corso. Qualora si rendesse necessario utilizzare
più di un flaconcino monodose, si raccomanda di miscelarne i
contenuti prima dell’uso. L'immunocomplesso deve essere
preparato 60 minuti prima del suo utilizzo.
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti
al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti
a 18-25°C).
1. Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni
BEIA System (esempio 10 µL di siero e 800 µL di Diluente
Campioni BEIA System). Agitare su Vortex.
2. Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione
del numero di campioni in esame e dei Calibratori (vedi
“Schema del dosaggio”). Richiudere accuratamente la busta.
3. Quantitativo: Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di
ciascun siero in esame prediluito e dei Calibratori.
Qualitativo : Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di
ciascun siero in esame prediluito, del Calibratore 0 (0 UA/mL),
del Calibratore 1 (10 UA/mL) e del Calibratore 4 (100 UA/mL)
4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 60
minuti.
5. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL del complesso Ag-MabConiugato (vedi preparazione dei reagenti).
minuti.
8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
minuti.
11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
pozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :
 il rapporto tra la DO del Calibratore 4 (100 UA/mL) e la DO
del Calibratore 1 (10 UA/mL) dev’essere > 3.0.
 il rapporto tra la DO del Calibratore 0 (0 UA/mL) e la DO del
Calibratore 1 (10 UA/mL) dev’essere < 0.4.
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di
Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di
instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al
laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed
alla gestione di eventuali non conformità.
CALCOLO QUANTITATIVO DEI RISULTATI
Calcolare la media dei valori di densità ottica per ogni calibratore e
campione (i duplicati dovrebbero presentare un CV minore del
20%). Elaborare la curva di calibrazione riportando la media delle
densità ottiche di ogni calibratore sull’asse delle ordinate e le
corrispondenti concentrazioni sull’asse delle ascisse. Disegnare la
migliore curva che passi attraverso i punti della calibrazione. Per
calcolare la concentrazione di IgM anti-Rubella di ogni campione
riportare il valore della densità ottica sull’asse delle ordinate e
collegare con una linea retta alla curva di calibrazione. Al punto di
intersezione, collegare con una linea verticale all’asse delle ascisse e
leggere il corrispondente valore di IgM anti-Rubella. Qualora si
disponesse di un sistema di calcolo automatico si consiglia di
utilizzare una delle seguenti funzioni matematiche: spline cubica,
iperbolica e lineare punto a punto. I seguenti valori devono essere
considerati solo come un esempio e non devono essere usati in
luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore.
Esempio di calcolo con interpolazione spline cubica:
Calibratori
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Campione A
Campione B
Campione C
UA/mL
0
10
20
50
100
Densità Ottica
0.123
0.516
0.887
1.755
2.503
0.217
0.775
2.254
UA/mL
2.4
16.4
79.0
CALCOLO QUALITATIVO DEI RISULTATI
Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del
campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l’index
anticorpale (I.A.) con la seguente formula:
DO campione
Index anticorpale (I.A.)
=
__________________________________________
DO Calibratore 1 (10 UA/mL)
Per il Calibratore 1 (10 UA/mL) calcolare, se eseguito in multiplo, il
valore medio di densità ottica (DO). I seguenti valori devono essere
considerati solo come un esempio e non devono essere usati in
luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore.
Esempio di calcolo:
Campione A
Campione B
Campione C
1ª DO
2ª DO
DO
I.A.
0.127
0.498
2.526
0.217
0.775
2.254
0.120
0.534
2.480
0.225
0.136
2.292
0.123
0.516
2.503
0.221
0.755
2.273
0.24
4.85
0.43
1.46
4.40
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
Qualitativo
IA
Quantitativo
UA/mL
INTERPRETAZIONE
> 1.1
> 11.5
Il campione è da considerare POSITIVO per
la presenza di anticorpi di classe IgM antiRubella
 0.9
 8.5
Il campione è da considerare NEGATIVO
per la presenza di anticorpi di classe IgM
anti- Rubella
0.9 1.1
8.5 11.5
ZONA GRIGIA: Il campione è da
considerare DUBBIO per la presenza di
anticorpi di classe IgM anti- Rubella
Va tenuto presente che:
- il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di
classe IgM. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato
infettivo;
- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo
test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili. Dati
clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente con il conforto di test di conferma o di II livello;
- risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la
ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test
su un prelievo successivo; con il confronto con un test di
riferimento.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
SENSIBILITÀ
Sono stati testati 15 sieri di pazienti con diagnosi accertata di
infezione primaria da Rubella e 14 sieri prelevati entro i primi due
mesi a pazienti vaccinati. I sieri sono stati confrontati verso un kit
immunoenzimatico presente sul mercato con prestazioni accettabili
(EIA Rubella IgM). 29 sieri furono trovati positivi con il kit EIA
Rubella IgM, mentre 28 risultarono positivi per la presenza di IgM
specifiche anti-Rubella con il kit BEIA Rubella IgM Mab Quant. La
sensibilità risulta essere del 97%.
SPECIFICITÀ
Sono stati testati 103 sieri da donne in gravidanza, soggetti con
immunità pregressa e non immuni, con infezioni acute da CMV,
EBV, Parvovirus B19, con anticorpi anti-nucleo, anticorpi antitessuto e FR positivo. I sieri testati sono stati confrontati verso un kit
immunoenzimatico presente sul mercato con prestazioni accettabili
(EIA Rubella IgM). 103 sieri furono trovati negativi con il kit EIA
Rubella IgM, mentre 100 sieri risultarono negativi per la presenza di
IgM specifiche anti-Rubella con il kit BEIA Rubella IgM Mab Quant.
La specificità risulta essere del 97%.
LIMITE DI RILEVAZIONE
Prove condotte in replicato sul Calibratore 0 indicano il limite di
rilevazione in 0.4 UA/mL.
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
valutando un campione negativo con concentrazione 3 UA/mL e
due campioni positivi a due concentrazioni 15 UA/mL e 80 UA/mL.
I campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12
sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori
al 15% per il campione negativo ed inferiori al 6% per i due
campioni positivi.
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti
dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgM specifiche.
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA








Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le
operazioni previste per l'esecuzione del test.
Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.
Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.
Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni
indossando guanti monouso e camici.
Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.
Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici
di lavoro eventualmente contaminate.
Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il
dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento
secondo le norme vigenti.
Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati
e trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV.
Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non
possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si
raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare
un medico.
SCHEMA DEL DOSAGGIO



Preparare i reattivi
Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System
Dispensare:
Metodo Qualitativo
100 L di Calibratore 0 (0 UA/mL) in doppio
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,
Metodo Quantitativo
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,









Incubare 60 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Complesso Ag-Mab-Coniugato
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
Test qualitativo
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 100
Cal 100
P1
P2
2
P3
…
…
…
..
..
..
Test quantitativo
3
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 20
Cal 20
Cal 50
Cal 50
2
Cal 100
Cal 100
P1
P2
P3
….
….
….
3
BEIA Rubella IgM Mab
Quant
22292
Version
20-04-2013
For professional use only
TECHNOGENETICS SRL
INTENDED USE
The BEIA Rubella IgM Mab Quant kit is a qualitative/quantitative
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of
specific IgM antibodies to Rubella virus , in human serum or
plasma.
CLINICAL RELEVANCE
Rubella is a viral illness caused by a RNA virus classified as
rubeovirus and belonging to the togaviruses family.
Infection can be asymptomatic or can cause a mild rash. Rubella,
contracted during pregnancy causes «congenital Rubella» which
poses a serious threat to the fetus.
Most cases of congenital Rubella are due to a primary maternal
Rubella infection even though rare cases have been reported in
which infants with congenital Rubella syndrome were born to
mothers who were reinfected during pregnancy.
Rubella infection in the first three months of pregnancy can lead to
miscarriages, stillbirths, placental infection but it is also possible that
it doesn’t result in any birth defects.
Maternal placenta is a valid barrier to infection from 12th to 28th
week of pregnancy, while during the first three months infection can
cross it; protection drops again in the third trimester, in particular
during the last month, when Rubella virus can cause a persistent
placental infection even though the fetus is not infected.
Congenital Rubella syndrome (CRS) is not a static condition. It has
been proved that the 25% of the infected babies appear normal at
birth and have health problems later.
Diagnosis can be formulated against serological and coltural
evidence and cannot be based only on clinical symptoms suggestive
of this infection. The determination of anti-Rubella virus antibodies
can be easily and quickly performed by latex agglutination, passive
hemoagglutination, immunofluorescence or enzyme immunoassays.
The presence of IgG antibodies is indication of an immune
condition. High or moderate titers of IgM antibodies suggest a
recent infection although low IgM titers can also be found in cases of
Rubella reinfection.
Diagnosis during pregnancy is easy if there is documented evidence
of immunity states to Rubella before pregnancy; women who missed
being tested prior to pregnancy should be tested early during
pregnancy.
There is no effective treatment for Rubella during pregnancy, nor
there is an effective way to prevent the likelihood of the illness
passed from the mother to the fetus.
Any attempts of treatment with various drugs such as interferon,
amantidine, isoprinosine have proven useless.
Vaccination is the only effective way to prevent Rubella in
susceptible women so that their future children will be protected
from the congenital Rubella syndrome.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA Rubella IgM Mab Quant kit is a qualitative/quantitative
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on “capture
method”. During the first incubation, IgM antibodies present in
serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with
the monoclonal anti-human IgM.
After the first incubation the wells are washed to remove nonreactive serum components.
During the second incubation a complex (Rubella antigensmonoclonal antibody anti-E1 labelled with HRP) binds only to the
specific IgM anti-Rubella, bound in the anti-IgM-IgM complex
present on the wells.
After a second washing cycle, a Substrate-TMB solution is dispensed
into the wells in order to detect specific antibodies during a
subsequent incubation.
The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution
which changes to yellow the blue colour developed into the wells.
The amount of colour is directly proportional to the specific IgM
anti-Rubella concentration in the patient samples.
Since no International references were available, the BEIA Rubella
IgM Mab Quant has been arbitrarly calibrated.
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Component
SORB
A
Coated Strip
12x8x1
CAL
0
B
Calibrator 0 (0 AU/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibrator 1 ( 10 AU/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
1 x 2 mL
CAL
3
C3
1 x 2 mL
CAL
4
C4
1 x 2 mL
DIL
SPE
D
Sample Diluent BEIA System
1 x 120 mL
E
Antigen Rubella
1 x 6 vials
F
Complex Diluent
1 x 22 mL
G
Conjugate
1 x 0.5 mL
AG
DIL
COMP
CONJ
BUF
WASH 20X
H
Wash Buffer
1 x 100 mL
SUBS
TMB
I
Substrate-TMB
1 x 13,5 mL
J
Stop Solution
1 x 25 mL
Package Insert
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
Coated strips
Breakable strips coated with monoclonal anti-human IgM
antibodies packed in sealed pouch. Place the unused strips in
the pouch and reseal.
Calibrator 0 AU/mL
Negative human serum for IgM antibodies anti-Rubella.
Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready
to use reagent.
Calibrators 10, 20, 50 e 100 AU/mL
Human serum, containing IgM antibodies anti-Rubella with
different known concentrations. Contain
0.09% w/w of
Sodium azide as preservative.
Ready to use reagents.
Sample Diluent BEIA System
Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w
Sodium azide and Tween 20. Ready to use reagent.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
Antigen-Rubella
6 lyophilised vial. Contain Rubella Antigen See “Preparation of
reagents”.
Complex Diluent
Buffered salt solution with proteins. Contains Tween 20 and
preservative. Ready to use reagent.
Conjugate
Monoclonal anti-E1 Rubella antibody concentrated, conjugated
with horseradish peroxidase. See “Preparation of reagents”.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di
Kathon CG and Tween 20. See “Preparation of reagents”.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered
solution. Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use
reagents after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop
Solution are common to all BEIA kits.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L .
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
WARNINGS AND PRECAUTIONS








Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the chromogenic substrate shows a change from pink to blue
colour, discard the reagent.
For repeated assays, each time provide for new diluted
samples.
Every analytical run should include control samples in order
to validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and
microplate reader are required.
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For
longer storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C.
Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed,
lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be
pre-diluted with Sample Diluent prior to assay. See assay protocol.
PREPARATION OF REAGENTS
Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when
stored at 2-8 °C; in any case, do not use it after expiry date printed
on the original label. If crystallization occurs in the concentrated
Wash Buffer, warm the solution to 37 °C before diluting. Only dilute
the quantity necessary for the assay.
Complex Antigens - Mabs anti-Rubella - HRP
Reconstitute the lyophilized vial with 3 mL of Complex Diluent. It's
recommended to add the volume of Complex Diluent into the vial,
close the cap, wait 15' at room temperature and gently mix in order
to avoid foaming. Add 50 L of Conjugate to the reconstitute vial
and gently mix. The complex of Ag-Mab-Conjugate must be prepared 1
hour before being dispensed into wells. It's recommended to dilute only
the quantity necessary for the analytical run. If the analytical run
requires the reconstitution of more than one single-dose vial, it's
recommended to mix contents of the vials before use.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually,
perform the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
3.
Empty the wells
4.
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
5.
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
ASSAY PROTOCOL
1.
2.
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at
least 30-60 minutes at 18-25 °C.
Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample
Diluent BEIA System (i.e. 10 µL of serum and 800 µL of
Sample Diluent BEIA System). Shake on Vortex.
Select the number of strips required for the assay according to
the number of samples to be assayed and the Calibrators (see
paragraph “Summary of protocol” below). Reseal the pouch.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Quantitative: Dispense 100 µL of each Calibrator and of the
diluted sample.
Qualitative: Dispense 100 µL Calibrator 0 (0 AU/mL),
Calibrator 1 (10 AU/mL), Calibrator 4 (100 AU/mL) and of
the diluted samples.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 60
minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Complex Ag-Mab-Conjugate in each well.
minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
minutes.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop
Solution into each well.
Read the optical density (O.D.) in bi-chromatism at 450/620
nm.
CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:
 The ratio of the OD for Calibrator 4 (100 AU/mL) to the OD
for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be > 3,0

The ratio of the OD for Calibrator 0 (0 AU/mL) to the OD for
the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be < 0.4
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results
cannot be reported without a documented critical review of the data.
The non conformity must be addressed and treated according to
each laboratory’s Quality Assurance procedures.
Each lab should establish and follow its own internal Quality
Control procedures and use the QC results to validate runs and
manage non conformities.
QUANTITATIVE CALCULATION OF RESULTS
Calculate the average O.D. values for each set of duplicate
calibrators and samples (duplicates should have a CV < 20%).
Create a calibration curve by plotting the mean of O.D. for each
calibrator concentration on the ordinate against the IgM anti-Rubella
concentration on the abscissa. Draw a best fit curve through the
points of the graph. To determine the concentration of IgM antiRubella for each sample, first find the O.D. value on the ordinate
and extend a horizontal line to the calibration curve. At the point of
intersection, extend a vertical line to the abscissa and read the
corrisponding IgM anti-Rubella concentration. If an automated
processor is available it’s advise to select among the following curve
fit types: cubic spline, hyperbolic and point-to-point straigth line.
The data below show typical results for the test. These data are
intended as an example only and should not be used to calculate
results from another run. Example of calculation with cubic spline
fit.
Calibrators
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Sample A
Sample B
Sample C
AU/mL
0
10
20
50
100
O.D.
0.123
0.516
0.887
1.755
2.503
0.217
0.775
2.254
AU/mL
2.4
16.4
79.0
QUALITATIVE CALCULATION OF RESULTS
In order to correlate the analytical results to the immunity of the
sample results should be determined calculating the antibody index
(A.I.) using the following formula:
O.D. sample
________________________________________
Antibody Index (A I) =
O.D. Calibrator 1 (10 AU/mL)
For the Calibrator 1 (10 AU/mL) calculate, if assayed in duplicate,
the mean OD value (OD). The data below show typical results for
the test. These data are intended as an example only and should not
be used to calculate results from another run.
Sample A
Sample B
Sample C
1ª OD
0.127
0.498
2.526
0.217
0.775
2.254
2ª OD
0.120
0.534
2.480
0.225
0.136
2.292
mO.D.
O
0.123
A.I.
0.24
0.516
2.503
0.221
0.755
2.273
4.85
0.43
1.46
4.40
INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative
of the European population, suggest the following interpretative
criteria:
QUALITATIVE
A.I.
QUANTITATIVE
AU/mL
> 1.1
 11.5
INTERPRETATION
Sample should be considered POSITIVE for
the presence of anti-Rubella
IgM
antibodies.
< 0.9
 8.5
Sample should be considered NEGATIVE for
the presence of
anti-Rubella
IgM
antibodies.
0.9  1.1
8.5 11.5
GREY ZONE: Sample should be considered
BORDERLINE for the presence of anti-
Rubella IgM antibodies.
Please consider that:
- the test only detects specific IgM antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test
result but should be grounded on all the available clinical data;
discrepancies in clinical data should be clarified prior to final
decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests;
- results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same
patient; comparing the results with those of a reference test.
PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance specifications of
the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is
within such specifications, as intended by the manufacturer.
SENSITIVITY
15 sera from patients with diagnosed Rubella primary infection and
14 sera collected from people vaccinated since 2 months were
evaluated. 29 sera were found IgM positive with an established EIA
commercial kit (EIA Rubella kit) with acceptable performances. 28
sera were found positive for the presence of IgM anti-Rubella with
the BEIA Rubella IgM Mab Quant. The sensitivity is of 97%.
SPECIFICITY
The specificity was assessed by testing 103 specimens from a
population expected to be negative for IgM to Rubella (pregnant
women, subjects immune and not immune to Rubella, with acute
infection caused by CMV, EBV, Parvovirus B19, with autoimmune
diseases (ANA), anti-tissue and RF positive). The specificity was
evaluated comparing the BEIA Rubella IgM Mab Quant results
versus an established EIA commercial kit (EIA Rubella IgM) with
acceptable performances. 103 specimens were found negative for the
presence of IgM anti-Rubella with the EIA Rubella IgM Kit, while
100 were observed negative for the presence of IgM anti-Rubella
with the BEIA Rubella IgM Mab Quant kit. The specificity is of 97.1%.
DETECTION LIMIT
Trials in replicate on the standard 0 lead to calculate the detection
limit in 0.4 AU/mL.
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with hemoglobin up
to 10 mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL.
Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using
one negative sample with concentration of 3 AU/mL and two
positive samples, containing different concentration : 15 AU/mL
and 80 AU/mL. These samples were tested 6 times per single run in
12 different analytical runs. Coefficients of variation lower than 15%
have been obtained for the negative sample and lower than 6% for
the two positive samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens
may affect the detectable levels of specific IgM
GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE

Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.

Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.

Do not pipette solutions or samples by mouth.

Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and
samples. Avoid direct contact.

Wash hands thoroughly after assay.

Thoroughly clean working area with proper detergent solutions.

Collect solid and liquid waste material in proper containers and
provide for disposal according to the local regulations.

Periodically check contamination level of operators and rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HBsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since no
known test can guarantee, however, that products derived
from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other
infectious diseases, these reagents should be handled as hazardous
material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38 Irritating to eyes and skin.
S26
In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty
of water, and seek for medical advice.
SUMMARY OF PROTOCOL



Prepare reagents
Pre-dilute samples 1:81 with BEIA System Sample Diluent
Dispense:
Qualitative Test
100L of Calibrator 0 (0 AU/mL) in duplicate
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate
Quantitative Test
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate









Incubate 60 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L Complex of Ag-Mab-Conjugate
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
Qualitative Test
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 100
Cal 100
P1
P2
2
P3
…
…
…
..
..
..
Quantitative Test
3
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 20
Cal 20
Cal 50
Cal 50
2
Cal 100
Cal 100
P1
P2
P3
….
….
….
3
BIBLIOGRAFIA / REFERENCES
- Best J.M. and O’Shea S.1995. Rubella virus, p. 583-600. In E.H. Lennette,
D.A. Lennette and E.T. Lennette( ed ). Diagnostic procedures for viral,
rickettsial and chlamydial infections, 7th Ed. American Public Health
Association, Washington, D.C.
- Best J.M. 1991. Rubella vaccines : past,present and future. Epidemiol.
Infect. 107: 17-30
- Banatvala J.E. and Best J.M. 1998. Rubella, p 551-577. In B.W.J. Mahy
and L. Collier ( ed ),
- Topley & Wilson’s microbiology and microbial infections : virology. 9th
ed, vol. 1, Arnold, London, England.
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- Chaye H.H. et al. 1992. Cellular and humoral responses to rubella virus
structural proteins E1, E2 and C. J. Clin. Microbiol. 30,9, 2323-2329.
- Cusi M.G., Rossolini G.M., Valensin P.E., Cellesi C. and Zanchi A. 1990.
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outbreak. Lancet 336:1071
- Hermann KL. Rubella Virus in Manual of clinical microbiology.
Lennette EM EDS ASM- Washington DC 1985.
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infection. Rev. Infect. Dis. 7 : 80-85
- Miller E., Cradock-Watson J.E.and Pollock T.M. 1982. Consequences of
confirmed maternal rubella at successive stages of pregnancy. Lancet
8032:781-782
- National Committee for Clinical Laboratory Standards . 1992.
Evaluation and performance criteria for multiple component test
products intended for the detection and quantitation of rubella IgG
antibody. NCCLS document I/LAB-T/, vol.12, p 1-3. National Committee
for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.
-Thomas H.I., Morgan-Capner P., Enders G., O’Shea S., Caldicott D. and
Best J.M. 1992. Persistence of specific IgM and low avidity IgG1 following
primary rubella. J. Virol. Methods 39: 149-155

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