- (INFN) - Sezione di Milano

Studio di un modello semplificato per descrivere cambiamenti
conformazionali in proteine.
i
dedica
dedica
Indice
1 Comportamento biochimico di NF-kB
2
1.1
La famiglia NF-kB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.2
Meccanismo di inibizione di NF-kB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.3
Cambiamenti di conformazione in NF-kB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
2 Il modello Gō per descrivere la dinamica di p65.
6
2.1
Proteine con due modalità dello stato nativo descritte da un modello Gō. .
6
2.2
Costruzione della mappa dei contatti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2.3
Preparazione delle simulazioni della dinamica di p65. . . . . . . . . . . . . .
11
2.4
Dinamica molecolare con replica exchange. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
3 Risultati
14
3.1
Transizione di fase dei domini di p65. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
3.2
p65 descritta dal modello Gō con l’aggiunta dell’elettrostatica. . . . . . . .
16
3.3
Analisi del complesso p65/DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
3.4
Conclusioni. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
ii
Prefazione
A seguito di numerosi studi condotti su NF-kB (un complesso di due proteine coinvolto
nell’attivazione della trascrizione del DNA) ne è stato ipotizzato un ruolo nelle disfunzioni
cellulari legate al cancro.
Per questa ragione, negli ultimi anni, NF-kB è stato soggetto di numerosi studi di approfondimento che hanno sempre più messo in evidenza i meccanismi biologici che lo coinvolgono.
Supportati dal copioso materiale prodotto abbiamo condotto uno studio computazionale
delle proprietà conformazionali di equilibrio assunte da p65 (una particolare proteina del
complesso NF-kB) che sono state studiate da un modello semplificato basato sulla strutture
sperimentali della proteina che ci ha consentito di far convergere le quantità studiate: il
modello Gō.
Dopo aver analizzato le proprietà di equilibrio della sola proteina p65, abbiamo effettuato
un’analisi della interazioni di p65 col DNA e ne abbiamo messe in evidenza alcune proprità. In conclusione, siamo riuscito a riprodurre il comportamento di p65 servendoci di
un modello molto semplice a cui abbiamo aggiunto l’interazione elettrostatica, producendo
cosı̀ una corretta descrizione fisica del nostro sistema.
1
Capitolo 1
Comportamento biochimico di
NF-kB
1.1
La famiglia NF-kB.
Come è ormai noto da tempo, l’organizzazione dei processi vitali negli organismi viventi è
mediata dalla trascrizione del codice genetico catalogato nel DNA. Alcune proteine chiamate fattori di trascrizione si occupano di promuovere o reprimere l’epressione dei geni in
mRNA in base alle necessità dell’organismo.
NF-kB è un fattore di trascrizione che si occupa del controllo di alcuni segnali di risposta legati allo stress cellulare, alla crescita e all’apoptosi della cellula. Le sue funzioni
biologiche si strutturano attraverso una complessa catena di meccanismi di attivazione e
disattivazione della trascrizione del DNA, che vengono regolati grazie alla presenza di una
seconda proteina chiamata IkBα.
La famiglia di NF-kB è formata da diverse proteine che si possono raggruppare in due
classi, a seconda della sequenza del loro dominio C-terminale. A seguito di proteolisi causata da proteasi, le proteine della prima classe vengono attivate con il compito di legare il
DNA. Il dominio p50 fa parte di questa classe. Le proteine della seconda classe, chiamate
proteine Rel, contengono domini di attivazione della trascrizione come p65 (detto anche
RelA). Una caratteristica comune alle due classi è quella di condividere una regione omologa denominata RHR (Rel-Homology-Region); tale regione è costituita da una catena di
circa 300 aminoacidi di cui i primo 180 appartengono a un dominio di immunoglobulina,
i successivi 10 si organizzano in una struttura estremamente flessibile che connette un secondo dominio di immunoglobulina di circa 100 aminoacidi e infine è presente una zona che
2
CAPITOLO 1. COMPORTAMENTO BIOCHIMICO DI NF-KB
porta il segnale di localizzazione nucleare (NLS).
1
3
La RHR è coinvolta nello svolgimento
di numerosi compiti tra cui la dimerizzazione della proteina, il trasporto della proteina
dal citoplasma al nucleo, il legame col DNA e inoltre permette l’attività inibitoria della
trascrizione genetica legandosi alla proteina IkBα.
Proprio per queste ultime due funzioni svolte dalla RHR, ma anche per gli innumerevoli
processi in cui è coinvolta, nel nostro lavoro ci siamo concentrati sullo studio di NF-kB
servendoci unicamente della parte di sequenza appartenente alla regione omologa RHR.
I membri della famiglia Rel/NF-kB tendono ad aggregarsi in coppie di diverso tipo che
andranno a formare i complessi dimerici NF-kB. La specie più attiva e abbondante è quella costituita dalla coppia p50/p65 che abbiamo preso in esame per effettuare uno studio
computazionale delle conformazioni che assume alle diverse temperature.
Per rendere il problema sufficientemente semplice, abbiamo scelto di concetrarci sull’analisi
della sola proteina p65, riducendo in questo modo la complessità della dinamica.
Figura 1.1: Complesso NF-kB con DNA.
1
La parte contenente l’NLS permette alla proteina di essere riconosciuta dal meccanismo di trasporto
nucleare che le consente il trasporto dal citoplasma al nucleo passando per la membrana nucleare.
CAPITOLO 1. COMPORTAMENTO BIOCHIMICO DI NF-KB
1.2
4
Meccanismo di inibizione di NF-kB.
Per comprendere a fondo la natura della dinamica di NF-kB e delle conformazioni da essa
popolate è necessario capirne le funzioni biologiche e i meccanismi in cui è coinvolta.
Le cellule hanno la necessità di poter dare risposte di difesa in presenza di determinati
stimoli provenienti dal mondo esterno e la reazione a questi segnali è promossa dalla trascrizione del DNA operata attraverso l’azione dei fattori di trascrizione.
La proteina IkBα associandosi a NF-kB ne inibisce le attività disattivando la sua trascrizione genetica che, successivamente, può essere riattivata soltanto dissociando NF-kB da
IkBα.
La formazione del complesso IkBα/NF-kB, dopo aver interrotto la trascrizione dissociando
NF-kB dal DNA e aver raggiunto il citoplasma,2 inibisce il meccanismo di trasporto nucleare (NLS) di NF-kB impedendogli di rientrare nel nucleo.
Come è stato evidenziato da diversi studi l’inibitore IkBα ha, dunque, un doppio ruolo:
1) Interagendo con NF-kB favorisce la dissociazione del fattore di trascrizione dal DNA
[1][2]. 2) Il segnale di localizzazione nucleare (NLS) di NF-kB viene inibito, trattenendo
cosı̀ la proteina nel citoplasma.
3
La ritenzione di NF-kB nel citoplasma è risultata essere molto forte ed è stato mostrato
che anche una solo una piccola quantità di NF-kB è in grado di produrre una consistente
attività di trascrizione.
La dissociazione di IkBα da NF-kB avviene prevalentemente con la presenza di particolari
prodotti batterici e virali, citochine infiammatorie, ossigeno reattivo e luce ultravioletta che
attivano delle chinasi specifiche per IkB favorendone cosı̀ una rapida degradazione. Ciò
permette la riattivazione del segnale NLS di NF-kB consentendone il trasporto nel nucleo.
Un fatto che è interessante evidenziare è che tra le sequenze di genoma promosse da NFkB vi è quella che permette la trascrizione dell’inibitore IkBα. La successiva generazione
dell’inibitore permetterà cosı̀ una nuova disattivazione di NF-kB e, nel momento in cui le
chinsasi specifiche per IkBα non saranno più presenti nel citoplasma, verrà ricostituita la
ritenzione del fattore di trascrizione.
2
Un segnale di esportazione della sequenza (NES) in IkBα permette al complesso di essere trasportato
fuori dal nucleo.
3
Il meccanismo di trasporto nucleare permette alle proteine dotate del segnale NLS di essere importate
nel nucleo attraverso i pori della membrana nucleare a cui altrimenti sarebbe impedito il passaggio. Allo
stesso modo una proteina che vuole essere portata all’esterno del nucleo necessita del cosiddetto segnale di
esportazione nucleare (NES).
CAPITOLO 1. COMPORTAMENTO BIOCHIMICO DI NF-KB
1.3
5
Cambiamenti di conformazione in NF-kB.
Alla luce di quanto appena detto, di tutte le conformazioni popolate da NF-kB due di esse
giocano un ruolo particolarmente importante nei meccanismi biologici che lo coinvolgono:
la prima è quella che si manifesta nel legame col DNA, mentre l’altra è quella che lega con
l’inibitore IkBα.
È stato possibile evidenziare che le proteine di NF-kB nel momento in cui vengono catturate durante il contatto con il DNA operano una transizione strutturale formando numerosi
contatti con l’elica di DNA. Con la presenza di IkBα, invece, la cattura di NF-kB (p50/p65)
avviene ancorando le strutture principalmente attive nel legame con il DNA e quelle adibite
al segnale di localizzazione nucleare [2][3].
Nel nostro studio abbiamo utilizzato le strutture ottenute con la NMR delle due conformazioni messe a disposizione dall’archivio del Protein Data Bank: nella prima è presente
p50/p65 legato ad un suo specifico tratto di DNA, nella seconda invece si presenta IkBα
legato a p50/p65. Nel PDB le due strutture sono archiviate con i seguenti nomi: 1IKN per
il complesso di NF-kB e IkBα ed 1VKX per il complesso di NF-kB legato al DNA.
Da entrambe le strutture ottenute dalla NMR abbiamo estrapolato solamente una parte
della catena di p65 (quella relativa alla regione RHR) e le abbiamo utilizzate come punto
di partenza per la nostra analisi.
Capitolo 2
Il modello Gō per descrivere la
dinamica di p65.
2.1
Proteine con due modalità dello stato nativo descritte
da un modello Gō.
Lo studio delle proprietà di equilibrio di NF-kB e del suo specifico tratto di DNA è stato
condotto servendosi di un modello basato sulle strutture native ottenute sperimentalmente
con la NMR. Il modello semplificato che abbiamo utilizzato, chiamato modello Gō [10] che
riduce le complesse interazioni tra gli atomi della proteina ad una semplice interazione di
Lennard-Jones di tipo 6-12. I minimi dei termini a due corpi sono definiti in modo tale
che la conformazione nativa risulti, per definizione, il minimo globale dell’energia. Originariamente questo modello estremamente semplificato è stato utilizzato per lo studio del
ripiegamento delle proteine, ma, negli ultimi anni, è stata estesa la sua applicazione alla
descrizione di fenomeni più complessi nell’ambito della dinamica molecolare. In particolare, come è stato evidenziato da Yaakov Levi [6], il modello Gō ha permesso di descrivere
con successo l’interazione proteina-DNA: il meccanismo di fly-casting, attraveso cui il DNA
cattura il suo specifico fattore di trascrizione, viene riprodotto efficacemente da una dinamica bastata sul modello Gō a cui vengono aggiunte le interazioni elettrostatiche tra gli
aminoacidi carichi. Contrariamente a quanto è stato fatto per le interazioni Lennard-Jones
nel modello Gō, l’aggiunta delle interazioni elettrostatiche non è basata sulla struttura
nativa e quindi il campo elettrostatico di ciascuna carica agisce su ogni altro aminoacido
carico all’interno di un certo raggio di cut-off. Questo conferisce un piccolo grado di fru-
6
CAPITOLO 2. IL MODELLO GŌ PER DESCRIVERE LA DINAMICA DI P65.
7
strazione al sistema. In questo modo l’attrazione prodotta dalle cariche negative presenti
sul DNA produce la cattura della proteina (complessivamente carica positivamente), che
completa il suo ripiegamento venendo a contatto con il DNA. L’aggiunta delle cariche è
dunque risultata cruciale affinché si manifestasse una facilitazione del meccanismo di cattura adoperato dal DNA e una corretta descrizione del processo.
Come abbiamo mostrato nel caso del fattore di trascrizione NF-kB, esistono proteine dedite
alla trascrizione del DNA che, in presenza di una seconda proteina inibitrice, ne interrompono il processo di trascrizione. NF-kB, ad esempio, può popolare diverse conformazioni
di cui una sola può legare col DNA e il suo legame con IkBα ne sposta l’equilibrio termodinamico verso una conformazione che non lega col DNA.
Nel nostro lavoro abbiamo costruito un modello che ha permesso di descrivere il comportamento di queste proteine. Dopo aver prodotto due strutture native della proteina p65 (di
cui una è nella conformazione che la vede legata al DNA che d’ora in poi indicheremo con
la lettera A, mentre l’altra è quella che lega con IkBα che indicheremo con la lettera B)
abbiamo elaborato un modello Gō che potesse popolare entrambe le conformazioni dello
stato nativo e, nella fattispecie, ci siamo serviti della struttura A e B per produrne un
prototipo.
Questa rappresentazione non ha permesso di descrivere le interazioni elettrostatiche che
sembrano giocare un ruolo importante nei processi di folding delle proteine coinvolte nei
legami col DNA. Per questo, è stato necessario estendere il modello Gō di p65 introducendo
un’interazione elettrostatica tra gli aminoacidi carichi (nello stesso modo in cui era stata
inserita da Levi per descrivere l’interazione proteina-DNA).
Questo ha fatto si che il modello popolasse con maggiore equilibrio le due conformazioni
native e fornisse dunque una descrizione più soddisfacente della termodinamica di p65.
Allo scopo di verificare il comportamento di interazione di p65 con la sua specifica elica
di DNA abbiamo prodotto un ultimo modello basato sul complesso p65/DNA. Anche in
questo caso abbiamo fatto si che la proteina p65 fosse modellata sulle strutture native A e
B e inoltre abbiamo introdotto le interazioni elettrostatiche tra gli aminoacidi carichi.
Anche questo modello, come vedremo più dettagliatamente, ha fornito una descrizione
soddisfacente dell’interazione col DNA.
CAPITOLO 2. IL MODELLO GŌ PER DESCRIVERE LA DINAMICA DI P65.
Figura 2.1: Configurazione A di p65.
Figura 2.2: Configurazione B di p65.
8
CAPITOLO 2. IL MODELLO GŌ PER DESCRIVERE LA DINAMICA DI P65.
2.2
9
Costruzione della mappa dei contatti.
Per prima cosa, descriveremo come è stato creato il modello per la sola proteina p65 e
solamente alla fine esporremo la procedura di creazione del complesso p65/DNA.
Come abbiamo già accennato, per la creazione delle configurazioni native di p65 abbiamo
scaricato dal database delle strutture note delle proteine (PDB) la NMR di p65 legata al
DNA e quella in cui si trova legata a IkBα e, per ciascuna delle due conformazioni, abbiamo
conservato solamene circa 300 aminoacidi appartenenti alla regione RHR di NF-kB. In
ciascuna delle due conformazioni ci siamo assicurati di aver prodotto la stessa sequenza di
aminoacidi.
A questo punto è stato necessario definire un’Hamiltoniana che descrivesse la dinamica degli
atomi della proteina. Il potenziale di interazione che abbiamo utilizzato è stato strutturato
in questo modo:
V =
X
ǫr (r − r0 )2 +
legami
+
X
+
contatti
ǫθ (θ − θ0 )2 +
angoli
ǫBB FD (φ) +
backbone
X
X
ǫC
X
ǫχ (χ − χ0 )2
impropri/planari
X
ǫSC FD (φ)
sidechain
σ 6
σ 6 X
σij 12
ij
ij
+
ǫN C
−2
r
r
r
non−contatto
con FD (φ) = [1 − cos (φ − φ0 )] + 12 [1 − cos (3(φ − φ0 ))].
Dove ǫr , ǫθ e ǫχ e r0 , θ0 e χ0 sono rispettivamente i coefficienti che esprimono le scale
di energia dei legami covalenti nella molecola, dei vincoli angolari e dei termini planari.
Queste interazioni permettono di conservare la geometria della backbone e sono descritti
da degli oscillatori armonici. I coefficienti ǫBB e ǫSC sono i coefficienti relativi ai termini
che descrivono l’energia degli angoli di diedro nella proteina (φ0 rappresenta l’angolo di
diedro nativo) e, infine, il penultimo termine riproduce le interazioni di Lennard-Jones,
mentre l’ultimo le interazioni di repulsione tra gli atomi “non in contatto”. Il coefficiente
σij definisce il termine specifico per la coppia di interazione i-j, ǫC e ǫN C sono, rispettivamente, i coefficienti che rappresentano i termini di “contatto” e quelli di “non contatto”.
L’interazione tra gli aminoacidi è dunque racchiusa in questi ultimi due termini (oltre che
nel termine che descrive l’energia dei diedri) che, come abbiamo visto, caratterizzano il
modello Gō e permettono di stabilizzare la struttura terziaria.
CAPITOLO 2. IL MODELLO GŌ PER DESCRIVERE LA DINAMICA DI P65.
10
A questo punto, servendoci del programma SMOG [7], abbiamo definito la mappa dei
contatti che contiene le informazioni utili per definire l’Hamiltoniana di interazione degli
atomi.
1
Per stabilire quali siano i termini di “contatto” e quali quelli di “non contatto” abbiamo
utilizzato la shadow map che è un particolare algoritmo per generare una mappa di interazioni.
Contrariamente a quanto avviene per una mappa di cut-off che assegna ad ogni atomo un
Figura 2.3: Funzionamento della Shadow Map.
certo raggio e definisce tutti gli atomi al suo interno come “in contatto”, la shadow map
definisce anch’essa un raggio di cut-off ma tratta gli atomi giacenti lungo la stessa linea di
vista in modo differente, producendo cosı̀ un risultato fisicamente più corretto in quanto
tiene conto dell’effetto di schermatura dei suddetti atomi. In particolare, come illustrato
in figura 2.3, gli atomi vengono considerati come delle sferette di raggio 1 Å e, una volta
che è stato assegnato un definito raggio di cut-off (che nel nostro caso è stato impostato
a 6 Å), per ciascun atomo vengono considerati “in contatto” tutti quegli atomi che sono
compresi in questo raggio a patto che su di essi non vi sia un altro atomo che produce un
cono d’ombra (come rappresentato in figura); tutti quegli atomi su cui è prodotto questo
cono d’ombra vengono scartati dalla mappa dei contatti.
In questo modo abbiamo completamente definito la topologia del nostro sistema e le
1
La realizzazione delle mappe di interazione di un modello Gō sono generalmente prodotte in due mo-
dalità: una in cui vengono presi tutti gli atomi della proteina, e un’altra in cui ciascun aminoacido viene
ridotto ad un unico punto incentrato sull’atomo C-α al fine di semplificane il modello. Nel nostro caso è
stato utilizzato il modello che comprende tutti gli atomi conservando cosı̀ una descrizione più dettagliata
della dinamica.
CAPITOLO 2. IL MODELLO GŌ PER DESCRIVERE LA DINAMICA DI P65.
11
interazioni che intercorrono tra gli atomi affinché sia definito con esattezza un modello
Gō.
2.3
Preparazione delle simulazioni della dinamica di p65.
Per prima cosa, vediamo più dettagliatamente come sono state create le mappe di interazione per descrivere la dinamica della sola p65.
Lo studio è stato condotto, innanzitutto, simulando la dinamica della proteina priva di
cariche e quindi modellata da un puro modello Gō e, successivamente, sono state aggiunte
a questo stesso modello le cariche per intrudurre l’elettrostatica.
Come abbiamo già sottolineato, il nostro intento è quello di costruire un modello Gō basato
non solo su un’unica struttura nativa ma su due strutture e, in particolare, nel nostro caso
ci riferiamo alla configurazione A e alla configurazione B di p65. Per far questo abbiamo
generato due mappe di interazione, una per ciascuna configurazione (A e B) e, in seguito, le
abbiamo adoperate per creare una terza mappa che compredesse sia i termini di interazioni
di Lennard-Jones della configurazione A che quelli della configurazione B. Come mostrato
in http://scitation.aip.org/content/aip/journal/jcp/131/24/10.1063/1.3276284 la capacità
di modello Go di popolare le due conformazioni usando la sovrapposizione delle due mappe
di contatto non è scontato, e dipende dalle proprietà geometriche delle due conformazioni.
Ciascuna mappa di contatto contiene le informazioni per definire i termini dell’Hamiltoniana di interazione. Sono quindi presenti i coefficienti relativi agli angoli, ai legami, ai
diedri e alle interazioni di Lennard-Jones.
Per creare il nostro modello abbiamo conservato le definizioni relative agli angoli e ai legami di una delle due configurazioni (in quanto risultano identiche per entrambi i modelli)
e infine abbiamo utilizzato per i diedri e per i termini di Lennard-Jones le definizioni di
entrambe le configurazioni.
A questo punto abbiamo costruito un secondo modello identico a quello appena descritto,
a cui abbiamo aggiunto le interazioni elettrostatiche per gli aminoacidi carichi (abbiamo
dunque semplificato il problema evitando di inserire la carica relativa ad ogni atomo).
In particolare è stata aggiunta una carica positiva sulla Lisina e sull’Arginina e una carica
negativa sull’acido Aspartico e sull’acido Glutammico.
Per eseguire le simulazioni su quest’ultimo modello è stato necessario aggiungere all’Hamiltoniana di interazione il termine relativo al campo elettrostatico:
CAPITOLO 2. IL MODELLO GŌ PER DESCRIVERE LA DINAMICA DI P65.
Vel =
12
X 1 qi qj
4πǫ0 ǫr r
i<j
Dove qi e qj sono le cariche mentre ǫr è la costante dielettrica.
Abbiamo infine preparato un’ultimo modello che ha permesso di calcolare le proprietà di
equilibrio del complesso p65/DNA. In questo caso abbiamo costruito una prima mappa di
interazione per il complesso p65/DNA (la cui struttura nativa è stata ricavata dalla NMR
di NF-kB legata al suo specifico tratto di DNA)
2
e una seconda mappa che definisse i
termini della sola p65 nella configurazione B. A questo punto abbiamo aggiunto alla prima
le definizioni relative ai termini di Lennard-Jones e dei diedri della seconda e, anche in
questo caso, abbiamo provveduto ad assegnare le cariche positive sulla Lisina e sull’Arginina
e quelle negative sull’acido Aspartico e sull’acido Glutammico. Inoltre abbiamo posto una
carica negativa su ogni gruppo fosfato della catena di DNA.
2.4
Dinamica molecolare con replica exchange.
In questa sezione ci occupiamo di spiegare dettagliatamente il metodo della replica exchange che abbiamo ampiamente utilizzato durante il nostro studio.
Tutte le simulazioni che abbiamo eseguito su ciascuno dei nostri modelli sono state effettuate su uno spazio canonico ad una fissata temperatura. Per poter effettuare un dettagliato
studio termodianmico è stato necessario eseguire più simulazioni su diverse temperature e
lo strumento della replica exchange ci ha permesso di ottimizzare i tempi di simulazione
consentendo al modello della nostra proteina di esplorare più agevolmente lo spazio delle
conformazioni.
Questo strumento può dunque essere utilizzato nel caso in cui si debbano eseguire simulazioni su diverse repliche dello stesso sistema poste a diverse temperature.
Dopo aver numerato le repliche, il sistema tenta di scambiare ad intervalli di step regolari
due repliche vicine con una probabilità P data dalla seguente formula:
1
1
(Ui − Uj )
−
P (i ↔ j) = min 1, exp
k B Ti k B T i
dove Ti e Tj sono le temperature di riferimento per le repliche prese in considerazione e
2
Anche in questo caso ci siamo assicurati che la proteina presentasse la stessa sequenza di aminoacidi
finora utilizzata.
CAPITOLO 2. IL MODELLO GŌ PER DESCRIVERE LA DINAMICA DI P65.
13
Ui , Uj sono le rispettive energie potenziali istantanee. Dopo lo scambio, le velocità delle
± 1
2
. Si osservi inoltre che non si dovrebbe
particelle vengono riscalate di un fattore TTji
tentare lo scambio di tutte le coppie di repliche ad ogni step e dunque abbiamo effettuato
gli scambi a step alterni prima per le coppie dispari e poi per le coppie pari.
Il metodo della replica exchange risulta particolarmente efficace nel caso in cui le diverse
conformazioni siano separate da barriere di energia relativamente alte. Lo scambio delle
repliche infatti, facilita la fuoriuscita delle proteine bloccate nei minimi locali nel momento
in cui le conformazioni vengono spostate nei sistemi a temperatura maggiore.
Affinché vi sia un ampia esplorazione di tutte le conformazioni per tutte le repliche alle
diverse temperature è bene che tutte le coppie scambino con un’efficienza minima del 10%
sulla durata totale dell’intera simulazione.
Come è evidentemente espresso dalla formula che fornisce la probabilità di scambio, la probabilità che due repliche si intercambino descere molto rapidamente al crescere della differenza di temperatura ed è stato dunque necessario scegliere temperature sufficientemente
vicine affinché le coppie di repliche potessero scambiarsi efficaciemente.
Capitolo 3
Risultati
3.1
Transizione di fase dei domini di p65.
I meccanismi biochimici che coinvolgono NF-kB risultano estremamente complessi: le proteine che lo compongono (p50 e p65) si aggregano formando un complesso dimerico che
agisce promuovendo la trascrizione genetica attraverso il legame col DNA; l’interazione con
un’altra proteina (IkBα) produce invece l’inibizione della trascrizione operata da NF-kB.
Nel nostro lavoro ci siamo limitati allo studio della proteina p65 cercando di produrre un
modello che ne descrivesse gli essenziali comportamenti. Ci siamo serviti cosı̀ di un modello
semplificato per studiare le proprietà di equilibrio di p65 nell’ensamble canonico.
Come prima mossa abbiamo tentato di studiare le proprietà di p65 servendoci di un modello Gō a due stati ponendo i minimi di energia sulle conformazioni native A e B.
Per il fatto che questo modello non può essere predittivo delle energie e delle temperature
reali, abbiamo espresso le loro unità di misura in unità arbitrarie (a.u.). In virtù di questo
fatto abbiamo dovuto cominciare il nostro nostro studio cercando a tentativi le temperature a cui avveniva la transizione di fase allo stato denaturato. Dopo qualche prova siamo
riusciti ad ottenere l’intervallo di temperature su cui si manifestava la transizione che abbiamo visto essere compreso tra 1.25 e 1.35 a.u. A questo punto, servendoci del programma
GROMACS, abbiamo eseguito un a simulazione in parallel tempering alle temperature di
1.25-1.27-1.29-1.30-1.31-1.32-1.33-1.35 a.u.
Per analizzare le proprietà termodinamiche del sistema abbiamo deciso di studiare le
curve del calore specifico e dell’energia media. Come mostrato in figura 3.1 il grafico dell’energia sembra indicare che la transizione di fase allo stato denaturato avviene attorno
alla temperatura di 1.31.
14
CAPITOLO 3. RISULTATI
15
Figura 3.1: Il grafico riporta l’energia media del sistema in funzione della temperatura.
Analizzando però più attentamente la figura 3.2 notiamo che il calore specifico presenta
due picchi in prossimità del punto di transizione con le temperature di 1.28 e 1.32 a.u.
Osservando con il programma vmd la cinetica di p65 notiamo che la nostra proteina è
composta da due domini molto stabili connessi da una zona estremamente flessibile. Guardando alla temperatura di 1.29 notiamo che molte delle conformazioni con cui si presenta
p65 lo vedono con uno dei domini ripiegato mentre l’altro si trova nello stato denaturato.
Se osserviamo invece alla temperatura di 1.32 notiamo che la proteina presenta molte
conformazioni nello stato completamente denaturato.
Il grafico del calore specifico sembra indicare che il progressivo spostamento dalla temperatura di 1.25 verso la temperatura di 1.35 presenti due transizioni di fase: quella che
osserviamo al valore di temperatura di 1.28 indica il passaggio allo stato denaturato del
primo dominio di p65, mentre il secondo sta ad indicare il passaggio del secondo dominio
allo stato denaturato.
CAPITOLO 3. RISULTATI
16
Figura 3.2: Grafico del calore specifico in funzione della temperatura.
3.2
p65 descritta dal modello Gō con l’aggiunta dell’elettrostatica.
Dopo aver analizzato il punto di transizione di fase, abbiamo deciso di analizzare il nostro
modello a temperature molto più basse allo scopo di osservare la proteina su uno spazio
delle conformazioni che occupi più stabilmente le conformazioni native.
Per farlo abbiamo prodotto un parallel tempering di otto repliche ponendo le temperature
in un range compreso tra 0.89 e 1.06 a.u. (0.89, 0.91, 0.94, 0.96, 0.99, 1.01, 1.04, 1.06 a.u.).
Per analizzare le proprietà di equilibrio di p65 abbiamo studiato la distribuzione della probabilità con cui si presentano le confiugrazioni con una data RMSD della configurazione A
e della configurazione B (che abbiamo indicato sugli assi cartesiani con i nomi di RMSDconfigurazioneA e RMSD-configurazioneB).
Come mostrato in figura 3.4 abbiamo deciso, per convenzione, di assengare allo stato nativo A tutte quelle conformazioni che risiedono nella zona A e allo stato nativo B quelle
presenti nella zona B. La parte C invece corrisponderà allo stato denaturato.
È immediatamente evidente, riferendoci alla figura 3.4, che il nostro sistema alla temperatura di 0.89 a.u. popola principalmente lo stato nativo A. Se si osservano i grafici in 3.3
sembra che al crescere delle temperature il sistema all’equilibrio tenda ad avere una bassa
popolazione di conformazioni sullo stato B mentre quelle dello stato denaturato sembrano
CAPITOLO 3. RISULTATI
17
Figura 3.3: Nelle immagini sono raffigurare le mappe del calore della distribuzione di
probabilità posta in funzione della RMSD della configurazione A e della configurazione B.
Le immagini A, B e C riguradano rispettivamente le temperature di 0.89, 0.94 e 0.96 a.u.
e rappresentano le simulazioni svolte con costante dielettrica infinita. Per quanto riguarda
D, E ed F stiamo considerando ancora le temperature di 0.89, 0.94 e 0.96 a.u. ma la
costante dielettrica in questo caso è stata posta sul valore di 90.
CAPITOLO 3. RISULTATI
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Figura 3.4: Il grafico rappresenta l’istogramma della distribuzione di probabilità delle
configurazioni in funzione delle RMSD. Le linee gialle demarcano le zone che abbiamo
indicato come stato A, stato B e stato denaturato (indicato con la lettera C).
crescere.
Nel grafico 3.5, su cui abbiamo riportato le probabilità dei tre stati in funzione delle
temperature, questo comportamento risulta immediatamente evidente: la linea verde che
rappresenta lo stato B presentà una probabilità pressochè costante attorno al valore di
1.5 a.u., mentre la probabilità dello stato non-nativo tende ad aumentare costantemente
assumendo una probabilità maggiore rispetto alla complessiva probabilità degli stati nativi
alla temperatura di 0.95 a.u.
Di per se questo può indicare due cose: la prima è che il nostro modello non sta descrivendo adeguatamente il comportamento biologico della proteina. La bassa frequenza con cui
p65 si trova nello stato B rispetto allo stato A fa pensare che essa si associ più facilmente
con il DNA piuttosto che con l’inibitore IkBα e ciò comporta che l’attività inibitrice di
IkBα risulti notevolmente ridotto a dausa della bassa probabilità con cui può agganciare
la proteina nello stato B.
Una seconda ipotesi potrebbe essere quella che la proteina p65 si manifesti nello stato B
solamente venendo a contatto con IkBα. In questo caso l’inibitore agirebbe da vero e proprio induttore della transizione verso lo stato B, cosa che potrebbe sembrare ragionevole
CAPITOLO 3. RISULTATI
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Figura 3.5: Grafico delle probabilità dei tre stati (A, B e denaturato) poste in funzione
della temperature del sistema descritto da un puro modello Gō.
visto che esso è in grado di catturare il complesso NF-kB legato al DNA e sequestrarlo nel
citoplasma.
Anche venisse ammessa questa ipotesi, si deve tener presente che la probabilità di transizione temporale da uno stato A a uno stato B è proporzionale all’esponenziale dell’altezza
della barriera di energia libera che divide A da B. Nella fattispecie più è alta la barriera
più è basso il rate di transizione.
Questo sta ad indicare che nel nostro modello il passaggio dallo stato A allo stato B non è
favorito e che dunque la barriera di potenziale non è agevolmente superata.
Ci sembra ragionevole pensare che un’ampliamento del nostro modello operato con l’aggiunta delle interazioni elettrostatiche tra gli aminoacidi possa garantire una più corretta
descrizione del comportamento di p65. La presenza delle cariche, infatti, è molto influente
nelle interazioni tra proteina e DNA e l’introduzione di tali interazioni dovrebbe costituire
un perfezionamento della descrizione dinamica della proteina.
È stato eseguita quindi una nuova simuazione in parallel tempering sempre operata su otto
repliche nello stesso range di temperature comprese tra 0.89 e 1.06 a.u. Questa volta abbiamo prodotto un modello Gō di p65 sulla base delle strutture native A e B e abbiamo
aggiunto l’interazione elettrostatica tra gli aminoacidi carichi. Come avevamo già detto
in precedenza è stata posta una carica positiva sull’Arginina e sulla Lisina e una carica
CAPITOLO 3. RISULTATI
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negativa sull’acido Aspartico e sull’acido Glutammico. Inoltre abbiamo introdotto una
lunghezza di Debye sull’interazione elettrostatica per riprodurre la schermatura del campo
elettrico prodotta dagli ioni ponendo un raggio di cut-off pari a a 1 nm. Le simulazioni
sono state effettuate su diversi valori della costante dielettrica che abbiamo collocato tra
90 e 200.
Osservando i grafici in figura 3.6 dove abbiamo studiato il sistema con costanti dielettriche
di 150-200 notiamo immediatamente come i valori di probabilità dello stato B si siano
spostati verso l’alto rispetto a quanto avevamo visto in figura 3.5.
Il modello su cui abbiamo introdotto le interazioni elettrostatiche con costante dielettrica
200 presenta una probabilità minima per lo stato B di 0.23 mentre avevamo visto che, per
il modello privo di cariche, la probabilità non superava mai il valore di 1.7.
L’elettrostatica ha influenzato quindi la stabilità dello stato B, che risulta presentarsi con
una probabilità nettamente maggiore. Il comportamento dello stato A invece risulta variato di poco e il nuovo modello sembra aver influenzato marginalmente la sua distribuzione
di probabilità.
Nel grafico 3.7 il comportamento che avevamo visto manifestarsi sui modelli con costante
dielettrica 150 e 200 viene riprodotto con maggiore efficacia poiché le probabilità dello stato B risultano ulteriormente aumentate su tutto il range di temperature a discapito dello
stato denaturato.
Su tutti e quattro i grafici di figura 3.6 e 3.7 possiamo notare che alla temperatura di 0.89
a.u. tutti i modelli presentano la probabilità dello stato denaturato attorno al valore di 0.1.
in sostanza quindi, possiamo assumere che a queste temperature i nostri modelli stanno
descrivendo un sistema a due stati nativi che si presentano con una probabilità di 0.9.
Il fatto che la probabilità dello stato denaturato risulti più bassa su tutto il range di temperature studiato è tanto più evidente quanto più la costante dielettrica viene abbassata. Il
modello a cui abbiamo assegnato la costante dielettrica 90 sembra riprodurre con maggiore
efficacia il comportamento di un sistema a due stati e inoltre nel range di temperature
compreso tra 0.93 e 1.06 a.u. lo stato A e lo stato B sembrano essere popolati all’equilibrio
con eguale probabilità. Nell’intervallo di temperature tra 0.89 e 0.93 a.u. i due stati vengono comunque popolati con probabilità molto simili, infatti, lo stato B sembra attestarsi
attorno al valodi di probabilità di 0.4 su tutto il range mentre lo stato A, partendo da un
valore di probabilità di 0.5 decresce fino ad arrivare ad un valore di 0.4.
Questo equilibrio tra le probabilità dello stato A e dello stato B per modello con costante
CAPITOLO 3. RISULTATI
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Figura 3.6: Grafico delle probabilità con cui si presentano gli stati A, B e lo stato denaturato
in funzione della temperature. Le costanti dielettriche dei due stati sono 150 e 200.
CAPITOLO 3. RISULTATI
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Figura 3.7: Grafico delle probabilità con cui si presentano gli stati A, B e lo stato denaturato
in funzione della temperature. Le costanti dielettriche dei due stati sono 90 e 115.
CAPITOLO 3. RISULTATI
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dielettrica 90 è ben visibile anche in figura 3.3: i tre istogrammi che rappresentano le pobabilità sul sistema dotato delle cariche, mostrano come lo stato A e lo stato B si presentino
popolati con probabilità più simili rispetto al sistema privo di cariche.
Non conoscendo con esattezza le reali probabilità con cui la proteina p65 si manifesta nello
stato A e nello stato B non possiamo dire con esattezza se il nostro modello è predittivo
di un reale comportamento della proteina.
Quello che possiamo dire è che il modello Gō fornito dell’interazione elettrostatica produce
un’ottima descrizione delle proprietà fisiche della proteina a noi note: il fatto che p65 si
manifesti con probabilità simili negli stati nativi A e B indica che il processo di passaggio
da uno stato all’altro non è ostacolato da stati intermedi e, inoltre, l’alta probabilità della
presenza degli stati A e B fa si che la cattura operata dal DNA e dall’inibitore IkBα ne sia
facilitata.
Si tenga presente inoltre che non era affatto scontato che il nostro modello Gō costruito
sulla base delle due configurazioni native da noi fornite producesse un modello a due stati.
L’unione delle strutture native infatti avrebbe potuto produrre una frustrazione di p65
manifestando cosi la comparsa di un terzo stato.
Da una descrizione qualitativa delle proprietà cinematiche di p65 possiamo dire, infine, che
il passaggio dallo stato A allo stato B transita essenzialmente per delle conformazioni intermedie che si manifestano grazie all’estrema flessibilità del tratto di sequenza che connette
i due domini della proteina, i quali invece, risultano essere delle strutture molto stabili.
In definitiva possiamo dire che abbiamo prodotto un soddisfacente modello che descrive
un sistema a due stati, i quali, paiono manifestarsi con una buona probabilità, e ciò è una
caratteristica che lo rende affine a una corretta descrizione delle sue proprietà biologiche.
3.3
Analisi del complesso p65/DNA.
Come avevamo già mostrato all’inizio del capitolo, il modello che abbiamo utilizzato per
analizzare p65 si limita a descrivere il comportamento della sola proteina e non può fornire
l’informazione completa sul suo complesso comportamento biofisico di attivazione e disattivazione della trascrizione. Le interazioni della proteina col DNA e con IkBα sembrano
avere un ruolo importante sia nelle funzioni fisiologiche che nella stabilizzazione della proteina nei suoi due stati nativi.
Abbiamo voluto procedere, quindi, all’analisi di un sistema che comprenda la proteina p65
e il tratto di DNA a cui si lega e per farlo abbiamo dovuto servirci di un terzo modello.
CAPITOLO 3. RISULTATI
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In particolare abbiamo utilizzato come struttura nativa per il nostro modello Gō l’intero
complesso p65/DNA. Successivamente abbiamo aggiunto alla proteina le interazioni native
che riguardano la conformazioni B e infine abbiamo posto le cariche sugli aminoacidi della
proteina e sui gruppi fosfati del DNA. Per quanto visto nella sezione precedente, abbiamo
scelto di porre la costante dielettrica su un valore di 90, infatti, per questo valore, il modello
sembrava descrivere più correttamente un sistema a due stati (come si può vedere dalla
figura 3.7). Complessivamente abbiamo ottenuto un sistema che comprende p65 fornita
delle interazioni native della conformazione A e della conformazione B a cui vi abbiamo aggiunto delle specifiche interazioni col DNA (descritte da un potenziale di Lennard-Jones).
Inoltre, questo sistema, presenta anche delle interazioni non specifiche di tipo elettrostatico
che riguardano le cariche poste sugli aminoacidi e sul DNA. Per eseguire le simulazioni,
abbiamo posto l’elica e la proteina al centro di un’ ampia scatola cubica di lato 80 nm
e infine sono stati inseriti dei restraints sugli atomi del DNA (questo è stato necessario
per rendere stabile l’elica). Dopo aver notato che nell’intervallo di temperature compreso
tra 0.89 e 1.06 a.u. la proteina p65 rimaneva congelata nello stato A abbiamo pensato
di alzare le temperature in modo che lo stabile complesso p65/DNA venisse destabilizzato
cosı̀ da poterne ricavare alcune informazioni. Abbiamo eseguito, dunque, una simulazione
del complesso proteina-DNA, ma questa volta abbiamo utilizzato le temperature comprese
tra 1.25 e 1.35 a.u. In questo range di temperature la proteina ha potuto esplorare un numero di conformazioni molto più ampio e ciò ci ha permesso di analizzare alcune proprietà
dell’interazione tra proteina e DNA.
Ci è sembrato di particolare interesse poter calcolare la distanza media tra il centro di
massa di p65 e il centro di massa del DNA in funzione delle diverse conformazioni assunte
da p65. Nello specifico eravamo interessati allo studio delle conformazioni A e B e per farlo
ci siamo serviti nuovamente delle RMSD.
Come mostrato in figura 3.8 abbiamo prodotto un grafico che mostra la distanza tra i due
centri di massa posta in funzione della RMSD della configurazione A per la distribuzione
rossa e in funzione della RMSD della configurazione B per la distribuzione verde. Per
completezza abbiamo riportato in grafico tutte le RMSD che vanno da 0 nm a 2 nm, ma
risulta di maggiore interesse la zona del grafico in cui la RMSD è minore di 0.9 nm cioè
quella in cui sono prese in considerazioni le conformazioni che si discostano di poco dalle
conformazioni native.
In questa parte del grafico si nota immediatamente che le popolazioni delle conformazioni
CAPITOLO 3. RISULTATI
25
Figura 3.8: Grafico delle distanze tra i centri di massa di p65 e del DNA posta in funzione
della RMSD eseguita sulla proteina. La distribuzione rossa rigurda la configurazione A
mentre quella verde la configurazione B.
CAPITOLO 3. RISULTATI
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che risiedono nella zona che avevamo chiamato stato B tendono, in media, a trovarsi più
lontane dal DNA rispetto a quelle che risiedono nello stato A che invece tendono a trovarsi
più vicine all’elica.
Inoltre le deviazioni standard mostrano che l’errore sulla distribuzione rossa (che denota
la RMSD sulla configurazione A) è molto più piccolo rispetto a quello della distribuzione
verde.
Questa potrebbe essere un’indicazione del fatto che quando la proteina si appresta ad avvicinarsi alla configurazione nativa A le interazioni con l’elica di DNA tendono ad agganciare
la proteina diminuendone in questo modo la possibilità di movimento del centro di massa.
Il fatto che la distanza per lo stato B sia maggiore rispetto a quella dello stato A è indizio
di un buon comportamento biofisico della proteina: quando la configurazione di p65 si
muove verso lo stato B la proteina comincia a distaccarsi dal DNA. Questo è in accordo
con quanto accade tra p65 e l’inibitore che, quando cattura la proteina, la aggancia nella
configurazione B producendo una riduzione delle interazioni fra la proteina e il DNA fino
a provocarne il definitivo allontanamento.
Inoltre la presenza di una deviazione standard maggiore rispetto a quella della configurazione A ci dice che il centro di massa della proteina ha maggior libertà di movimento
quando si trova nella conformazione B.
Tutti i fatti messi in evidenza finora forniscono una corretta descrizione del comportamento
fisico già noto di p65 in più ci danno un’informazione sulle modalità di distaccamento della
proteina dal DNA. Dagli studi fatti non possiamo stabilire se questo modello è predittivo
di un reale comportamento di p65 e quindi neanche delle sue proprietà, ma quello che è
emerso sembra fornire un coerente comportamento della proteina.
3.4
Conclusioni.
Il modello Gō privo di carica sembra aver descritto, in sostanza, il comportamento di un
sistema a uno stato nativo poiché (come è evidente osservando la figura 3.5) lo stato B è
popolato molto poco. Il complesso meccanismo biologico in cui la proteina è coinvolta ci
imponeva la ricerca di un modello che popolasse all’equilibrio due stati nativi (caratteristica peculiare della nostra proteina).
L’introduzione dell’elettrostatica ha cambiato l’equilibrio del nostro modello e ha fatto si
che il sistema descrivesse corretamente la fisica a noi nota della proteina p65. La presenza
delle cariche sembra giocare un ruolo chiave nei processi che coinvolgono i fattori di tra-
CAPITOLO 3. RISULTATI
27
scrizione e questo fatto si è manifestato essere essenziale nella descrizione di p65.
Infine il nostro modello fornito delle cariche sembra aver prodotto un corretto comportamento anche nell’interazione proteina-DNA.
Lo spostamento di p65 verso la configurazione B ha prodotto un allontanamento netto del
centro di massa della proteina dal DNA. Questo fatto ci da indicazioni sul meccanismo di
cattura operato da IkBα che sequesta il complesso NF-kB facendolo allontanare dal DNA
e portandolo nel citoplasma.
In conclusione possiamo dire che il nostro modello ha fornito una corretta descrizione di
tutti i processi fisici a noi noti in cui è coinvolta p65, ma questo non ci permette ancora di
poter dire che abbiamo prodotto un modello predittivo dei comportamenti fisici di p65 e,
più in generale, dei fattori di trascrizione.
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