Nuclear size control in C. elegans

Nuclear size control in C. elegans
Chiara Knecht (Liceo Lugano 2) e Justin-Aurel Ulbrich (Liceo Lugano 1)
Sotto la supervisione di Christian Gentili, Swiss Institute for Experimental Cancer Research (ISREC), EPFL
Introduzione
Durante la settimana di studio presso l’EPFL (École Politecnique Federale Lausanne),
abbiamo studiato i meccanismi di regolazione della grandezza dei pronuclei e dei nuclei
nell’embrione di C. elegans.
C. elegans è un nematode che nel suo stadio adulto raggiunge una lunghezza di circa 1 mm e
una larghezza di circa 65 μm. La sua nicchia ecologica e’ rappresentata da ambienti
antropogenici presenti su quasi tutto il pianeta quali, ad esempio, compostaggio e terra.
La specie è prevalentemente ermafrodita, solo circa lo 0,5% di una popolazione è di sesso
maschile, quest’ultimi mantengono un rimescolamento genetico.
Abbiamo focalizzato il nostro interesse sulle prime fasi di sviluppo dell’embrione, in
particolare sul passaggio dallo stadio monocellulare a quello bicellulare. Basandoci su uno
studio di Gregory et al., che propone l’ipotesi che il volume nucleare (Vn) sia in costante (k)
rapporto col volume citoplasmatico (Vk), abbiamo sviluppato una serie di esperimenti per
sapere se questa regola fosse applicabile anche nell’embrione di C. elegans. Per questo scopo
abbiamo misurato il volume dei pronuclei, nuclei e citoplasma degli
ovuli appena fecondati (P0) e, in seguito alla prima mitosi, nelle due
cellule figlie (P1 e AB). ). Inoltre, volevamo studiare quali meccanismi o
molecole sono in grado di modificare il volume del nucleo e vedere se il
citoplasma avesse riadattato la sua grandezza di conseguenza. Abbiamo
inattivato geni importanti per il trasporto di molecole tra il nucleo (o il
pronucleo) e il citoplasma e osservato in che modo questi influenzassero
la grandezza nucleare. Inoltre
abbiamo studiato come varia la
dimensione del nucleo al variare
della grandezza dell’embrione.
Materiali e procedimento
Per prima cosa abbiamo
preparato vetrini portaoggetti
contenenti embrioni di vermi
“normali”, cioè non modificati
geneticamente.
Per
questo
abbiamo usato C. elegans del
ceppo
wild-type
(ceppo
selvatico) Bristol N2.
Con l’aiuto di uno stereo
microscopio abbiamo prelevato,
con una pinzetta, dei vermi
gravidi da una coltura in agar.
I nostri strumenti di lavoro: bisturi, watch glass e pinzetta.
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Abbiamo trasferito i vermi in un “watch glass” (contenitore di vetro per la visualizzazione del
campione) contenente una soluzione salina (M9), dove sono stati tagliati con bisturi e
pinzetta.
Una volta che i vermi vengono tagliati, gli embrioni scivolano fuori.
Questa è una fase critica in cui bisogna procedere velocemente e con cura: grazie all’uso di
una pipetta di vetro si prelevano gli embrioni e si rilasciano su un vetrino, preparato
precedentemente, ricoperto da un sottile strato (pad) di agarosio, che funge da supporto per
evitare la compressione e disidratazione degli embrioni.
Una volta terminata la preparazione dei vetrini, abbiamo visualizzato gli embrioni grazie ad
un microscopio ottico munito di obiettivi per microscopia Nomarski (DIC) provvisto di una
videocamera che è collegata ad un computer che, con l’aiuto del software “Scion Image”
permette la cattura di video di ciò che si osserva. Dopo aver trovato e messo a fuoco gli
embrioni allo stadio unicellulare, abbiamo cominciato la registrazione.
Abbiamo ottenuto alcuni video che mostravano il primo ciclo cellulare, dalla fusione dei due
pronuclei in P0 e la seguente mitosi che terminava con la formazione delle due cellule figlie
AB e P1.
Dopo aver ottenuto un certo numero di video li abbiamo analizzati con il programma “Image
J” misurando il diametro dei pronuclei, dei nuclei e del citoplasma. I dati sono poi stati
processati con un foglio Excel e abbiamo calcolato i volumi con le rispettive medie.
Il passaggio successivo è stato investigare l’interdipendenza tra nucleo e citoplasma nella
regolazione delle loro grandezze. Per questo abbiamo osservato degli embrioni di C. elegans,
nei quali sono stati disattivati dei geni (grazie alla tecnica dell’RNAi intereference) che
codificano per proteine presenti sulla membrana nucleare. Queste proteine permettono un
passaggio selettivo di molecole dall’interno del nucleo verso il citoplasma e viceversa.
Abbiamo studiato la funzione di due geni: importina-α (ima-2) che è coinvolta
nell’importazione di nutrienti nel nucleo e ran-4, un polipeptide implicato sia
nell’importazione sia nell’esportazione di nutrienti dal nucleo.
bbiamo preparato alcuni embrioni in cui abbiamo inattivato il gene ani-2, che è di
fondamentale importanza nel regolare la formazione del citoscheletro nel citoplasma.
I geni citati nel paragrafo precedente sono stati inattivati grazie all’uso di differenti molecole
di RNA a doppio filamento, questa tecnica è chiamata RNA interference (RNAi). Gli RNA
vengono processati da un RNA intereference machinery che fa in modo che questi si leghino
agli mRNA per complementarietà inducendone la degradazione e quindi la loro funzione di
trascrizione. Di conseguenza viene inibita l’espressione delle proteine target. Gli RNA sono
prodotti da batteri modificati geneticamente in modo che possano esprimere questo polimero.
Per disattivare i geni negli embrioni abbiamo adottato la tecnica del “RNAi by feeding”:
abbiamo alimentato i C. elegans con batteri transgenici, l’RNA prodotto da questi ultimi è in
tal modo entrato nel verme ed è diffuso nelle gonadi femminili dove si è legato all’mRNA
target promuovendo la sua degradazione prima della formazione dell’oocita.
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Ogni esperimento ha bisogno di un controllo per evitare che fattori esterni possano modulare
il fenotipo indipendentemente dalle condizioni sperimentali. Per questo abbiamo preparato dei
C. elegans “normali”: abbiamo tagliato i vermi, estratto gli embrioni e preparato dei vetrini
(due per ogni proteina inattivata).
Alcuni embrioni sono stati preparati per immunofluorescenza. Questa tecnica consente di
studiare la localizzazione delle proteine in un campione fissato (usando agenti fissanti che
consentono di bloccare le reazioni enzimatiche cellulari) grazie all’uso di anticorpi che
riconoscono specificamente la proteina oggetto di studio. Per questo motivo è stato necessario
congelare gli embrioni per fermare il proseguimento dello sviluppo embrionale, così che li
potessimo osservare al microscopio dual time-lapse e a quello confocale.
Per ani-2(RNAi) abbiamo usato dei C. elegans che esprimevano delle proteine
immunofluorescenti. In particolare abbiamo usato
YFP-lamin, che mette in evidenza la lamina del
nucleo e mCherry-PH che localizza sulla membrana
cellulare. Per osservare la membrana cellulare e
nucleare degli embrioni sottoposti a ima-2(RNAi) e
ran-4(RNAi) abbiamo utilizzato degli anticorpi
specifici per NPP-3 (marker del poro nucleare) e per
l’alpha tubulina che è un componente dei
microtubuli..
Una volta terminata la preparazione dei vetrini,
abbiamo osservato i campioni attraverso un
microscopio che consente acquisizioni di video live
in dual time-lapse (che può acquisire immagini
grazie alla luce visibile e ultravioletta). Per
acquisire immagini ad alta definizione degli
embrioni abbiamo usato un microscopio confocale.
Queste foto sono state analizzate e le dimensioni dei
pronuclei, nuclei e citoplasma sono stati misurati in
modo analogo a prima.
Per la membrana nucleare e cellulare è stato
usato l’antigene α-rabbit (rosso) come
colorante, per la tubulina l’antigene FITC
(verde) e per il nucleo DAPI/ Hoechst (blu).
Grazie a questi esperimenti abbiamo potuto studiare la relazione che sussiste tra le dimensioni
del citoplasma e la dimensioni di nuclei e pronuclei. Per studiare se il rapporto costante
proposto da Gregory et al. è giusto abbiamo analizzato due condizioni differenti: nella prima
condizione abbiamo inattivato geni importanti per il trasporto nucleo-citoplasma, nella
seconda abbiamo ridotto la dimensione dell’embrione reprimendo l’attività di ani-2.
Per prima cosa abbiamo misurato le dimensioni dei
due pronuclei in condizioni normali e in seguito ad
inattivazione di ima-2 e ran-4.
La prima divisione cellulare dell’embrione di C.
elegans è asimmetrica, dando origine a due cellule
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(AB e P1) che sono rispettivamente 60 e 40% del volume della cellula madre (P0). Quindi
abbiamo confrontato citoplasma e nuclei di P1 con quelli di AB. Questo confronto è utile in
quanto il citoplasma della cellula AB ha delle dimensioni maggiori rispetto a quello di P1 di
conseguenza, se la relazione fosse corretta, osserveremmo che il nucleo maschile avrebbe
dimensioni ridotte rispetto a quello femminile e i rapporti sarebbero uguali.
Se la legge proposta da Gregory et al. fosse corretta una variazione del volume del citoplasma
provocherebbe una proporzionale variazione del
AB e P1
volume del nucleo e viceversa. Per provare la validità
AB
della relazione abbiamo effettuato sottoposto i vermi a
ani-2(RNAi).
Volevamo quindi constatare se le dimensioni dei due
nuclei sarebbero cambiate al modificarsi della taglia del
citoplasma.
Risultati e discussione
95
90
85
80
75
70
65
pronuclear size
WT
Ima-2
Ran-4
female
male
Inattivazione di ima-2 e ran-4 - Come si può osservare dal grafico, entrambe le condizioni di
RNAi influenzano la grandezza dei pronuclei. Notiamo infatti che entrambi diminuiscono la
loro dimensione. Di conseguenza possiamo concludere che il trasporto tra nucleo e citoplasma
è determinante per la taglia del nucleo e del pronucleo. Inoltre possiamo definitivamente
rispondere alla domanda di partenza che chiedeva quali meccanismi regolano le dimensioni
del pronucleo e nucleo, indicando ima-2 e ran-4 come principali regolatori. Possiamo infatti
osservare nella parte sinistra del grafico i dati concernenti i pronuclei di P0 in wild-type C.
elegans. Nella parte destra del grafico si può notare la differente dimensione di nuclei e
pronuclei in seguito all’inattivazione di ima-2 e ran-4.
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Passiamo ora ai risultati del secondo problema. I due set di esperimenti sono riassunti in un
unico grafico.
In esso sono mostrati i rapporti tra dimensione del nucleo e dimensione del citoplasma. In blu
sono mostrati i dati relativi ad N2 mentre in rosso quelli relativi a ani-2(RNAi). Le prime due
colonne mostrano il rapporto tra il volume dei pronuclei, femminile e maschile, con P0,
mentre le altre due mostrano il rapporto esistente tra il volume del nucleo e del citoplasma in
AB e P1 rispettivamente.
Vn/Vc
in P0, AB and P1
0.04500
0.04000
0.03500
0.03000
0.02500
0.02000
0.01500
0.01000
0.00500
N2
ani-2(RNAi)
p0 f
p0 m
AB
P1
Come si può notare, il rapporto tra nucleo e citoplasma varia di molto, sia tra la parte
maschile e quella femminile, che tra l'individuo normale e quello modificato con l'ani2(RNAi).
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Come si può notare dalle immagini sottostanti, le dimensioni dei nuclei in seguito a ani2(RNAi) sono simili a quelle dell'embrione del verme wild-type, malgrado il suo citoplasma
sia di dimensioni visivamente ridotte. Una simile conclusione si può trarre osservando le
immagini successive in cui il nucleo di AB e quello di P1 sono di uguali dimensioni malgrado
la diversa taglia dei citoplasma e questo giustifica un aumento del rapporto Vn/Vc in seguito
all’inattivazione di ani-2.
Conclusioni:
1)
La prima conclusione a cui si può giungere è che le dimensioni dei due nuclei è
influenzata dal flusso di proteine tra citoplasma e nucleo. Grazie a questo studio possiamo
confermare che IMA-2 e RAN-4 sono due molecole regolatrici fondamentali per il controllo
della dimensione del nucleo.
2)
La seconda conclusione che si può trarre dalle nostre analisi è che negli embrioni del
C. elegans il rapporto tra grandezza del nucleo e grandezza del citoplasma non è costante.
Infatti modificando la grandezza dei citoplasmi i nuclei rimangono costanti e il rapporto
risulta alterato.
Ringraziamenti:
In particolare vorremmo ringraziare il nostro tutor Christian Gentili, che ci ha seguito durante
tutto l'arco della settimana ed è sempre stato molto disponibile a spiegarci ed aiutarci in caso
di difficoltà. Vorremmo inoltre ringraziare il suo collega Alessandro de Simone che ci ha
aiutato nel nostro progetto e mostrato un'interessante parte del suo lavoro e il Professor Pierre
Gönczy che è sempre stato molto gentile e disponibile a seguirci e consigliarci e ci ha dato la
possibilità di partecipare a questo progetto nel suo laboratorio.
Vorremmo ringraziare l’EPFL di Losanna per l'ospitalità, l'associazione “La science appelle
les jeunes” per averci dato questa incredibile opportunità, e infine tutti gli organizzatori che
l'hanno resa possibile, in particolare Olivia de Pol e Alice Emery-Goodmann.
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