ELISA per IFN

ELISA per Interferon (IFN)-alfa suino
1. Adsorbire la piastra ELISA con anticorpo monoclonale (mAb) anti-IFN alfa
suino F17 a 4 µg/ml (in tampone Carbonato / Bicarbonato 0,1 M, pH 9,6), a 50
µl/pozzetto (pz). Verificare la distribuzione omogenea dell’inoculo nel
pozzetto. Incubare a 4°C per 18 ore circa.
2. Svuotare la piastra ed asciugare su carta
3. Aggiungere 200 µl/pz di Assay Buffer (PBS senza Ca e Mg + 4% sieroalbumina bovina, BSA; pH =7,2).
4. Incubare 1 h a 26 °C.
5. Effettuare 3 lavaggi da 5 minuti (3x5 min) con Wash Buffer (50 mM Tris +
0,2% Tween 20, pH=8,00).
6. Aggiungere 50 µl/pz dei campioni in esame almeno in duplicato.
7. Aggiungere in duplicato 50 µl/pz di standard (IFN-alfa ricombinante suino a
5000 UI/ml) ed eseguire poi altre 7 diluizioni in base logaritmica 3, lasciando
50 µl/pz di ciascuna diluizione
8. Aggiungere 50 µl/pz di terreno per colture cellulari* o Assay Buffer ai
controlli substrato (KS) e coniugato (KC). Allestire di norma 4 pozzetti di KC
e 4 pozzetti di KS.
9. Incubare 1h a 26 °C.
10.Senza svuotare, aggiungere 50 µl/pz di mAb biotinilato anti-IFN alfa suino K9
a 1µg/ml in Assay Buffer in tutti i pz.
11.Incubare 1h a 26 °C.
12.Lavare 3x5 min con Wash Buffer.
13.Aggiungere 100 µl/pz di coniugato streptoavidina-perossidasi (HRP) (alla
diluizione consigliata dal produttore e verificata in prove pilota).
14.Aggiungere terreno o Assay Buffer nei pozzetti KS.
15.Incubare 30 min a 26 °C.
16.Lavare 3x5 min con Wash Buffer
17.Aggiungere 50 µl/pz di Ortofenilenediamina (OPD) a 0,5 mg/ml in tampone
fosfato/citrato 0,1 M, pH 5,0 + H2O2 0.02% finale (da aggiungere all’ultimo
momento).
18.Incubare 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
19.Bloccare con 50 µl/pz di acido solforico 2 N.
20.Leggere a 492 nm dopo aver eliminato tutte le eventuali bolle nei pozzetti
(usare un ago di siringa).
21. Verificare la media di DO nei pozzetti KC, che costituisce il “fondo” della
reazione.
22. Costruire una curva standard DO / UI di IFN alfa e calcolare la concentrazione
nei campioni sulla base di quest’ultima.
Bibliografia
Diaz de Arce H, Artursson K, L’Haridon R, Perers A, La Bonnardiere C, Alm GV.
1992. A sensitive immunoassay for porcine interferon-alpha. Vet Immunol
Immunopathol 30:319–327.
Referente: Massimo Amadori, e-mail: [email protected]
* RPMI 1640 + 10% Siero Fetale Bovino, da impiegare per campioni da
colture cellulari.