Estrazione di DNA plasmidico da cellule batteriche

ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO da CELLULE BATTERICHE
(LISI ALCALINA)
Questa metodica di estrazione costituisce un'alternativa alla metodica "QIAscreen" quando il
plasmide da estrarre ha dimensioni superiori a 4-5 K.
Materiale Occorrente
Soluzione 1:
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50 mM glucosio
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10 mM EDTA
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25 mM Tris-HCl (pH 8)
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4 mg/ml di lisozima da aggiungere prima dell'uso (si può anche omettere).
Soluzione 2
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0.2 N NaOH
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1% SDS
Soluzione 3: potassio acetato (pH 4.8)
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60 ml potassio acetato 5 M
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11.5 ml acido acetico glaciale
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28.5 ml acqua distillata
la soluzione risultante è 3 M per il potassio e 5 M per l'acetato.
Fenolo-cloroformio.
Etanolo 96%.
Etanolo 70%.
TE + RNasi(20 µg/ml).
Procedura
Inoculare il ceppo batterico in 3-5 ml di terreno di coltura (in genere un terreno
massimo, come LB) contenente l'eventuale antibiotico selettivo ed incubare tutta la notte in
agitazione vigorosa e in condizioni di temperatura ottimali per la crescita della coltura
batterica.
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La mattina successiva trasferire 1.5 ml della sospensione batterica in un tubo Eppendorf
e centrifugare per 1' a 12000 rpm (NOTA: una centrifugazione più prolungata provoca una
difficile risospensione del pellet cellulare nella fase successiva).
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Eliminare il sopratante, aggiungere 1.5 ml della sospensione cellulare e centrifugare
come sopra (NOTA: questo secondo punto può essere omesso se il plasmide da estrarre è
presente nella cellula ospite in alto numero di copie).
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Eliminare il sopratante, cercando di lasciare il pellet più asciutto possibile.(Per questa
manovra può essere utilizzata una pipetta Pasteur affilata, prestando attenzione a non
risucchiare via il pellet). Il pellet può essere conservato a -20°C fino al momento dell'uso.
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Aggiungere 100 µl di soluzione 1 tenuta in ghiaccio e risospendere il pellet con il vortex.
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Incubare per 5' a temperatura ambiente.
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Trasferire il tubo eppendorf a 0°C (ghiaccio + acqua) ed attendere 1' prima di
procedere al punto successivo (NOTA: quest'ultimo passaggio è facoltativo; serve a pre raffreddare il tubo a 0°C) .
invertendo il tubo 5
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Aggiungere 200 µl di soluzione 2 e mescolare
volte (Attenzione:NON VORTEXARE).
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Incubare a 0°C per 5'.
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Aggiungere 150 µl soluzione 3 fredda ed agitare immediatamente invertendo il tubo 2-3
volte, oppure vortexando molto lentamente per 10" con il tubo capovolto.
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Incubare a 0°C per 5'.
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Centrifugare 5', a 4°C, a 12000-14000 rpm.
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Trasferire il sopratante in un nuovo tubo Eppendorf, utilizzando una P1000 oppure una
pipetta Pasteur affilata, prestando attenzione a non aspirare il precipitato bianco.
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Aggiungere un ugual volume di fenolo-cloroformio (saturato in Tris pH 8) a temperatura
ambiente e vortexare bene
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Centrifugare per 2' a 12000-14000 rpm, a temperatura ambiente.
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Trasferire il sopratante in un nuovo tubo Eppendorf, con una P1000 o con una pipetta
Pasteur affilata, evitando il materiale eventualmente presente all'interfaccia tra le due
fasi.(NOTA: se il sopratante appare torbido, come in genere succede quando il DNA plasmidico
viene estratto da batteri particolarmente ricchi in esopolissaccaridi, è necessario ripetere il
lavaggio in fenolo-cloroformio).
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Aggiungere 2V (circa 900 µl) di etanolo 96%; vortexare ed incubare a temperatura
ambiente per 2'.
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Centrifugare a 12000-14000 rpm per 5' a temperatura ambiente.
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Eliminare il sopratante versandolo direttamente oppure prelevandolo con una pipetta
Pasteur affilata.(NOTA: se la preparazione è pulita il pellet non è visibile).
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Aggiungere 700 µl di etanolo 70% e centrifugare a temperatura ambiente per almeno
2'.
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Eliminare il sopratante come sopra e tenere per qualche minuto il tubo aperto capovolto
su carta assorbente per eliminare l'eccesso di etanolo.
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Essiccare il pellet.
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Risospendere il pellet in 20 µl di TE + RNasi(20 µg/ml).
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Incubare per 30' a 37°C.
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Controllare l'esito dell'estrazione mediante elettroforesi su gel d'agarosio.
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Il DNA plasmidico estratto può essere conservato a 4°C oppure essere congelato a 20°C.
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Per plasmidi ad alto numero di copie, come i plasmidi della serie pUC, la resa è di circa
3-5 µg per ml di coltura.
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immediatamente