Saggio di IFN

Elisa per IFN-γγ suino
Campioni possibili:
A) Sovrastanti di colture linfocitarie o colture in toto di sangue suino stimolate
con un antigene microbico di interesse e con un opportuno antigene di
controllo negativo.
B) Sieri o plasmi suini ex vivo.
Procedura:
1. Adsorbire una piastrina Maxi Sorp NUNC per ELISA con anticorpo
monoclonale (mAb) Capture P2F6 (Thermogel) a 4µg/ml in tampone
carbonato-bicarbonato 0,1 M pH 9,6 al volume di 50µl/pozzetto (pz) nelle
colonne previste per i campioni in esame. Incubare 1 notte a 4°C con coperchio.
2. Svuotare la piastrina e asciugare su carta
3. Aggiungere 200µl/pz di Assay Buffer (PBS + sieroalbumina bovina (BSA) 4%,
pH 7,2).
4. Incubare 1h. a 26 °C.
5. Svuotare la piastrina e lavare tre volte (3X) per 5’ ogni volta con Wash Buffer
(50mM di Tris + Tween 20 0,2% , pH 8,00)
6. Aggiungere in 4 pz lo standard interno di IFN-γ suino a 50µl/pozzetto; esso è
costituito da un surnatante di coltura linfocitaria suina stimolata con
fitoemoagglutinina (PHA)-P. Tale standard (controllo positivo, K+) deve essere
diluito in Assay Buffer alla concentrazione in grado di produrre una densità
ottica ≥ 0,5. Aggiungere poi in duplicato nei pozzetti programmati 50µl/pozzetto
dei campioni in esame. I controlli negativi sono costituiti da Assay Buffer a 50
µl/pz in 4 pozzetti, rispettivamente, per il controllo coniugato (KC) e il
controllo substrato (KS).
7. Incubare 1h. a 26°C
8. Senza svuotare, aggiungere 50µl/pz di mAb biotinilato anti-IFN-γ suino
MP701B (Thermogel) a 2µg/ml in Assay Buffer in tutti i pz.
9. Incubare 1h. a 26 °C
10.Lavare 3 X 5’ con Wash Buffer (50mM di Tris + Tween20 0,2% , pH 8,00)
11.Aggiungere 100µl/pz di coniugato streptoavidina-perossidasi (HRP) in Assay
Buffer in tutti i pz tranne quelli del KS in cui andrà solo Assay Buffer allo stesso
volume.
12.Incubare 30’ a temperatura ambiente. Scongelare nel frattempo una soluzione di
orto-fenilendiamina (OPD) a 0,5 mg/ml in tampone fosfato/citrato pH 5,0.
13. Lavare 3 X 5’ la piastrina con Wash Buffer (50mM di Tris + Tween20 0,2% ,
pH=8,00)
14. Aggiungere a 6 ml di soluzione di OPD 4µl di H2O2 30% e vortexare.
Aggiungere poi 50µl/pz di tale soluzione a tutti i pz della piastrina.
15.Incubare 15’ a temperatura ambiente al buio.
16.Bloccare la reazione con H2SO4 2N a 50µl/pz.
17.Eliminare le eventuali bolle d’aria nei pozzetti. Leggere allo spettrofotometro a
492 nm.
Interpretazione :
Il saggio sopra descritto potrà essere impiegato in forma semi-quantitativa per
dimostrare la risposta IFN-γ Ag-specifica sui campioni di tipo A (vedi sopra),
adottando opportuni livelli di soglia.
Il saggio potrà essere adottato anche per determinare i livelli in vivo della
citochina (campioni di tipo B), sostituendo lo standard interno di cui al punto 6 con
diluizioni seriali di IFN-γ ricombinante suino sulle quali interpolare una curva
standard.
Referente: Massimo Amadori, e-mail: [email protected]
Bibliografia
Dotti, S., Villa, R., Sossi, E., Guadagnini, G., Salvini, F., Ferrari, M., Amadori, M.,
2011. Comparative evaluation of PRRS virus infection in vaccinated and naive pigs.
Res. Vet. Sci. 90, 218-225.