HEV IgM ELISA - MP Biomedicals

DESCRIZIONE DEI SIMBOLI UTILIZZATI
Sui prodotti MP Diagnostics e relative confezioni si possono
trovare i simboli grafici descritti di seguito. Sono i simboli
generalmente utilizzati per l’etichettatura dei dispositivi medici.
Per informazioni più dettagliate consultare la norma britannica
ed europea BS EN 980: 2003.
HEV IgM ELISA
Utilizzare entro
Sinonimo:
Data di scadenza
Dispositivo medico
diagnostico in vitro
Codice partita
Sinonimi:
Numero di lotto:
Numero di partita
Numero di
catalogo
Limitazione di
temperatura
DATA DI REVISIONE: 05/05
MBL 0011-ITA-0
Attenzione.
Vedere le Istruzioni
per l’uso
Nota: modifiche evidenziate
Produttore
21160-096T (kit per 96 test)
Contiene il necessario
per l’esecuzione di
<n> analisi
NOME E USO PREVISTO
Rappresentante
autorizzato per la
Comunità Europea
Vedere le
Istruzioni per l’uso
Non riutilizzare
HEV IgM ELISA di MP Diagnostics (MPD) è un test
immunoenzimatico indicato per il rilevamento degli anticorpi
IgM anti virus dell’epatite E (HEV) nel siero o nel plasma umano.
INTRODUZIONE
PRINCIPI CHIMICI E BIOLOGICI DELLA PROCEDURA
Le principali epidemie di epatite non-A, non-B (ET-NANBH),
trasmessa per via enterica, si ritrovano nelle aree in via di
sviluppo, come Asia, ex-USSR, America centrale e Africa (1,2).
Casi sporadici sono stati registrati anche in Paesi
industrializzati, come Australia, Regno Unito e Stati Uniti (3,4,5).
In questo scenario le infezioni sono spesso associate a viaggi
nelle regioni endemiche.
I pozzetti delle strisce di micropiastre in polistirene sono rivestiti
da tre antigeni HEV ricombinanti che corrispondono alle regioni
strutturali del virus dell’epatite E. Il siero o il plasma umano,
diluiti in soluzione tampone, vengono incubati in questi pozzetti
rivestiti. Gli anticorpi specifici dell’HEV, se presenti, si legano
agli antigeni HEV presenti nella fase solida. I pozzetti vengono
quindi accuratamente lavati per rimuovere ogni residuo di
sostanze non legate e un anticorpo murino anti IgM umane
coniugato con perossidasi di rafano viene aggiunto ai pozzetti.
L’anticorpo coniugato si lega ai complessi antigene-anticorpo
formatisi in precedenza. Viene eseguito un lavaggio per
rimuovere l’eccesso di reagente coniugato. Una soluzione di
substrato contenente 3, 3’, 5, 5’-tetramethylbenzidine (TMB)
viene quindi aggiunta in ciascun pozzetto. La presenza di
anticorpi specifici è rivelata mediante la comparsa di colore
blu dopo l’aggiunta del substrato. La reazione viene arrestata
tramite l’aggiunta di acido cloridrico. L’intensità del colore è
misurata con uno spettrofotometro a 450 nm ed è proporzionale
alla quantità di anticorpi presenti nel campione.
Il decorso è normalmente acuto e autolimitante, senza
conseguenze croniche. La patologia mostra un’elevata
incidenza di mortalità nelle donne al terzo trimestre di
gravidanza, circa 10-20% (1) e un tasso di mortalità di 1-2%
nella popolazione generale, pari a 10 volte quello dell’epatite
A (HAV). Grazie alla clonazione dell’agente eziologico della
ET-NANBH e all’identificazione dei comuni epitopi virali (6,7),
è stato possibile sviluppare strumenti diagnostici specifici in
grado di rilevare gli anticorpi anti HEV.
Studi condotti sui bambini egiziani a Benha nel 1986 hanno
dimostrato che precedenti esposizioni all’HEV inducono una
risposta immunitaria IgG (8). Tale risposta può essere transitoria
e scomparire in 6 mesi oppure ripresentarsi anche dopo oltre
8 anni, come evidenziato da un recente studio condotto a
Taiwan (9). La risposta IgM invece sembra essere limitata alla
fase acuta dell’infezione da HEV. In precedenza era possibile
rilevare la risposta acuta all’infezione da HEV attraverso
l’osservazione di particelle virali nelle feci degli individui infetti
tramite immunoelettromicroscopia (IEM) o PCR (10,11). Questi
metodi richiedono strumentazione costosa ed esperienza
specifica dell’operatore. Inoltre le particelle virali vengono
prodotte in piccola quantità e il titolo può non essere sufficiente
per la determinazione. HEV IgM ELISA di MP Diagnostics
utilizza antigeni HEV ricombinanti dalla regione strutturale del
genoma virale per rilevare la presenza di anticorpi IgM associati
ad un’infezione acuta.
1
COMPONENTI DEL KIT
Descrizione dei componenti
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Quantità
fornita
MICROPIASTRA HEV
Dodici strisce da 8 pozzetti per
piastra, sigillate in una confezione
di alluminio, con materiale
assorbente. Ciascun pozzetto della
micropiastra contiene proteine
HEV ricombinanti adsorbite.
Conservare a 2 - 8°C.
1 piastra
(96 pozzetti)
CONTROLLO NON REATTIVO
Siero umano normale inattivato,
non reattivo per anti-HCV, antiHEV, HBsAg e anti-HIV 1.
Contiene sodio azide e thimerosal
come conservanti. Conservare a
2 - 8°C.
1 provetta
(160 Øl)
CONTROLLO REATTIVO
Siero umano inattivato, contenente
un elevato titolo di anticorpi IgM
specifici per HEV. Contiene sodio
azide e thimerosal come
conservanti. Conservare a 2 - 8°C.
1 provetta
(80 Øl)
DILUENTE
Soluzione salina tris contenente
siero di capra normale trattato con
calore, albumina di siero bovino e
stabilizzanti. Contiene BronidoxTM
come conservante. Conservare a
2 - 8°C.
1 flacone
(100 ml)
SOLUZIONE DI LAVAGGIO
CONCENTRATA (20X)
Soluzione salina con tampone
fosfato e Tween-20. Contiene
cloroacetamide
come
conservante. Conservare a 2 - 8°C.
1 flacone
(120 ml)
CONIUGATO
Anticorpo murino anti IgM umane
coniugato con perossidasi di
rafano. Contiene il 0,02% di
thimerosal come conservante.
Conservare a 2 - 8°C.
1 provetta
(70 Øl)
SUBSTRATO
Tampone contenente 3, 3’, 5, 5’tetramethylbenzidine.
Conservare al buio a 2 - 8°C.
1 flacone
(12,5 ml)
SOLUZIONE DI ARRESTO
Soluzione di acido cloridrico 1N.
Conservare al buio a 2 - 8°C.
1 flacone
(30 ml)
COPERCHI PER PIASTRE
Coperchi adesivi per micropiastre
da applicare durante l’incubazione.
4 pezzi
MANUALE D’ ISTRUZIONI
1 copia
1.
2.
3.
Solo per uso diagnostico in vitro.
Solo per uso professionale.
Per informazioni sui componenti potenzialmente pericolosi
leggere le etichette apposte sui prodotti.
NORME DI SICUREZZA
ATTENZIONE: Questo kit contiene sostanze di
origine umana. Nessun metodo di prova è in
grado di garantire con assoluta certezza che i
prodotti derivati dal sangue umano non
trasmettono infezioni.
MANIPOLARE I CAMPIONI PER L’ANALISI NONCHÉ I
CONTROLLI REATTIVI E NON REATTIVI COME AGENTI
POTENZIAMENTE INFETTIVI. Si consiglia di manipolare i
componenti e i campioni di analisi nel rispetto delle normali
pratiche operative di laboratorio. Lo smaltimento del materiale
dovrà essere effettuato in conformità alle procedure di sicurezza
stabilite.
Il controllo reattivo e il controllo non reattivo contengono
thimerosal e sodio azide. Il sodio azide può reagire con il rame
o il piombo utilizzati in alcuni impianti idraulici con la
conseguente formazione di sali esplosivi. Sebbene le quantità
utilizzate in questo kit siano limitate, si raccomanda comunque
di smaltire sempre i materiali contenenti azide in abbondante
acqua corrente onde evitare l’accumulo di metallo-azide
nell’impianto idraulico.
BronidoxTM è un marchio di Henkel Chemical Co.
2
1.
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti nell’aprire
le provette o i flaconi originali e prelevare i materiali.
2.
Non pipettare con la bocca.
3.
Maneggiare i campioni d’analisi, le micropiastre, i controlli
reattivi e non reattivi come agenti potenzialmente infettivi.
4.
Indossare indumenti da laboratorio e guanti monouso
durante l’esecuzione delle analisi. I guanti devono essere
gettati negli appositi contenitori a rischio biologico. Lavarsi
accuratamente le mani al termine dell’operazione.
5.
Si raccomanda di eseguire il test in una struttura apposita
per test con rischio di contaminazione biologica.
6.
Evitare il contatto dei materiali con cibi e bevande.
7.
In caso di contatto con gli occhi sciacquare
immediatamente con abbondante acqua e richiedere
assistenza medica.
8.
In caso in ingestione o di contatto dei materiali contaminati
con ferite aperte o altre lacerazioni cutanee, consultare
immediatamente il medico.
9.
Non aggiungere mai acqua alla soluzione di arresto.
10. Asciugare immediatamente ogni versamento di materiale
potenzialmente infettivo con carta assorbente e tamponare
l’area contaminata con una soluzione di ipoclorito di sodio
all’1% prima di riprendere il lavoro. In presenza di
versamenti di sostanze contaminanti acide, asciugare
l’area con carta assorbente prima di applicare l’ipoclorito
di sodio. Tutto il materiale usato (inclusi i guanti monouso)
dovrà essere smaltito come materiale a rischio biologico.
Non autoclavare il materiale contenente ipoclorito di sodio.
9.
Tutti i reagenti dovranno essere miscelati accuratamente
prima dell’uso.
10. La soluzione di lavoro del coniugato e il tampone di
lavaggio diluito devono essere preparati subito prima
dell’uso.
11. Evitare di esporre i reagenti o di eseguire i test in un
ambiente contenente un grado elevato di vapori di
disinfettanti chimici (ad es. vapori di ipoclorito) durante le
fasi di conservazione e incubazione. Il contatto inibisce la
reazione cromatica. Non esporre i reagenti ad eccessiva
luminosità.
11. Prima dell’eliminazione, sterilizzare in autoclave tutto il
materiale utilizzato e°contaminato a 121°C a 15 p.s.i. per
30 minuti. In alternativa, decontaminare i materiali in una
soluzione di ipoclorito di sodio al 5% per 30-60 minuti prima
di gettarli negli appositi contenitori a rischio biologico.
12. Non rimuovere le micropiastre delle apposite confezioni
se non immediatamente prima dell’uso. Le strisce aperte
e non utilizzate devono essere conservate a 2°C - 8°C
nel portastrisce dotato di materiale assorbente.
12. Decontaminare tutti i reagenti e le sostanze chimiche
impiegate in una soluzione di ipoclorito di sodio con una
concentrazione finale pari almeno all’1%. Lasciare agire
per 30 minuti per garantire un’efficace decontaminazione.
13. I controlli del kit devono essere analizzati
contemporaneamente ai campioni dei pazienti per ogni
ciclo di analisi.
PRECAUZIONI D’ IMPIEGO
1.
Per ottenere prestazioni ottimali dal test occorre SEGUIRE
RIGOROSAMENTE le procedure illustrate nel presente
Manuale di istruzioni. Qualsiasi deviazione dalla procedura
può provocare risultati erronei.
14. Evitare accuratamente di toccare il bordo del pozzetto o
di contaminarlo con goccioline di coniugato. Non soffiare
materiale fuori dalle micropipette. Quando sia possibile,
si raccomanda di utilizzare il pipettaggio inverso.
2.
NON MODIFICARE O SCAMBIARE REAGENTI DI KIT
APPARTENENTI A LOTTI DIVERSI. I controlli, il coniugato
e le micropiastre sono stati abbinati per ottenere
prestazioni ottimali. Utilizzare unicamente i reagenti forniti
con il kit.
15. L’utilizzo di campioni altamente emolizzati, di siero non
completamente coagulato, di campioni di plasma
contenenti fibrina o di campioni con contaminazione
microbica può essere causa di risultati erronei.
3.
Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza
riportata sulla confezione.
4.
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti nell’aprire
le provette o i flaconi originali e prelevare i materiali poiché
ne potrebbero derivare risultati erronei nonché la
prematura riduzione della durata di conservazione del
prodotto. Utilizzare tecniche asettiche, incluse pipette o
punte di pipette monouso, per l’aspirazione dei materiali
dai flaconi.
5.
6.
16. NON UTILIZZARE INCUBATORI AD ACQUA PER
INCUBARE LE PIASTRE.
17. Non utilizzare incubatori a CO2.
18. Durante l’incubazione a 37°C, è necessario prevenire
l’evaporazione. Coprire le piastre con i coperchi adesivi
forniti in dotazione.
19. Evitare la ripetuta apertura e chiusura della porta
dell’incubatore durante le fasi di incubazione.
Per evitare una contaminazione incrociata, cambiare la
punta della pipetta tra un campione e l’altro e non toccare
le estremità delle strisce, il bordo dei pozzetti o il liquido
contenuto nei pozzetti con le dita o con le punte delle
pipette.
20. Evitare di conservare la soluzione di stop in un piatto piano
o di versarla in un flacone di scorta dopo l’utilizzo.
21. Accertarsi che il fondo della piastra sia pulito e asciutto e
che non si siano formate bolle sulla superficie del liquido
prima di leggere la piastra. Rimuovere le eventuali bolle
presenti nel pozzetto picchiettando delicatamente.
Tutto il materiale di vetro che sarà utilizzato con i reagenti
dovrà essere lavato con acido cloridrico 2M e sciacquato
abbondantemente con acqua distillata o deionizzata prima
dell’uso.
7.
Per ottenere risultati ottimali, lasciare che tutti i reagenti e
i campioni raggiungano la temperatura ambiente (25°C ±
3°C) prima dell’uso. Riportarli ad una temperatura di
2-8°C subito dopo l’uso.
8.
Per diluire i reagenti utilizzare unicamente acqua
deionizzata, distillata o comunque di qualità idonea.
22. In caso di impiego di strumentazione automatica,
accertarsi che questa sia validata prima dell’uso.
23. Si raccomanda vivamente di effettuare regolarmente la
manutenzione ordinaria del sistema di aspirazione/
lavaggio per evitare ogni rischio di contaminazione dai
campioni altamente reattivi ai campioni non reattivi.
3
ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE
1.
2.
3.
4.
5.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Conservare il kit HEV IgM ELISA di MPD e i relativi
componenti a 2 - 8°C quando non vengono utilizzati.
Se conservati alla temperatura di 2 - 8°C, tutti i reagenti di
analisi e le micropiastre mantengono la stabilità fino alla
data di scadenza indicata sul kit. Non congelare i reagenti.
La conservazione della Soluzione di lavaggio concentrata
(20x) a 2 - 8°C può provocare la formazione di cristalli,
che dovranno essere sciolti riscaldando il concentrato a
37°C prima dell’uso.
La conservazione del diluente a 2-8°C può provocare la
formazione di precipitato. Questo, tuttavia, non avrà alcuna
influenza sulle prestazioni del kit.
Le strisce di micropiastre aperte e non utilizzate devono
essere conservate a 2 - 8°C, con il materiale assorbente
in dotazione, in una confezione chiusa.
1.
a.
b.
c.
d.
SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO
La SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO deve
essere preparata subito prima dell’uso.
Per preparare il coniugato diluito, diluire 1:200 con il
diluente fornito nel kit.
Utilizzare unicamente contenitori o provette in
polipropilene.
Per la preparazione della soluzione di lavoro del coniugato
consultare la tabella.
TABELLA DI PREPARAZIONE DEL CONIUGATO
Numero di test
RACCOLTA, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI
CAMPIONI
I campioni devono essere conservati a 2 - 8°C se il test deve
essere eseguito entro 7 giorni dalla raccolta oppure congelati a
-20°C o temperature inferiori se il test è previsto per una data
successiva. Utilizzare preferibilmente campioni trasparenti e
non emolizzati. I campioni lipemici, itterici o contaminati (a causa
di particelle) devono essere filtrati (0,45Øm) o centrifugati prima
dell’analisi.
2.
a.
b.
Il siero dei pazienti può essere inattivato, tuttavia ciò non è
indispensabile per ottenere risultati ottimali.
Per l’inattivazione, procedere nel modo seguente:
1. Allentare i cappucci dei contenitori del siero.
2. Riscaldare il siero a 56°C per 30 minuti in un’incubatrice
ad acqua.
3. Lasciare raffreddare il siero prima di serrare nuovamente
i cappucci.
4. Fino al momento dell’analisi, il siero può essere conservato
congelato.
Si raccomanda di non sottoporre il siero dei pazienti a ripetuti
cicli di congelamento e scongelamento prima del test.
MATERIALI OCCORRENTI MA NON PRESENTI NEL KIT
1.
2.
3.
4.
Carta assorbente da banco monouso e salviette di carta.
Provette o contenitori in polipropilene.
Pipette graduate: 5 ml, 10 ml.
Pipetta multicanale in grado di erogare 50 Øl, 100 Øl e 200
Øl.
5. Pipetta in grado di erogare 1-1000 Øl.
6. Punte di pipette monouso.
7. Serbatoi di reagente (vaschette) con capacità di 25 ml.
8. Acqua deionizzata o distillata, di grado reagente.
9. Matracci: 500 ml, 1 litro.
10. Un incubatrice da 37°C.
11. Lettore di piastre per microanalisi a lunghezza d’onda
doppia (A450-A620) o singola (A450).
12. Soluzione di ipoclorito di sodio (5%) o candeggina liquida
per uso domestico.
4
Vol. di coniugato(Øl) Vol. di diluente (ml)
24
15
3,0
48
30
6,0
72
45
9,0
96
60
12,0
TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO
Il TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO deve essere
preparato subito prima dell’uso.
Diluire 1 volume di CONCENTRATO LAVAGGIO PIASTRE
in 19 volumi di acqua distillata (grado reagente). Mescolare
accuratamente. Per il lavaggio di 1 piastra sono necessari
circa 400 ml di tampone di lavaggio.
B. Lavatore manuale per micropiastre Aspirare completamente il contenuto
di tutti i pozzetti abbassando
lentamente la punta dell’aspiratore
fino al fondo di ciascun pozzetto.
FARE ATTENZIONE A NON
GRAFFIARE LA SUPERFICIE DEI
POZZETTI. Riempire l’intera piastra
con almeno 300 Øl per ciascun
pozzetto,
quindi
aspirare
immediatamente nello stesso ordine.
Eseguire questo ciclo per sei (6) volte.
PROCEDURA DI ANALISI
IMPORTANTE: Le analisi immunologiche di questo tipo sono
sensibili alla temperatura e soggette a vincoli temporali. La
rigorosa osservanza della presente procedura garantisce
prestazioni ottimali dell’analisi. Qualsiasi deviazione dalla
procedura raccomandata può provocare risultati erronei.
1.
Estrarre la micropiastra dalla confezione
in alluminio.
2.
Agitare il campione e controllare le
provette prima dell’uso.
3.
Riempire una vaschetta con DILUENTE.
Utilizzando una pipetta multicanale,
aggiungere 200 Øl di DILUENTE a
ciascun pozzetto.
200 Øl
4.
I pozzetti A1 e B1 sono per i ‘BIANCHI’
NON VERSARE CAMPIONI IN QUESTI
POZZETTI. Aggiungere ulteriori 10 Øl di
diluente in questi pozzetti.
10 Øl
5.
Aggiungere 10 Øl di campione al pozzetto
assegnato, partendo da H1. In questo
modo si ottiene una diluizione finale del
campione pari a 1: 21. NON
INTRODURRE CAMPIONE NEI
POZZETTI VUOTI.
10 Øl
6.
Una volta aggiunto il campione di analisi,
aggiungere 10 Øl di CONTROLLO NON
REATTIVO per pozzetto nei pozzetti C1,
D1 & E1.
10 Øl
7.
Aggiungere 10 Øl di CONTROLLO
REATTIVO per pozzetto nei pozzetti F1
e G1. Mescolare accuratamente
picchiettando delicatamente su tutti i lati
della micropiastra, prestando attenzione
a tenere la piastra in posizione
orizzontale sul banco di lavoro.
10 Øl
8.
9.
12. Asciugare a fondo capovolgendo la
micropiastra
e
picchiettando
energicamente sulla carta assorbente.
Tutti i residui di tampone di lavaggio della
piastra dovranno essere asciugati. La
permanenza di residui di tampone di
lavaggio delle piastre potrebbe impedire
la formazione del colore durante
l’incubazione del substrato.
Coprire attentamente la micropiastra con
il coperchio in dotazione per impedire
l’evaporazione durante l’incubazione.
Incubare per 30 minuti a 37°C (per
l’incubazione non utilizzare incubatori
ad acqua a 37°C ).
30 minuti
100 Øl
14. Incubare la micropiastra per 30 minuti
a 37°C (non utilizzare incubatori ad
acqua a 37°C per l’incubazione).
30 minuti
15. Togliere il coperchio dalla piastra e
gettarlo via. Ripetere la procedura di
lavaggio indicata ai punti 11 e 12.
300 Øl per
pozzetto x 6
16. Riempire
una
vascgetta
con
SOLUZIONE
DI
SUBSTRATO.
Utilizzando una pipetta multicanale,
aggiungere 100 Øl di SOLUZIONE DI
SUBSTRATO in ciascun pozzetto.
Applicare un coperchio sulla piastra.
100 Øl
17. Incubare per 15 minuti al buio a
temperatura ambiente (25 ± 3°C).
15 minuti
18. Togliere il coperchio dalla piastra e
gettarlo via.
10. Preparare LA SOLUZIONE DI LAVORO
DEL CONIUGATO secondo quanto
illustrato nella PREPARAZIONE DEI
REAGENTI prima di lavare la
micropiastra.
11. Rimuovere e gettare il coperchio, quindi
lavare la micropiastra con il TAMPONE
DI LAVAGGIO DILUITO adottando l’uno
o l’altro metodo raccomandato:
13. Riempire
una
vaschetta
con
SOLUZIONE DI LAVORO DEL
CONIUGATO. Utilizzando una pipetta
multicanale, aggiungere 100 Øl di
SOLUZIONE DI LAVORO DEL
CONIUGATO in ciascun pozzetto.
Applicare un nuovo coperchio sulla
piastra.
19. Utilizzando una pipetta multicanale,
aggiungere 100 ØI di SOLUZIONE DI
ARRESTO in ciascun pozzetto.
Mescolare delicatamente picchiettando
sulla piastra.
300 Øl per
pozzetto x 6
100 Øl
20. Determinare l’assorbanza per ciascun
pozzetto a 450 nm. Se si utilizza una
strumentazione a doppio filtro, la
lunghezza d’onda di riferimento sarà 620
nm.
A. Lavatore
automatico
o
semiautomaticoper micropiastre Lavare per sei (6) volte con almeno
300 Øl per pozzetto ad ogni lavaggio.
NOTA: La capacità di assorbimento dovrebbe essere letta
in 10 minuti sull’aggiunta della SOLUZIONE DI
ARRESTO.
5
CALCOLO DEI RISULTATI
CONTROLLO QUALITÀ
1.
Si raccomanda di effettuare l’analisi del BIANCO e del
CONTROLLO REATTIVO in duplicato e l’analisi del
CONTROLLO NON REATTIVO in triplicato, su ciascuna
piastra e per ogni ciclo di campioni.
2.
I valori del bianco devono avere un’assorbanza pari a
≤ 0,100.
3.
I valori del controllo non reattivo devono avere un’assorbanza
di ≤ 0,100 dopo la sottrazione del bianco.
4.
Ciascuno dei due valori di controllo reattivo deve avere
un’assorbanza pari a ≥ 0,500 dopo la sottrazione del
bianco.
5.
Perché l’analisi sia considerata valida, la differenza tra
l’assorbanza media del controllo reattivo e del controllo non
reattivo (RCx -NRC x ) deve essere almeno uguale a 0,400.
In caso contrario, la tecnica può essere considerata sospetta
e l’analisi dovrà essere ripetuta. Se il valore di RC x NRC x risulta sempre inferiore, è possibile che i reagenti
siano deteriorati.
1.
Calcolo dell’assorbanza media dei controlli non reattivi
(NRC x )
Esempio:
Pozzetto n.
C1
D1
E1
Assorbanza
0,010
0,012
0,008
Totale
0,030
Media
0,030 / 3 = 0,010 ( NRC x )
I singoli valori del controllo non reattivo devono essere minori
o uguali a 0,100. Se un valore di controllo non reattivo non
soddisfa uno dei criteri precedenti, deve essere escluso in
quanto aberrante. Sarà quindi necessario ripetere il calcolo
della media dei controlli non reattivi ( NRC x ) utilizzando i
singoli valori rimanenti di controllo non reattivo. Tali valori
devono soddisfare i criteri di cui sopra. Diversamente l’analisi
è considerata nulla e deve essere ripetuta.
2.
Calcolo dell’assorbanza media dei controlli reattivi
( RC x )
Esempio:
RISULTATI
Ai fini del calcolo e dell’interpretazione dei risultati, ciascuna
micropiastra dovrà essere considerata singolarmente, a
prescindere dal numero di piastre analizzate
contemporaneamente.
Pozzetto n.
F1
G1
Assorbanza
0,758
0,732
Totale
1,490
Media
1,490 / 2 = 0,745 ( RC x )
I singoli valori dei controlli reattivi devono essere superiori
o uguali a 0,500. Se un solo valore di controllo reattivo non
soddisfa entrambi i criteri sopra menzionati, l’analisi è
considerata nulla e deve essere ripetuta.
PRIMA DELL’INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI, DAI VALORI
D’ ASSORBANZA DEI CONTROLLI E DEI CAMPIONI
OCCORRE SOTTRARRE I VALORI DELL’ASSORBANZA
MEDIA DEL BIANCO.
3.
Calcolo della differenza fra RC x e NRC x
Esempio:
La presenza o l’assenza di anticorpi IgM specifici per l’HEV viene
stabilita mettendo a confronto l’assorbanza dei campioni con il
VALORE DI CUT-OFF della piastra.
NRCx
RC x
RC x -NRCx
=
=
=
=
0,010
0,745
0,745 - 0,010
0,735
Perché l’analisi sia considerata valida, il valore RCx
NRC x deve essere maggiore o uguale a 0,400. In caso
contrario, si può sospettare che sia stata utilizzata una
tecnica impropria o che i reagenti si siano deteriorati e
l’analisi dovrà essere ripetuta.
Il VALORE DI CUT-OFF per HEV IgM ELISA di MPD viene
calcolato come 0,400 + l’assorbanza media del controllo non
reattivo.
4.
Calcolo del valore di CUT - OFF
Valore di CUT- OFF
Esempio: NRCx
Valore di CUT-OFF
= 0,400 + NRC x
= 0,010
= 0,400 + 0,010
= 0,410
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
1.
2.
3.
4.
6
I campioni con valori di assorbanza inferiori a quello di
CUT - OFF vengono considerati Non-Reattivi da HEV IgM
ELISA di MPD.
I campioni con valori di assorbanza maggiori o uguali a
quello di CUT - OFF vengono considerati inizialmente
reattivi in base ai criteri di HEV IgM ELISA di MPD e devono
essere sottoposti a un nuovo test in duplicato prima
dell’interpretazione.
I campioni risultati reattivi con il nuovo test dovranno essere
interpretati come ripetutamente reattivi per gli anticorpi
IgM anti HEV in base ai criteri di HEV IgM ELISA di MPD.
I campioni inizialmente reattivi che invece risultino NonReattivi con il nuovo test vengono considerati negativi in
base ai criteri di HEV IgM ELISA di MPD.
PROBLEMI TECNICI/RECLAMI
CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE SPECIFICHE
Specificità e sensibilità
La determinazione della viremia in campioni di sangue o di feci
durante la fase iniziale dell’infezione è stata utilizzata per stabilire
la presenza di epatite E. Tuttavia tale determinazione può essere
effettuata soltanto se i campioni di sangue o feci vengono raccolti
in una fase sufficientemente precoce, durante i primi 14 giorni
dalla comparsa dei sintomi (12). Con riferimento alla
determinazione della viremia, la sensibilità di HEV IgM ELISA di
MPD viene determinata in base alla capacità di rilevare il numero
di positivi da tale pannello di sieri ben definito. Di 152 campioni
raccolti nel periodo finestra di 14 giorni, 141 sono risultati reattivi
all’analisi HEV IgM ELISA di MPD. Ciò corrisponde a una
sensibilità del 93%.
In caso di problemi tecnici o di reclami, attenersi alla seguente
procedura:
1. Prendere nota del numero di lotto e della data di scadenza
dei kit.
2. Conservare i kit e risultati ottenuti..
3. Contattare il più vicino centro MP Biomedicals o il proprio
distributore locale.
1.
Bradley, D.W. 1990. Enterically-transmitted non-A, non-B
hepatitis. pp 442-461, In A.J. Zuckerman (ed) British Medical
Bulletin 46(2). Churchill Livingstone, New York.
La siero-reattività fra individui sani in una popolazione a basso
rischio tende ad essere molto bassa, circa ≤ 1%, mentre nelle
aree endemiche tale valore risulta leggermente più elevato. La
siero-reattività indica un’esposizione recente al virus dell’epatite
E.
2.
Purcell, R.H. and J.R. Ticehurst. 1988. Enterically transmitted
non-A, non-B hepatitis: Epidemiology and clinical
characteristics. pp. 131-137, In A.J. Zuckerman (ed). Viral
Hepatitis and Liver Disease. Alan R. Liss Inc., New York.
3.
Moaven, L.D., A.J. Fuller, J.C. Doultree, J.A. Marshall,
D.S. Bowden, R.A. Moeckli and S.A. Locarnini. 1993. A
case of acute hepatitis E in Victoria. Medical Journal of
Australia 159; 124-125,
4.
Skidmore, S.J., P.O. Yarbough, K.A. Gabor, A.W. Tam,
G.R. Reyes, A.J.E. Flower. 1991 Imported hepatitis E in
UK. The Lancet 337;1541.
5.
Dawson, G.J., I.K. Mushahwar, K.H. Chau, G. L. Gittnick.
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in a US traveller to Pakistan. The Lancet 340;426,
6.
Reyes, G.R., M.A. Purdy, J.P. Kim, K.C. Luk, L.M. Young,
K.E. Fry, and D. Bradley. 1990. Isolation of a cDNA from the
virus responsible for enterically-transmitted non-A, non-B
hepatitis. Science 247: 1335.
7.
Yarbough, P.O., A.W. Tam, K.E. Fry, K. Krawczynski, K.A.
McCaustland, D.W. Bradley and G.R. Reyes. 1991. Hepatitis
E virus: Identification of type-common epitopes. Journal of
Virology 65: 5790.
8.
Goldsmith, R., P.O. Yarbough, K.E. Fry, K.A. Gabor, M.
Kamel, S. Zakaria, S. Amer, Y. Gaffar. 1992. Enzymelinked immunosorbent assay for diagnosis of acute sporadic
hepatitis E in Egyptian children. The Lancet 339;328-331,
9.
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Moeckli. 1993. Seroprevalence of Antibody to Hepatitis E
Virus among Chinese Subjects in Taiwan. Hepatology Vol
19, No. 4, 1994.
BIBLIOGRAFIA
LIMITI DELLA METODICA
I risultati ripetutamente reattivi ottenuti con il test HEV IgM ELISA
di MPD costituiscono la prova presuntiva della presenza di
anticorpi anti HEV nel campione. Un risultato NON-REATTIVO
del test HEV IgM ELISA di MPD indica la probabile assenza di
anticorpi IgM anti HEV rilevabili nel campione. Un risultato
NEGATIVO non esclude la possibilità di esposizione o infezione
da HEV.
Con un kit di analisi di questo genere è possibile sospettare
risultati falsamente reattivi. La proporzione di falsi reattivi dipende
dalla sensibilità e dalla specificità del kit. Nella maggior parte dei
test diagnostici, maggiore è la prevalenza di anticorpi in una
popolazione, minore è la proporzione di campioni falsamente
reattivi.
In base ai risultati di studi interni, la presenza di fattore reumatoide
(RF) o di elevato titolo di IgG non influenza le prestazioni di HEV
IgM ELISA di MPD. L’utilizzo di metodi per la rimozione delle IgG
(ad es. RFRR) che richiedono la diluizione del campione, può
influenzare la sensibilità di HEV IgM ELISA di MPD.
ESCLUSIONE DI GARANZIA E GARANZIA LIMITATA
ESPRESSA
Il produttore non fornisce altra garanzia per il kit, tranne l’uso
come dosaggio diagnostico in vitro nel quadro delle specifiche e
delle limitazioni indicate nel Manuale di istruzioni del prodotto,
sempre se viene usato seguendo le istruzioni ivi fornite. Il
produttore non fornisce alcuna garanzia, espressa o implicita,
compresa qualsiasi garanzia espressa o implicita di
commerciabilità, adeguatezza all’uso o utilità implicita ad altri
scopi. Il produttore riconosce solo la sostituzione del prodotto o il
rimborso del prezzo d’ acquisto del prodotto stesso. Il produttore
non potrà essere ritenuto responsabile nei confronti
dell’acquirente o di terzi per danni, lesioni o danni economici di
qualsiasi entità comunque causati dal prodotto nell’uso o
nell’applicazione sopra indicati. Il produttore non è in grado di
garantire, in forma implicita o esplicita, che questo prodotto non
viola i diritti di proprietà intellettuale di terzi.
10. Balayan, M.S. 1991. HEV Infection : Historical Perspectives,
Global Epidemiology, and Clinical Features. In F.B. Hollinger,
S.M. Lemon, and H. Margolis (editor), Viral Hepatitis and
Liver Disease. Williams & Wilkins, Baltimore.
11. Uchida, T., et al. 1991. Virulence of Hepatitis E virus with
Serial Passage to Cynomolgus Monkeys and Identification
of Viremia. In F.B. Hollinger, S.M. Lemon, and H. Margolis
(editor), Viral Hepatitis and Liver Disease. Williams & Wilkins,
Baltimore.
12. Edward T Clayson, Khin Saw Aye Myint, Rapin Snitban,
David W Vaughn, Bruce L Innis, Lily Chan, Peter Cheung,
Mrigendra P Shrestha. Viremia, Fecal Shedding, and IgM
and IgG Responses in Patients with Hepatitis E. Journal of
Infectious Diseases 1995 :172-927-33.
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5.741.490; 5.770.689;
5.885.768; 5.686.239
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644878
63167
178399, 180530
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in licenza da Genelabs Technologies, Inc.
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