Cromatografia ad esclusione dimensionale rapida e ad alta

Cromatografia ad esclusione
dimensionale rapida e ad alta
risoluzione di aggregati nei prodotti
bioterapeutici
Nota applicativa
Biologici e biosimilari
Autore
Introduzione
Andrew Coffey
L’aggregazione proteica è un parametro qualitativo fondamentale per le proteine ad
uso bioterapeutico in quanto gli aggregati possono avere un impatto significativo
sulla sicurezza e potrebbero determinare una risposta antigenica [1]. Gli aggregati
potrebbero anche ridurre l’efficacia dei prodotti biofarmaceutici e compromettere in
maniera significativa l’economia del processo. Spesso le proteine si aggregano se
esposte a condizioni di stress quali cambiamenti di pH, della temperatura o della
concentrazione; pertanto, l’aggregazione può verificarsi in numerose fasi diverse
della produzione. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è stata
individuata come il metodo migliore per la quantificazione degli aggregati.
Agilent Technologies, Inc.
Il monitoraggio della formazione degli aggregati durante lo sviluppo dei prodotti
bioterapeutici, per esempio durante la selezione dei cloni o l’ottimizzazione delle
condizioni di fermentazione attraverso un approccio rigoroso al “disegno
sperimentale” potrebbe rendere necessaria l’analisi ad esclusione dimensionale per
un gran numero di campioni.
Le condizioni generalmente utilizzate per l’esecuzione della SEC spesso richiedono
un tempo di analisi pari o superiore a 20 minuti, limitando enormemente la capacità
di analizzare grandi quantità di campioni. Le colonne Agilent AdvanceBio SEC sono
progettate con dimensioni delle particelle e dei pori altamente ottimizzate, che
consentono separazioni più rapide al fine di ridurre in maniera significativa questo
ostacolo relativo all’analisi. Questa nota applicativa descrive delle tecniche utili per
aumentare la produttività in termini di numero di campioni senza compromettere
l’accuratezza dell’analisi.
Materiali e metodi
Risultati e discussione
Reagenti, campioni e materiali
Le colonne AdvanceBio SEC presentano particelle di 2,7 µm
progettate per offrire la massima efficienza senza alcun
rischio di degradazione dei campioni o di collasso delle
particelle. Il metodo di produzione unico nel suo genere tiene
sotto controllo la dimensione e la struttura dei pori, nonché il
loro volume. L’applicazione di un rivestimento polimerico
idrofilo assicura che i picchi proteici siano puliti e con una
buona risoluzione. La Figura 1 mostra i cromatogrammi SEC
comparativi della separazione delle proteine standard
utilizzando la colonna AdvanceBio SEC e una colonna delle
stesse dimensioni, ma di un altro produttore (7,8 × 300 mm).
La colonna AdvanceBio SEC ha operato una separazione delle
proteine standard molto efficiente rispetto all’altra colonna.
La colonna AdvanceBio SEC ha prodotto un picco
cromatografico dalla forma ideale per il monomero IgG
(picco 4). Il dimero di ovalbumina (picco 5) è risultato avere
una migliore risoluzione rispetto a quella della colonna
dell’altro produttore. Questi risultati dimostrano la superiorità
delle prestazioni della colonna AdvanceBio SEC.
L’immunoglobulina G (IgG) è stata acquistata da SigmaAldrich, Corp. La miscela standard di proteine è stata ottenuta
da Bio-Rad Laboratories, Inc. I componenti della miscela
standard di proteine includevano tireoglobulina (670 kDa),
g-globulina (158 kDa), ovalbumina (44 kDa), mioglobina
(17 kDa) e vitamina B12 (1,35 kDa). Tutte le sostanze chimiche
e i solventi erano di grado HPLC; è stata usata acqua
altamente purificata ottenuta con il sistema di purificazione
dell’acqua Milli-Q.
Strumenti
È stato utilizzato un sistema LC quaternario Bio-Inert Agilent
serie 1260 Infinity completamente biocompatibile,
comprendente i seguenti moduli:
•
Pompa LC quaternaria Bio-inert Agilent 1260 Infinity
(G5611A)
•
Autocampionatore Bio-Inert ad alte prestazioni Agilent
1260 Infinity (G5667A)
•
Termostato Agilent serie 1200 Infinity (G1330B)
•
Comparto colonne termostatato Agilent 1260 Infinity
(G1316C)
•
Rivelatore a serie di diodi Agilent 1260 Infinity (G1315D)
con cella di flusso standard Bio-inert.
mAU
160
140
120
100
80
60
40
20
0
È stato utilizzato il software ChemStation Agilent B.04.03.
Condizioni
Colonne:
Fase mobile:
Temperatura
TCC:
Volume
di iniezione:
Flusso:
Rivelazione:
mAU
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å 7,8 × 150 mm, 2,7 µm
(codice PL1180-3301),
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 7,8 × 300 mm, 2,7 µm
(codice PL1180-5301),
colonna a fase diolica di un altro produttore, 7,8 × 300 mm,
5 µm
Fosfato di sodio 150 mM, pH 7,0
120
100
80
60
40
20
0
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å
7,8 × 300 mm, 2,7 µm 2
4
8
3
5
1
2
4
6
8
10
12
Colonna a fase diolica di un altro produttore
6
7,8 × 300 mm, 5 µm
2
4
4
6
14
16
18
min
16
18
min
7
8
3
1
2
30 °C
Identificazione del picco
1. Aggregati della tireoglobulina
2. Tireoglobulina
3. Dimero di IgG
4. Monomero di IgG
5. Dimero di ovalbumina
6. Monomero di ovalbumina
6
7. Mioglobina
7 8. Vitamina B12
8
10
12
14
Figura 1. Separazione ad esclusione dimensionale delle
proteine standard in condizioni di alta risoluzione a 0,8
mL/min con un tempo di analisi di 20 minuti, che evidenzia le
prestazioni superiori della colonna Agilent AdvanceBio SEC.
5 µL
0,5 – 1,4 mL/min (vedere le legende delle figure)
UV a 220 nm
2
In condizioni di alta risoluzione “standard” con colonne da
300 mm e flusso pari a 0,8 mL/min, il tempo di analisi è di
20 minuti. Ciò si traduce in una produttività massima di tre
campioni all’ora, che rende necessari oltre 1,3 giorni per
analizzare 96 campioni. Per aumentare la produttività, è
possibile ricorrere a colonne più piccole da 150 mm, che
offrono tempi di analisi più brevi. La Figura 2 mostra la
separazione nell’analisi dell’immunoglobulina G su colonne
AdvanceBio SEC da 300 mm e 150 mm utilizzate a
0,8 mL/min. Il tempo di ritenzione si dimezza con la colonna
da 150 mm e, con un fattore di risoluzione di 1,73 tra i picchi
di monomeri e dimeri, la quantificazione non risulterebbe
compromessa. Le colonne AdvanceBio SEC più corte offrono
tempi di analisi più brevi e consentono l’analisi ad alta
risoluzione degli anticorpi monoclonali.
Identificazione del picco
1. Aggregati di IgG
2. Dimero di IgG
3. Monomero di IgG
4. Frammento a basso PM
5. Conservante
mAU
A
120
100
80
60
40
20
0
3
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å
7,8 × 150 mm, 2,7 µm
Rs (monomero/dimero) 1,73
2
1
1
mAU
2
3
4
120 B
100
80
60
40
20
0
5
4
5
6
7
8
min
16
min
3
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å
7,8 × 300 mm, 2,7 µm
Rs (monomero/dimero) 2,02
2
1
4
2
6
5
4
8
10
12
14
Figura 2. Separazione ad esclusione dimensionale
dell’immunoglobulina G in condizioni di alta risoluzione a
0,8 mL/min. Una colonna di 150 mm con tempo di analisi di
nove minuti (A) a confronto con una colonna di 300 mm con
tempo di analisi di 18,5 minuti (B).
L’aggregazione delle proteine bioterapeutiche è coinvolta
nell’aumento dell’immunogenicità, in quanto influenza
l’efficacia e la tossicità. L’accurata quantificazione degli
aggregati tramite analisi SEC dipende principalmente dalla
risoluzione tra i picchi di monomeri e aggregati. Pertanto, la
risoluzione e la quantificazione sono due parametri
fondamentali nella SEC, nella quale la velocità lineare
influenza la risoluzione. Per valutare questi due parametri,
sono stati testati flussi diversi con una colonna da 150 mm.
L’ottima stabilità delle particelle delle colonne AdvanceBio
SEC consente di operare con flussi significativamente
maggiori senza un eccessivo calo delle prestazioni. Con flussi
maggiori, il fattore di risoluzione si riduce. Tuttavia, la
quantificazione dell’area del picco dei monomeri rimane in
gran parte invariata (Figura 3), il che consente di analizzare un
numero significativamente maggiore di campioni per
determinarne il contenuto di aggregati.
Rs (monomero/dimero)
% dell'area dei monomeri
Fattore di risoluzione (Rs)
75
2,0
70
1,5
65
1,0
60
0,5
0,0
0,4
55
0,6
0,8
1,0
1,2
Velocità di flusso (mL/min)
1,4
50
1,6
Figura 3. Effetto del flusso sul fattore di risoluzione e sulla
determinazione della percentuale dell’area dei monomeri.
Massimizzare la produttività in termini di campioni offre
vantaggi competitivi e risultati più affidabili, che si traducono
in vantaggi economici. La riduzione della lunghezza della
colonna con aumento del flusso è una strategia semplice per
ottenere analisi SEC più rapide. La Tabella 1 mostra il calcolo
teorico del flusso a confronto con il numero di analisi dei
campioni eseguite al giorno. A un flusso di 1,5 mL/min con un
tempo di analisi pari a 4,8 minuti, è possibile analizzare
300 campioni al giorno, il che equivale a una produttività fino
a 4,2 volte maggiore.
Tabella 1. Guadagni in termini di produttività tramite
l’aumento del flusso al fine di consentire l’analisi di
un volume maggiore di campioni.
3
Lunghezza
della colonna Flusso
(mm)
(mL/min)
Tempo di
analisi
(min)
Campioni Campioni
all’ora
al giorno
300
0,8
20
3
72
150
0,5
15
4
96
150
0,6
12
4–5
120
150
0,7
10
5–6
144
150
0,8
9
6–7
160
150
0,9
8
6–7
180
150
1,0
7
7–8
205
150
1,1
6,5
8–9
220
150
1,2
6
8–9
240
150
1,3
5,5
11
260
150
1,4
5
12
288
150
1,5
4,8
12–13
300
% dell'area dei monomeri
80
2,5
La Figura 4 mostra la sovrapposizione dei cromatogrammi
SEC con colonne da 300 mm e 150 mm a flussi diversi.
È chiaro dunque che è possibile eseguire SEC rapide in un
quarto del tempo, mantenendo invariata l’accuratezza della
quantificazione del contenuto di monomeri.
Elevata produttività
Agilent AdvanceBio SEC 300 Å
7,8 × 150 mm, 2,7 µm
1,5 mL/min
mAU
% dell'area dei monomeri = 76,3%
3
3
3
3
100
Conclusioni
80
Il presente studio dimostra i vantaggi dell’impiego di colonne
Agilent AdvanceBio SEC e flussi maggiori al fine di aumentare
in maniera significativa la produttività per l’analisi degli
aggregati nelle proteine bioterapeutiche. Riducendo la
lunghezza della colonna da 300 mm a 150 mm e aumentando il
flusso da 0,8 mL/min a 1,5 mL/min, è possibile raggiungere un
aumento del volume di campioni e della produttività del 400%, in
modo tale che il tempo necessario per analizzare 96 campioni
possa essere ridotto da 1,3 giorni a meno di otto ore.
40
60
Bibliografia
1.
K. D. Ratanji, J. P. Derrick, R. J. Dearman, I. Kimber.
Immunogenicity of therapeutic proteins: Influence of
aggregation. J. Immunotoxicol. 2014, 11(2), 99–109.
20
2
1
2
5
2
5
1
4
1
4
2
5
1
4
5
4
0
2
mAU
70
60
50
40
30
20
10
0
4
2
4
Alta risoluzione
Agilent AdvanceBio
SEC 300 Å
7,8 × 300 mm, 2,7 µm
0,8 mL/min
% dell'area dei
monomeri = 76,2%
4
2
6
4
2
4
Identificazione del picco
1. Aggregati di IgG
2. Dimero di IgG
3. Monomero di IgG
4. Frammento a basso PM
5. Conservante
3
5
1
2
2
4
8
10
12
14
16
18
min
Figura 4. Cromatogrammi comparativi dell’immunoglobulina G
in condizioni di elevata produttività e alta risoluzione.
Ulteriori informazioni
Questi dati rappresentano i risultati tipici. Per ulteriori
informazioni sui nostri prodotti e servizi, visitare il nostro sito
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www.agilent.com/chem
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© Agilent Technologies, Inc. 2015
Stampato negli Stati Uniti
24 novembre 2015
5991-6458ITE