Esemplare certificato conforme Tbilisi, il 25 giugno 2010 Il

RISOLUZIONE OIV/ENO 382D/2010
AGGIORNAMENTO DELLA RACCOLTA DEI METODI INTERNAZIONALI DI ANALISI DELLE
BEVANDE SPIRITOSE DI ORIGINE VITIVINICOLA - determinazione dei composti αdicarbonilici delle bevande spiritose di origine vitivinicola mediante cromatografia in fase
gassosa dopo derivazione con l’1,2-diaminobenzene
L'ASSEMBLEA GENERALE
VISTO l’articolo 2 paragrafo 2b iv dell’Accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla
creazione dell’Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino,
VISTE le azioni del Piano Strategico dell’OIV 2009-2012, in particolare quella volta alla
riorganizzazione delle pubblicazioni relative ai metodi di analisi vitivinicola,
CONSIDERANDO i lavori della Sotto-Commissione dei Metodi di Analisi
VISTA la Raccolta dei metodi internazionali di analisi delle bevande spiritose di origine
vitivinicola adottata nel 2009
DECIDE di introdurre questo metodo nella «Raccolta dei metodi internazionali di analisi
delle bevande spiritose d’origine vitivinicola»
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DETERMINAZIONE DEI COMPOSTI α-DICARBONILICI DELLE BEVANDE
SPIRITOSE DI ORIGINE VITIVINICOLA MEDIANTE CROMATOGRAFIA IN
FASE GASSOSA DOPO DERIVAZIONE CON L’1,2-DIAMINOBENZENE
Metodo di tipo IV
1. Introduzione
I principali composti α-dicarbonilici delle acqueviti di vino (Figura 1) sono: gliossale,
metilgliossale, diacetile e pentano-2,3-dione.
Gliossale: OCH−CHO (etandiale)
Metilgliossale: CH3−CO−CHO (2-ossopropanale)
Diacetile: CH3−CO−CO−CH3 (butano-2,3-dione)
Pentano-2,3-dione: CH3−CH2−CO−CO−CH3
Esano-2,3-dione: CH3−CH2−CH2−CO−CO−CH3
Figura 1. I principali composti α-dicarbonilici del vino, (l’esano-2,3-dione non è presente
naturalmente nel vino ma è utilizzato come standard interno).
I composti dicarbonilici sono importanti per via del loro impatto sensoriale.
2. Campo d’applicazione
Questo metodo si applica alle bevande alcoliche di origine vitivincola per tenori in composti
carbonilici compresi tra 0,05 mg/l e 20 mg/l..
3. Principio
Il metodo è basato sulla formazione di derivati di tipo chinossalina a partire dai composti αdicarbonilici con il 1,2-Diaminobenzene (figura 2).
R
NH2
O C
N
R
N
R
+
NH2
O C
R
1,2-Diaminobenzene Dicarbonile Chinossalina
Figura 2. Formazione dei derivati.
La reazione avviene nella bevanda spiritosa diluita di un quarto, portata a pH 8 e dopo una
reazione di 3h a 60° C. L’analisi dei derivati è poi eseguita dopo l’estrazione di derivati con il
diclorometano e analisi con cromatografia in fase gassosa con una rilevazione mediante
spettrometria di massa (GC-MS) o con l’aiuto di un rilevatore specifico dei componenti
azotati.
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4. Reagenti e prodotti
4.1 Composti dicarbonilici
4.1.1 Gliossale (n. CAS 107-22-3) in soluzione al 40 %
4.1.2 Metilgliossale (n. CAS78-98-8) in soluzione al 40 %
4.1.3 Diacetile (n. CAS 431-03-8) di purezza > 99 %
4.1.4 Pentano-2,3-dione (n. CAS 600-14-6) di purezza > 97 %
4.1.5 Esano-2,3-dione (n. CAS 3848-24-6) di purezza > 90 %
4.2 1,2-Diaminobenzene (n. CAS 95-54-5) in polvere, di purezza > 97 %
4.3 Acqua per HPLC (secondo la norma EN ISO 3696)
4.4 Etanolo (n. CAS 64-17-5) puro per HPLC
4.5 Idrossido di sodio (n. CAS 1310-73-2) 0,1 M.
4.6 Acido solforico (n. CAS 7664-93-9) 0,2 M
4.7 Diclorometano (n. CAS 75-09-2)
4. 8 Solfato di sodio anidro (n. CAS 7757-82-6)
4.9 Soluzione idroalcolica al 50% vol.
Mescolare 50 ml di etanolo puro per HPLC (4.4) con 50 ml d’acqua (4.3)
4.10 Soluzione di standard interno esano-2,3-dione 2,0 g/1
Mettere 40 mg di esano-2,3-dione (4.2) in un flacone di 30 ml, diluire in 20 ml di
soluzione idroalcolica al 50% vol (4.8) e agitare fino a completo scioglimento.
5. Apparecchiatura
5.1 Cromatografo in fase gassosa con rilevazione tramite spettrometria di massa (GC-MS)
con l’aiuto di un rilevatore specifico dei componenti azotati.
5.1.1 Colonna analitica capillare polietilene glicole mediamente polare (C 20M, BP21… ) con
le seguenti caratteristiche (a titolo di esempio) 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm
5.1.2 Sistema di acquisizione dati
5.2 Apparecchio per la misurazione del pH
5.3 Agitatore magnetico
5.4 Bilancia di precisione da 0,1 mg.
5.5 Forno regolabile a 60° C
5.6 Usuale vetreria di laboratorio, come pipette, flaconi a vite da 30 ml e microsiringhe
6. Preparazione del campione
Diluire la bevanda spiritosa a un quarto in acqua (4.3)
7. Modo operativo
Mettere 10 ml di bevanda spiritosa diluita a un quarto (6) in un flacone da 30 ml (5.6)
Portare a pH 8 agitando, con idrossido di sodio 0,1 M (4.5)
Aggiungere 5 mg di 1,2-diaminobenzene (4.2)
Aggiungere 10 µl di esano-2,3-dione (campione interno) 2,0 g/1 (4.10).
Chiudere il flacone con un tappo a vite munito di setto con superficie teflonata
Agitare fino alla scomparsa completa del reagente (5.3)
Mettere in stufa a 60° C per 3 h (5.5)
Raffreddare.
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7.1 Analisi
7.1.1 Estrazione delle chinossaline
- Il mezzo di reazione preparato (7) è portato a pH 2 con l’aiuto di H2SO4 2M (4.6) ;
- Estrarre a 2 riprese con 5 ml di diclorometano (4.7) e agitazione magnetica per 5 minuti;
- Decantare la fase inferiore a ogni ripresa;
- Miscelare le due fasi di solvente;
- Fare sciugare su 1 g circa di solfato di sodio anidro (4.8) ;
- Decantare.
7.1.2 Analisi cromatografica (fornita a titolo di esempio)
- Rilevazione. Per l’analisi tramite GC-MS, un cromatografo in fase gassosa Hewlett Packard
HP 5890 è stato accoppiato ad una chemstation e ad uno spettrometro di massa HP 5970
(impatto elettronico 70eV, 2,7 kV),
Nota: Si può utilizzare un rilevatore specifico dei composti azotati - Colonna. La colonna è
una BP21 (SGE, 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm).
- Temperature. Le temperature dell’iniettore e del rilevatore sono rispettivamente di 250° C e
280C; quella del forno è mantenuta a 60° C per 1 min, poi programmata con incremento di
2C/min fino a 220 C e l’isoterma finale dura 20 min.
- Iniezione. Il volume iniettato è di 2 µl e il tempo di chiusura delle valvole dell’iniettore
(splitless) è di 30 s.
7.1.3 Analisi delle chinossaline formate
- Separazione. Nella figura 3 è raffigurato il cromatogramma dei derivati tramite 1,2diaminobenzene di una bevanda spiritosa secondo il metodo di selezione degli ioni (SIM).
- Identificazione dei picchi. L’utilizzo della GC-MS ha permesso di identificare i composti
dicarbonilici derivati da un’acquavite di vino utilizzando il metodo della corrente ionica totale
(scan) che permette di ottenere gli spettri di massa dei derivati chinossalinici e di confrontarli
con quelli in memoria nella biblioteca degli spettri; d’altra parte i tempi di ritenzione sono
stati confrontati con quelli dei composti puri trattati allo stesso modo. La tabella 1 mostra gli
ioni principali degli spettri di massa dei composti dicarbonilici derivati ottenuti.
- Dosaggio. La determinazione quantitativa dei composti dicarbonilici si esegue con il metodo
SIM, selezionando ioni M / Z = 76, 77, 103, 117, 130, 144, 158 e 171. Gli ioni M/Z = 76 e 77
sono utilizzati per la quantificazione e gli altri come qualificatori, vale a dire gliossale: ioni
M/Z =103 e 130, metilgliossale: ioni M/Z =117 e 144, diacetile: ioni M/Z = 117 e 158,
pentano-2,3-dione: ioni M/Z = 171 e esano-2,3-dione: ioni M/Z = 158 e 171.
7.1.4 Caratteristiche del metodo
Alcuni elementi di validazione interna sono stati determinati, ma non si tratta di una
validazioneformale secondo il protocollo per la pianificazione, lo svolgimento e
l’interpretazione degli studi relativi alle prestazioni dei metodi di analisi (OIV 6/2000)
- Ripetibilità. La ripetibilità del metodo tramite GC-MS-SIM. mostra coefficienti di
variazione compresi tra 2 e 5% per i quattro composti dicarbonilici;
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- Tasso di ricupero. Le quantità aggiunte a un vino sono state recuperate con uno scarto
inferiore al 6% rispetto al valore atteso;
- Linearità. Sono state ottenute correlazioni lineari in intervalli di concentrazione compresi tra
0,05 e 20 mg/l.
- Limite di rilevazione. Il limite di rilevazione della maggior parte dei prodotti dicarbonilici
derivati è di 0,05 mg/l.
Tabella 1. Spettri di massa (ione m/z (intensità dello ione molecolare relativa a quella del
picco di base) dei derivati tramite l’1,2-diaminobenzene dei composti dicarbonilici.
Composti dicarbonilici
Derivato
Gliossale
Chinossalina
Metilgliossale
2-Metilchinossalina
Diacetile
2,3-Dimetilchinossalina
Pentano-2,3-dione
2-Etil-3-metilchinossalina
Esano-2,3-dione
2,3-Dietilchinossalina
Spettro di massa (principali ioni e
abbondanza)
130 (100), 103 (56.2), 76 (46.8), 50
(20.2), 75 (10.4), 131 (9.4)
144 (100), 117 (77.8), 76 (40.5), 77
(23.3),50 (21.9), 75 (11.3), 145
(10.3)
117 (100), 158 (75.6), 76 (32.3), 77
(23.1), 50 (18.3), 75 (10.4)
171 (100), 172 (98), 130 (34.1), 75
(33.3), 77 (21), 50 (19.4), 144 (19),
143 (14.1), 103 (14)
158 (100), 171 (20.1), 76 (13.7), 77
(12.8), 159 (11.4), 157 (10.8), 50
(8.1) 106
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Abundance
5
Colonne polaire
3200
3000
1
2800
2600
2400
2200
2
2000
1800
1600
3
1400
1200
1000
800
600
4
400
52.00
54.00
56.00
58.00
60.00
62.00
64.00
66.00
68.00
Time-->
Figura 3. Cromatogramma in fase gassosa dell’estratto dei composti dicarbonilici derivati tramite il 1,2diaminobenzene di un’acquavite di vino, rilevati in spettrometria di massa scegliendo gli ioni m/z =76, 77, 103,
117, 130, 131, 144, 158, 160 e 171. Colonna BP21, 50m X 0,32mm 0,25 µm. Temperatura del forno 60 °C per 1
min, poi programma con incremento di 2°C/min fino a 220°C. Temperatura dell’iniettore: 250 °C.
1. Gliossale ; 2. metilgliossale ; 3. diacetile ; 4. pentano-2,3-dione ; 5. esano-2,3-dione (standard interno) ; 6.
fenilgliossale (non dosato mediante tale metodo).
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8. Bibliografia
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Martineau B, Acree TE and Henick-Kling T, Effect of wine type on the detection threshold
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