Dynabeads™ HLA CLASS I Dynabeads™ HLA CLASS II

Tabella 1: tamponi e soluzioni raccomandate
Tris – soluzione salina
bilanciata (TBSS), pH 7,4*
Aggiungere il 2% di siero fetale di vitello (FCS), o il
2% di siero umano inattivato al calore (HS) prima
dell’uso.
Catalog nos. 21001D, 21002D
Soluzione quenching
Dynabeads™ HLA CLASS II
Inchiostro India diluito al 2,5% v/v in PBS, o
emoglobina bovina diluita adeguatamente al 15%.
Soluzione bloccante
Aggiungere 8 g di Na2EDTA a 90 ml di PBS, miscelare
bene, regolare il pH a 7,4 con il NaOH e regolare il
volume a 100 ml. Regolare il pH a 7,4 con il NaOH.
È possibile miscelare e aggiungere
contemporaneamente le soluzioni quenching e
bloccanti al pozzetto.
Dynabeads HLA CLASS I
™
Catalog nos. 21003, 21004D
Conservare a una temperatura compresa tra 2 ˚C e 8 ˚C
Rev. Date: 15 October 2015 (Rev. B.0)
Contenuto del prodotto
Contenuto del
prodotto
N. di cat.
Volume
Dynabeads™
HLA CLASS I
21001D
2 ml
21002D
5 ml
Dynabeads™
HLA CLASS II
21003
2 ml
21004D
5 ml
Capacità del prodotto
21001D e 21003: 20 isolamenti
21002D e 21004D: 50 isolamenti
Dynabeads™ HLA Class I e Dynabeads™
HLA Class II contengono entrambi
1,4 × 108 microgranuli/ml in soluzione
salina tamponata con fosfato (PBS)
contenente lo 0,1% di albumina di siero
bovino (BSA) e lo 0,02% di sodio azide.
Attenzione: la sodio azide può reagire
con il piombo e il rame delle tubature,
formando azidi metalliche altamente
esplosive.
Descrizione del prodotto
Dynabeads™ HLA Class I è concepito
per l’isolamento rapido dei linfociti
CD8+T direttamente dal sangue
periferico. Le cellule isolate possono
essere utilizzate direttamente nei test
HLA Class I (A, B, C) microcitotossici.
Dynabeads™ HLA Class II è concepito
per l’isolamento rapido delle cellule
HLA Class II+ (principalmente linfociti
B) direttamente dal sangue periferico. Le
cellule isolate possono essere utilizzate
direttamente nei test HLA Class II
(DR, DQ) microcitotossici.
La tecnica di isolamento
immunomagnetico delle cellule che utilizza
il prodotto Dynabeads™ HLA Class I o il
Dynabeads™ HLA Class II consente un
isolamento rapido e specifico delle cellule
target direttamente dal sangue intero in soli
15 minuti. Le cellule target sono legate ai
microgranuli dopo una breve incubazione
e le cellule legate ai microgranuli sono
isolate e lavate con un magnete.
Per uso diagnostico in vitro.
Generalmente, Dynabeads™ HLA Class I
e Dynabeads™ HLA Class II producono
una purezza (>99%) e una vitalità molto
elevate (>95%) delle cellule isolate.
Il metodo è semplice, rapido e specifico.
In caso di legame alla superficie cellulare,
il Dynabeads™ non interferisce con il
legame degli anticorpi per tipizzazione
HLA ed è complementare alle cellule.
Nota: generalmente, la vitalità delle
cellule isolate con Dynabeads™
HLA Class II, dopo l’incubazione
microcitotossica, è inferiore alla
controparte Dynabeads™ HLA Class I.
Materiali necessari
• Magnete (portafoglio DynaMag™).
Vedere thermofisher.com/magnets
per raccomandazioni.
• Agitatore che consente l’inclinazione
e la rotazione delle provette.
• Provette di raccolta di sangue
contenenti anticoagulante (ad es. acido
citrato-destrosio (ACD), eparina).
• Pipette Pasteur da 5 ml in vetro.
• Contenitore per prodotti ematici e per
lo smaltimento.
• Dispositivo di raffreddamento.
• Vedere la Tabella 1 per tamponi e
soluzioni raccomandati.
Linee guida generali
• Questi prodotti sono destinati all’uso
diagnostico in vitro.
• Poiché in questa procedura sono
utilizzate cellule di mammiferi, seguire
le tecniche di laboratorio appropriate.
• Manipolare tutti i campioni come
se fossero in grado di trasmettere
patologie.
• Effettuare tutte le operazioni
indossando guanti e dispositivi di
protezione appropriati.
• Utilizzare un agitatore che consenta
l’inclinazione e la rotazione delle
provette per assicurare che il
Dynabeads™ non si stabilisca nella
provetta.
Soluzioni coloranti
• AO/EB – soluzione in brodo 15 mg di arancio di acridina.
50 mg di bromuro di etidio.
Sciogliere in 1 ml di etanolo al 95%. Aggiungere
49 ml di PBS. Miscelare bene. Dividere in aliquote
da 1 ml e congelare.
• AO/EB – soluzione di lavoro Scongelare 1 ml di soluzione in brodo e diluire con
un rapporto di 1:10 in PBS, pH 7,4. Miscelare bene
la AO/EB. Conservare in un flacone giallo a una
temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C per un mese.
*Nota: è possibile utilizzare altri tamponi per la risospensione delle cellule, tuttavia queste vanno integrate con
Ca2+, Mg2+ e 2% FCS, o 2% HS. Reagenti di grado analitico utilizzati.
• Evitare la formazione di bolle d’aria (formazione di schiuma) durante il pipettaggio.
• Seguire con attenzione i volumi di pipettaggio e i tempi di incubazione raccomandati.
• Mantenere freddi tutti i tamponi.
Protocolli
Preparare il campione
In alcuni pazienti, il numero di cellule HLA Class I e II+ è basso (ad es. disturbi
ematologici, leucemia, uremia), o il siero può contenere quantità elevate di molecole
HLA Class I e II solubili, interferendo con la capacità di isolamento delle cellule
dei microgranuli. Per fornire un risultato soddisfacente per le cellule HLA Class I e
HLA Class II per la tipizzazione, utilizzare la seguente procedura prima di “isolare
le cellule” per campioni che forniscono linfociti bassi in procedure di isolamento
cellulare convenzionali.
1. Centrifugare 10 ml di sangue a 800-1000 × g per 5 minuti senza interruzioni.
2. Smaltire il plasma e trasferire il buffy coat e il primo strato superiore di eritrociti in
una provetta da 10 ml.
3. Aggiungere 5 ml di PBS freddo con 0,6% di citrato di sodio, pH 7,4 al buffy coat e
miscelare delicatamente.
4. Proseguire con il passaggio 3 in “Isolare le cellule”.
Isolare le cellule
I campioni ematici devono essere più freschi possibile, preferibilmente non anteriori
a 4 giorni. I campioni ematici di pazienti leucemici e uremici non devono essere
elaborati entro 24 ore dalla raccolta.
1. Raccogliere 5 ml di sangue (ACD) in una provetta di raccolta di sangue standard e
far raffreddare a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C per impedire l’adesione
di cellule fagocitiche ai microgranuli.
2. Aggiungere 5 ml di PBS freddo con 0,6% di citrato di sodio a ogni campione.
3. Risospendere le Dynabeads™ (ad es. agitare su vortex per >30 secondi, o inclinare
e ruotare per 5 minuti) e aggiungere 100 μl di Dynabeads™ al campione ematico.
4. Miscelare per 5 minuti ad una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C inclinando e
ruotando delicatamente.
Nota: non utilizzare la rotazione a ribaltamento, in quanto potrebbe danneggiare le
cellule target e aumentare il background nel test microcitotossico.
5. Isolare le cellule posizionando la provetta del test in un magnete per 2 minuti.
6. Smaltire il sovranatante senza toccare il pellet contenente le cellule legate ai
microgranuli.
7. Rimuovere la provetta dal magnete e risospendere le cellule legate ai microgranuli
in 5 ml di PBS freddo, pH 7,4, con 0,6% di citrato di sodio.
8. Applicare al magnete per 2 minuti per raccogliere le cellule legate ai microgranuli
e smaltire il sovranatante mentre la provetta si trova ancora nel magnete.
9. Ripetere quattro volte i passaggi 7-8; utilizzando 5 ml di PBS freddo, pH 7,4, senza
citrato di sodio per ogni lavaggio.
10.Risospendere le cellule legate ai microgranuli in 0,4 ml di TBSS, pH 7,4, contenente
Ca2+, Mg2+ e 2% di FCS o 2% di HS inattivato al calore, o equivalente.
3. Leggere il vassoio entro un’ora, se l’EDTA non viene utilizzata per bloccare la
reazione di colorazione.
Nota: quando si utilizzano vassoi Terasaki, può essere difficile distinguere le cellule
negative (verdi) dal background. È possibile attenuare la colorazione di background
aggiungendo 5 μl di inchiostro India adeguatamente diluiti o di emoglobina a ogni
pozzetto.
Test HLA microcitotossico
Dynabeads™ HLA Class I e Dynabeads™ HLA Class II sono microgranuli di
polistirene uniformi, superparamagnetici (diametro di 4,5 μm). Il Dynabeads™
HLA Class I è rivestito con un anticorpo di topo monoclonale primario anti-umano
specifico dell’antigene di membrana CD8 nelle cellule umane. Il Dynabeads™ HLA
Class II è rivestito con un anticorpo di topo monoclonale primario anti-umano
specifico dell’antigene di membrana HLA Class II nelle cellule umane.
• I tempi di incubazione con siero e complementi sono solo indicativi, ottimizzare in
base alla serie di siero utilizzata nel vassoio.
• La tipizzazione HLA con cellule isolate con Dynabeads™ HLA Class I o
Dynabeads™ HLA Class II è più sensibile rispetto alle tecniche di tipizzazione
HLA convenzionali, pertanto si consiglia di ridurre il tempo di incubazione con il
siero (30+ minuti) e il complemento (30+ minuti) di tipizzazione HLA.
• Prima dell’uso, potrebbe essere necessaria la titolazione dell’antisiero di
tipizzazione.
• È importante non utilizzare diluenti contenenti sostanze citotossiche, a causa della
sensibilità più elevata del test.
Descrizione dei materiali
Prodotti relativi
Prodotto
N. di cat.
DynaMag -5
12303D
Procedura di tipizzazione tissutale
DynaMag™-15
12301D
1. Immediatamente prima dell’uso, scongelare i vassoi Terasaki con 1 μl di antisieri
HLA diluiti in modo ottimale per pozzetto.
MPC™-1
12001D
2. Miscelare bene la sospensione cellulare isolata. Riempire la siringa di
dispensazione e aggiungere 1 μl di sospensione cellulare a ogni pozzetto.
Nota: non irrigare le cellule isolate su e giù nella siringa, né agitare vigorosamente.
3. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (in luogo buio).
4. Aggiungere 5 μl di complemento a ogni pozzetto (o il volume indicato dal
produttore dei vassoio commerciali).
Nota: potrebbe essere necessario titolare il complemento per evitare reazioni extra
con le cellule isolate Dynabeads™.
5. Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente (in luogo buio).
6. Aggiungere 1 μl di soluzione colorante AO/EB.
7. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (in luogo buio).
8. Leggere un microscopio invertito entro 1 ora.
Nota: se necessario, è possibile aggiungere 5 μl di soluzione quenching/bloccante EDTA.
Colorazione di cellule isolate nel test di microcitotossicità HLA
Per la colorazione di cellule isolate con Dynabeads™ HLA Class I o Dynabeads™ HLA
Class II utilizzate in test microcitotossici, raccomandiamo la colorazione con coloranti
fluorescenti (ad es. arancio di acridina (AO) e bromuro di etidio (EB)). È possibile
effettuare la valutazione di cellule vitali (verdi) e morte (rosse) con un microscopio a
fluorescenza (filtro di eccitazione di 450/490 nm). Le reazioni citotossiche avvengono
dopo l’aggiunta di soluzione colorante. È possibile interrompere tali reazioni se si
aggiunge l’8% di EDTA sciolto in PBS al pozzetto. L’EDTA mantiene la leggibilità del
vassoio durante la notte.
Nota: i coloranti fluorescenti richiedono l’incubazione del vassoio al buio a
temperatura ambiente (da 20 °C a 22 °C). Tenere il colorante a riparo dalla luce diretta
e conservarlo al buio.
™
REF sulle etichette è il simbolo del numero di catalogo.
Edizione valida delle istruzioni per l’uso: vedere la revisione delle istruzioni per l’uso
fornite all’interno del kit. Se si necessita la revisione delle istruzioni per l’uso nella
lingua specifica del paese, è possibile ottenerla gratuitamente:
1. Chiamando il 888-821-4443, int. 2.
Gli utenti europei possono chiamare il +44 192-528-2700 per assistenza.
2. Scrivendo una mail a [email protected].
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and ISO 13485.
Procedura di colorazione A:
1. dopo l’incubazione con i sieri e il complemento, aggiungere 1 μl di soluzione di
lavoro AO/EB a ogni pozzetto e incubare per 15 minuti.
2. Leggere il vassoio entro un’ora dopo aver aggiunto la soluzione colorante, se
l’EDTA non viene utilizzata per bloccare la reazione di colorazione.
Procedura di colorazione B:
1. le cellule isolate Dynabeads™ sono disperse nei pozzetti del vassoio.
2. Dispensare la soluzione colorante nei pozzetti insieme al complemento:
aggiungere 2 ml di complemento di coniglio e 50 μl di soluzione in brodo AO/EB
e incubare il vassoio per 30 minuti.
Nota: aggiungere la quantità di complemento indicata dal produttore del vassoio.
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