Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte
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Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte
Università degli studi di Catania Dipartimento di Scienze del Farmaco Corso di laurea in TOSSICOLOGIA DELL’AMBIENTE E DEGLI ALIMENTI Loria Tino Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte Tesi di Laurea Relatrice: Chiar.ma Prof.ssa A. Panico Correlatore: Dott. D. Pulvirenti Anno Accademico 2014-2015 Tesi di Laurea Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte Loria Tino pagina 2 Tesi di Laurea Loria Tino INDICE 1 PREMESSA ............................................................................................................................................ 5 2 IL PISTACCHIO ....................................................................................................................................... 8 3 IL PISTACCHIO VERDE DI BRONTE - DOP ............................................................................................ 11 3.1 Disposizioni del Regolamento ........................................................................................................ 12 3.2 Prodotti al Pistacchio ...................................................................................................................... 14 3.3 Il commercio del Pistacchio a Bronte ............................................................................................. 16 4 LE MICOTOSSINE ................................................................................................................................ 20 4.1 5 Diffusione e Tossicità...................................................................................................................... 21 LE AFLATOSSINE ................................................................................................................................. 25 5.1 Cenni storici .................................................................................................................................... 25 5.2 Struttura Chimica e proprietà chimico-fisiche ............................................................................... 26 5.3 Produzione da Aspergillus .............................................................................................................. 28 5.4 Fattori che ne influenzano la produzione ...................................................................................... 31 5.5 Contaminazione dei pistacchi......................................................................................................... 32 5.6 Le importazioni in Europa ed il sistema RASFF............................................................................... 37 5.7 Normativa ....................................................................................................................................... 44 6 TOSSICITA’ DELLE AFLATOSSINE ......................................................................................................... 49 6.1 Tossicocinetica ............................................................................................................................... 51 6.1.1 Assorbimento ............................................................................................................................. 51 6.1.2 Distribuzione .............................................................................................................................. 51 6.1.3 Metabolismo .............................................................................................................................. 52 6.1.4 Escrezione................................................................................................................................... 54 6.2 Tossicodinamica ............................................................................................................................. 55 6.3 Tossicità Acuta ................................................................................................................................ 56 6.4 Tossicità Cronica ............................................................................................................................. 58 7 DETERMINAZIONE ANALITICA DELLE AFLATOSSINE........................................................................... 60 7.1 Campionamento ............................................................................................................................. 60 7.2 Scelta del metodo di analisi............................................................................................................ 60 7.3 Confronto delle tecniche analitiche applicabili .............................................................................. 62 7.4 Metodo analitico Applicato ............................................................................................................ 64 7.4.1 Principio del metodo .................................................................................................................. 64 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 3 Tesi di Laurea Loria Tino 7.4.2 Fasi operative ............................................................................................................................. 64 7.4.3 Reagenti e Soluzioni ................................................................................................................... 65 7.4.4 Strumentazione .......................................................................................................................... 66 7.4.5 Condizioni operative................................................................................................................... 68 7.4.6 Procedura di calibrazione ........................................................................................................... 68 7.4.7 Preparazione del campione ........................................................................................................ 72 7.4.8 Estrazione ................................................................................................................................... 72 7.4.9 Clean-up ..................................................................................................................................... 73 7.4.10 Analisi del campione .................................................................................................................. 75 7.4.11 Calcolo ed espressione del risultato ........................................................................................... 77 7.4.12 Validazione e Prestazioni del metodo ........................................................................................ 78 8 SCOPO DELLA TESI .............................................................................................................................. 81 8.1 Scelta dei campioni......................................................................................................................... 81 8.2 Dati sperimentali ottenuti .............................................................................................................. 83 8.3 Analisi dei Risultati ......................................................................................................................... 85 9 CONCLUSIONI ..................................................................................................................................... 87 10 ALLEGATI ........................................................................................................................................ 89 11 RINGRAZIAMENTI ...................................................................... Errore. Il segnalibro non è definito. 12 RIFERIMENTI ................................................................................................................................... 94 12.1 Sitografia ........................................................................................................................................ 94 12.2 Bibliografia...................................................................................................................................... 94 12.3 Normative ....................................................................................................................................... 95 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 4 Tesi di Laurea Loria Tino 1 PREMESSA Il pistacchio di Bronte rappresenta per me un prodotto al quale sono particolarmente legato per le mie origini. Fin da piccolo ho partecipato alla raccolta e su questa ho dei bellissimi ricordi legati a mio nonno, a tal proposito riporto un racconto che scrissi nel settembre 2013: Stasera la statale mi ha fatto sognare “Percorrendo quei quindici chilometri in direzione di Catania, ti rendi conto di quanto le campagne brontesi siano particolarmente vive in questo periodo dell’anno. E ti stupisci pensando a come le nostre famiglie da secoli ripetano la medesima cosa. Tante piccole luci segnano il territorio circostante e dalla strada le vedi brillare come stelle, e proprio come le stelle, mentre viaggiavo, mi hanno fatto sognare ad occhi aperti. Mi sono affiorati alla mente ricordi che quasi credevo di aver cancellato, ricordi della mia infanzia. Ricordi di quando, le ultime settimane d’estate, mi trasferivo in campagna dai miei nonni in compagnia dei miei cugini, ma senza i miei genitori. Sono passati quasi 20 anni da allora e mi piace pensare che le stesse cose le stiano facendo i bambini di adesso, anche se è difficile che si stacchino dall’invadente tecnologia che ci circonda. Il ricordo più bello era di stare coi miei cugini a scherzare, lavorare, giocare e dormire tutti insieme. La raccolta per noi era una cosa bella: Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 5 Tesi di Laurea Loria Tino Ricordo che mio nonno ci pagava per ogni secchio di pistacchio, e visto che in un giorno non riuscivamo a riempirlo, ricordo che custodivamo il nostro raccolto come oro negli armadi del garage, al riparo da furti e sabotaggi che noi stessi mettevamo in atto. Ricordo l’odore del mattino, ci alzavamo presto ed amavo lavarmi all’aperto con l’acqua fredda. Ricordo la colazione fatta di latte e brioches, a scelta potevamo anche metterci del caffè. Ricordo il sapore dell’acqua del pozzo che usavamo per dissetarci, aveva un sapore metallico, forse perche la tiravamo su con una vecchia pentola di alluminio e la bevevamo direttamente da li. Ricordo l’odore sgradevole di quell’insetto verde soprannominato da noi “a fitusa” e ricordo che ci macchiava le mani. Ricordo il pranzo, spesso fatto di pasta al pomodoro, molto semplice ma eravamo tutti li attorno alla tavola ad aspettarlo. Ricordo i pomeriggi passati a stendere i pistacchi al sole sul tetto e quelli passati a mangiarli col rischio che ci venisse la febbre. Ricordo i giochi che facevamo: scavare buche nel terreno creando sottopassaggi e sperando che non crollassero, scendere da quella strada in cemento con la “cariola” fatta di tavole di legno e cuscinetti come ruote, andare su quella bici rosa senza freni di mio cugino, e poi non mancava in nascondino della sera o il gioco della settimana coi numeri impressi sul cemento. Ricordo la sera quando ci pulivamo con l’olio rancido le braccia fatte di colla e ricordo le ciocche di capelli tagliate per via della troppa colla. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 6 Tesi di Laurea Loria Tino Ricordo la cena, fatta di cotoletta ed insalata, e quella tv in bianco e nero sul camino che raramente prendeva qualche canale. Ricordo il dopocena, dopo la doccia uscivamo nel cortile in pigiama a goderci quell’aria fresca, e ricordo l’odore dei millepiedi che risalivano le mura della casa. Ricordo la notte, dormivamo tutti insieme in dei letti sistemati giornalmente nella cucina per noi bambini. Non dormivamo mai prima dell’una e davamo la caccia alle zanzare. Ogni tanto qualche topolino di campagna ci faceva visita, ed al mattino lo trovavamo nelle trappole di colla. E ricordo che al mattino eravamo nuovamente tutti li, felici di cominciare la nostra nuova giornata lavorativa.“ Tino Loria L’elaborato si articola in una prima parte volta a dare nozioni sulla produzione e la lavorazione che il Pistacchio subisce a Bronte, correlata da alcuni dati sulle importazioni. Una seconda parte interessa la contaminazione da aflatossine: come avviene, quali sono le condizioni favorevoli, quali le fasi critiche per lo sviluppo; seguita da informazioni sulla loro tossicità ed il loro effetto sulla salute umana. Nella terza parte verrà descritto il metodo analitico per la determinazione delle aflatossine ed i risultati delle prove eseguite su campioni di prodotto al Pistacchio commercializzati a Bronte. Buona Lettura. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 7 Tesi di Laurea Loria Tino 2 IL PISTACCHIO Il pistacchio (Pistacia vera - L.) è un albero della famiglia delle Anacardiaceae. Può raggiungere un'altezza di circa 12 metri e un'età di 300 anni. È originario del Medio Oriente, dove veniva coltivato già in età preistorica, particolarmente in Persia. La coltura del pistacchio, dalla Siria sarebbe passata in Grecia a seguito delle conquiste di Alessandro Magno (III secolo a.C.). In Italia la pianta fu introdotta dai Romani; mentre in Sicilia, la coltivazione in forma diffusa, si fa risalire al Periodo della dominazione araba (VIII e IX secolo d.C.). Sono di origine araba, infatti, i termini “frastuca” e “frastucara” usati in Sicilia per indicare il frutto e la pianta (termine arabo “fustuq”). Il frutto è una drupa con un endocarpo ovale a guscio sottile e duro, contenente il seme, chiamato comunemente "pistacchio" che ha colore verde vivo sotto una buccia viola. L'alimento è formato per l'83% da lipidi, per il 12% da proteine e per il 5% da carboidrati. Zone di coltivazione a rilevanza internazionale si trovano in Medio Oriente (Iran, Turchia e Siria), negli Stati Uniti (California) e, negli ultimi anni, anche in Cina. (S2) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 8 Tesi di Laurea Loria Tino Iran tonnellate prodotte (2012) 472 097 Rendimento (tonnellate/ettaro) 1,78 Stati Uniti 231 000 Turchia 150 000 4,27 3,03 Cina 74 000 1,53 Siria 57 195 2,48 Grecia 10 000 2,6 Italia (Sicilia) 3 100 1,76 Afghanistan 2 000 1,43 Australia 1 792 0,06 Tunisia 1 400 1,33 Mondo 1 005 610 2,03 Paese Tabella 1 - Produzione di pistacchio nel mondo anno 2012 (S3) Nel territorio di Bronte (Catania), in oltre 2600 Ettari di terreno, c’è l’80 % della produzione Siciliana (2500 tonnellate prodotte nel 2012) e rappresenta lo 0,25 % della quantità prodotta nel mondo. (B1) (S5) . Riguardo la quantità di prodotto importato in Italia, si veda invece il paragrafo 5.6 (Le importazioni in Europa ed il sistema RASFF) A differenza del resto del mondo, a Bronte le piante di pistacchio crescono prevalentemente in terreni sconnessi di origine vulcanica che rendono complicata l’automazione della racconta, che avviene dunque manualmente, ma conferiscono al prodotto particolari qualità organolettiche. Si presenta, ad esempio, di colore verde intenso rispetto ai prodotti esteri, questo dovuto alla maggiore quantità di MgO nei terreni di produzione vulcanica. Il Mg++, come noto, costituisce la molecola centrale della clorofilla conferendogli il colore verde-giallastro. (B13) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 9 Tesi di Laurea Loria Tino TIPOLOGIE DI PIANTAGIONI E METODO DI RACCOLTA GENERALI: TIPOLOGIE DI PIANTAGIONI E METODO DI RACCOLTA A BRONTE: Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 10 Tesi di Laurea Loria Tino 3 IL PISTACCHIO VERDE DI BRONTE - DOP Il pistacchio di Bronte è una varietà di pistacchio a Denominazione di origine protetta DOP, il riconoscimento è stato pubblicato nel Reg. UE n. 21 del 12 gennaio 2010. (N1) La denominazione di origine protetta “Pistacchio Verde di Bronte” è riservata al prodotto, in guscio, sgusciato o pelato, delle piante della specie botanica “Pistacia vera”, cultivar “Napoletana”, chiamata anche “Bianca” o “Nostrale”, innestata su “Pistacia terebinthus” (S4). La coltivazione e la produzione di pistacchio rappresenta per Bronte, un importante fonte di reddito, tanto da essere soprannominato l' Oro Verde, per il suo alto valore commerciale. La città di Bronte ha saputo sfruttare questo vantaggio, infatti nel suo territorio si contano oltre 1000 produttori, la maggior parte con appezzamenti di circa 1 ettaro cadauno, nonché qualche grosso produttore con un multiplo di ettari. Tradizionalmente la raccolta è biennale, l’ultima è stato proprio a settembre 2015. Questo antico sistema è volto a garantire un prodotto di maggiore qualità. Evitando il sovraccarico annuale si ottiene anche una quantità maggiore di frutto nell’anno di carica. Recentemente qualche produttore ha iniziato ad applicare il sistema di raccolta annuale con dei risultati soddisfacenti nel breve termine, ma si sconoscono ancora le ricadute a lungo termine sulla vita delle piante. Il frutto raccolto viene in genere smallato ed asciugato al sole ad opera del produttore stesso, che poi vende il suo pistacchio in guscio alle aziende di trasformazione locali. (S2) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 11 Tesi di Laurea Figura 1 - Pistacchio di Bronte in fase di Maturazione Loria Tino Figura 2 - Metodo di essiccazione del pistacchio a Bronte 3.1 Disposizioni del Regolamento Il “Pistacchio Verde di Bronte” DOP all’atto dell’immissione al consumo deve rispondere, oltre alle comuni norme di qualità, alle seguenti caratteristiche fisiche ed organolettiche: colore cotiledoni: verde intenso, rapporto di clorofilla a/b compreso tra 1,3 e 1,5; sapore: aromatico forte, senza inflessione di muffa o sapori estranei; contenuto di umidità compreso tra 4% e 6%; rapporto lunghezza/larghezza del gheriglio compreso tra 1,5 e 1,9; alto contenuto di grassi monoinsaturi nei frutti (presenza predominante dell’acido oleico con il 72%, seguito dal 15% del linoleico e dal 10% del palmitico). (N1) La zona di produzione del “Pistacchio Verde di Bronte”, ricade nel territorio dei comuni di Bronte, Adrano, Biancavilla (Provincia di Catania). In particolare i confini sono cosi individuati: BRONTE - ad Ovest lungo il fiume Simeto, ad Est fino a quota 900 m s.l.m., a Sud con il Comune di Adrano ed a Nord lungo la strada Bronte - Cesarò; Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 12 Tesi di Laurea Loria Tino ADRANO - a Nord con il confine del Comune di Bronte, a Sud con il centro abitato e la S.S. 121 ed a Est con la lava “Grande” del 1595 e con il Comune di Biancavilla, ad Ovest lungo il fiume Simeto fino alla summensionata S.S. 121; BIANCAVILLA - a Nord con il territorio di Adrano, a Sud con il centro abitato e la S.S. 121, a Est con il confine comunale di S. M. Licodia, ad Ovest con il confine del Comune di Adrano. La zona di produzione deve essere compresa tra i 400 e i 900 m s.l.m. La zona delimitata è caratterizzata da suoli che evolvono su substrati di origine vulcanica. Le peculiarità pedoclimatiche e la tecnica della degemmazione, praticata nella zona di produzione del “Pistacchio Verde di Bronte” consentono di accentuare la naturale alternanza della specie e di trarre vantaggi nella difesa fitosanitaria. (N1) Le operazioni di raccolta del prodotto al corretto grado di maturazione, in relazione alle zone di produzione e all’andamento climatico, si svolgono dalla seconda decade di agosto alla prima decade di ottobre. La raccolta avviene manualmente mediante bacchiatura sulle reti o per brucatura, utilizzando panieri avendo cura di impedire che i frutti cadano per terra. I frutti devono essere smallati meccanicamente, per ottenere il prodotto in guscio, entro le 24 ore successive alla raccolta, onde evitarne l’imbrunimento e l’eventuale contaminazione. Successivamente alla fase di smallatura, il prodotto in guscio deve essere immediatamente essiccato alla luce diretta o con altri sistemi d’essiccamento, mantenendo la temperatura del prodotto compresa tra i 40 ei 50°C, fino ad un’umidità residua del seme di pistacchio compresa tra il 4 ed il 6%, In questa fase, soprattutto nel sistema tradizionale alla luce diretta, è alto il rischio di contaminazione del prodotto. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 13 Tesi di Laurea Loria Tino Il prodotto essiccato deve essere messo in contenitori nuovi di juta, carta o polietilene ed evitare il contatto con pavimenti o muri, in idonei locali ventilati ed asciutti. Lo stoccaggio può durare fino a 24 mesi dopo la raccolta. E’ possibile sgusciare e/o pelare meccanicamente il pistacchio. E’ assolutamente vietato utilizzare prodotti chimici per la conservazione del “Pistacchio Verde di Bronte” DOP. Nel periodo marzo-ottobre, in funzione dell’andamento climatico, il prodotto nelle diverse tipologie, in guscio, sgusciato o pelato, deve essere conservato a temperatura compresa tra 13 e 17°C, oppure in confezioni sigillate sottovuoto o in atmosfera modificata. (N1) 3.2 Prodotti al Pistacchio A Bronte si producono un'infinita varietà di prodotti derivati dalla lavorazione del pistacchio, come il famoso pesto di pistacchio per il condimento della pasta, il gelato al pistacchio, gli arancini al pistacchio, le paste di pistacchio, le torte al pistacchio, la crema di pistacchio, la crema dolce spalmabile di pistacchio, il cioccolato al pistacchio, il liquore al pistacchio, il panettone natalizio al pistacchio, le “fillette” al pistacchio (dolce tipico brontese presente anche al gusto di vaniglia) e molto altro. Il pistacchio al naturale ed il pistacchio semilavorato per pasticcerie, viene commercializzato prevalentemente in cinque diverse forme che poi serviranno alla produzione dei vari prodotti finiti. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 14 Tesi di Laurea Loria Tino Nome Trattamento Uso Pistacchio in guscio trattamento di smallatura meccanica ed essiccazione a 50 °C circa in forni ventilati o luce solare Produzione delle altre forme di vendita. Pistacchio sgusciato sgusciatura meccanica, non subisce trattamenti termici. Per lo più a scopo decorativo e produzione di pistacchio tritato Pistacchio pelato pelatura del pistacchio sgusciato sottoposto a trattamento con vapore d’acqua a 100 °C per pochi minuti. Per lo più a scopo decorativo e produzione di pistacchio tritato Pistacchio tritato prodotto da pistacchio sgusciato sottoposto a tostatura a 120 °C per 60 minuti e triturazione. Dimensione: - farina < 1 mm - granella: 2-4 mm Usato per la preparazione di paste, torte, pesto, liquore ed uso decorativo Pasta pura di pistacchio al 100%, prodotto da pistacchio sgusciato sottoposto a tostatura a 120 °C per 60 minuti e lavorazione con macchine raffinatrici in modo da ottenere un prodotto cremoso. Usato per la preparazione del gelato, crema spalmabile, cioccolato Foto Tabella 2 - Diverse forme di vendita del pistacchio al naturale (foto S1) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 15 Tesi di Laurea Loria Tino E facile notare come nelle ultime forme di vendita, pistacchio tritato e pasta pura di pistacchio al 100%, il pistacchio perda la sua originale dimensione e forma utile per l’individuazione della varietà e dunque presunta provenienza del prodotto. Sono queste due forme infatti quelle maggiormente a rischio di contraffazione per miscelazione con pistacchio di importazione o addirittura con olio di semi vari per la pasta di pistacchio dichiarata pura al 100%. 3.3 Il commercio del Pistacchio a Bronte Alcune imprese dichiarano di acquistare solo prodotto locale mentre altre (70% del totale) anche prodotto d’importazione. (B1) L’approvvigionamento del prodotto locale avviene solitamente durante l’annata di carica e si concentra nel periodo che va dal mese di agosto al mese di ottobre. L’approvvigionamento del prodotto d’importazione avviene durante tutto il corso dell’anno. (B1) Il prodotto che riscontra il maggior gradimento dagli importatori brontesi (miglior rapporto qualità/prezzo) è il pistacchio turco. Infatti il 100% di coloro che importano, acquistano quasi esclusivamente dalla Turchia; solo due imprese associano una buon quantitativo di prodotto siriano (50% e 10% del totale di prodotto importato) ed una acquista dall’Iran il 10% dei propri fabbisogni. (B1) Dai dati del commercio di pistacchio in UE riportati in Tabella 6, risulta invece che i principali fornitori sono Stati Uniti ed Iran, dal quale la Sicilia importa il 75% del totale. Tale dato risulta essere in contrasto con quanto dichiarato dagli operatori brontesi. (B1) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 16 Tesi di Laurea Loria Tino Quattro sono gli importatori brontesi, questi acquistano sia prodotti locali ed eseguono la sgusciatura e/o pelatura meccanica, sia prodotti di importazione che arriva già sgusciato. Eseguono quindi lo stoccaggio e rivendono il prodotto al naturale o la pasta pura al 100% alle aziende di lavorazione locali, nazionali ed estere. Sul territorio sono inoltre presenti circa 20 esercizi pubblici (bar), che tramandano l’antica maestria dei pasticceri Brontesi nella lavorazione del pistacchio per ottenere prodotti di alta qualità che vengono venduti prevalentemente sul luogo di produzione. A questi si aggiungono circa 20 aziende di lavorazione del pistacchio che commercializzano prodotti semilavorati e lavorati all’ingrosso e dettaglio. Per pubblicizzare i propri prodotti molte imprese ricorrono a diverse iniziative pubblicitarie, l’80% delle imprese possiede un proprio marchio d’origine e la stessa percentuale ha effettuato azioni di pubblicità; diversi sono i mezzi utilizzati: il 70% ricorre ai quotidiani e/o settimanali e partecipa a fiere o mostre mercato. Il 60% delle imprese, è organizzata nell’effettuare pubblicità direttamente sul punto vendita mediante una rete commerciale, ed il 40% delle imprese viene pubblicizzata su riviste specializzate. In ogni caso, il mezzo pubblicitario più importante è internet, utilizzato a tal fine dal 90% delle imprese, e la stessa percentuale, è dotata di un sito proprio; inoltre il 70% di esse utilizza il sito per l’E-commerce. Io personalmente, che possiedo delle discrete capacità informatiche, ho realizzato nel 2015 un sito e-commerce per un mio caro amico brontese che ha deciso di avviare un’attività commerciale su internet di prodotti al pistacchio, creando un proprio marchio ma delegando la produzione ad aziende già presenti sul mercato (S8). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 17 Tesi di Laurea Loria Tino Diagramma 1 – Flusso delle vendite di pistacchio a Bronte Complessivamente l' Oro Verde produce annualmente una ricchezza di circa 20 milioni di euro. I mercati di destinazione dei prodotti realizzati sono per l’80% nazionale ed il 20% estero. (B1) Riguardo la ripartizione percentuale dei mercati di destinazione nazionali, il mercato siciliano assorbe il 35% del prodotto ed il nord Italia assorbe quasi il 40% dell’intera produzione; tra le regioni settentrionali un ruolo primario è rivestito dalla Lombardia. Per quanto riguarda il mercato estero, essi vengono raggiunti prevalentemente (60% delle imprese) tramite gli importatori grossisti; per il 30% delle imprese esistono canali diretti con negozi esteri specializzati. (B1) La Germania rappresenta un interessante mercato per l’80% delle imprese e, per alcune di esse, rappresenta l’unico interlocutore estero. Seguono la Francia, dove esporta il 60% Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 18 Tesi di Laurea Loria Tino delle imprese, la Svizzera e gli Stati Uniti con il 40%, il Giappone con il 20%, la Svezia, l’Olanda e l’Australia con il 10%. (B1) Allo scopo di tutelare i produttori locali, ottenere una maggiore equità nella distribuzione dei redditi tra gli operatori “a monte” e quelli “a valle” e valorizzare un prodotto che possiede delle caratteristiche peculiari fortemente legate all’area geografica di provenienza e che appare minacciato da importazioni di pistacchio di qualità inferiore, il 3 novembre 2004 è stato costituito da 30 produttori ed imprenditori agricoli il "Consorzio di tutela". È stato rilevato, infatti, che i visti i quantitativi di prodotto lavorato annualmente nelle imprese rilevate e, considerata la produzione media annua ottenuta dagli impianti autoctoni, inevitabilmente le aziende di trasformazione ricorrono all’acquisto di prodotto estero (anche solo per la mescita). E come già descritto, nel 2010 il pistacchio di Bronte ha ottenuto il riconoscimento di prodotto a Denominazione di origine protetta DOP. (N1) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 19 Tesi di Laurea Loria Tino 4 LE MICOTOSSINE Il problema dei residui tossici nei prodotti alimentari ha assunto notevole rilievo in tema di sicurezza alimentare. In particolare, il monitoraggio di contaminanti di derivazione “naturale”, quali le micotossine (B2) è diventato un controllo di routine per l’industria agro-alimentare. Le micotossine sono metaboliti secondari di funghi che infestano le derrate alimentari o il foraggio destinato all’alimentazione degli animali da allevamento. (B3). Generalmente hanno basso peso molecolare e natura lipofilica, ma non costituiscono una classe chimica in quanto le loro strutture sono molto differenti essendo prodotte da specie o da ceppi diversi della stessa specie fungina. Questo spiega anche i diversi effetti indotti. Le micotossine sono infatti responsabili di danni a livello epatico, renale, del sistema nervoso e gastrointestinale; alcune sono state classificate come cancerogene (B3) (Vedi Tabella 3) Attualmente sono note più di 300 micotossine, ma solo di un numero limitato si conoscono gli effetti tossici. I generi fungini maggiormente interessati alla produzione di tali tossine sono l’Aspergillus, il Fusarium e il Penicillium. Tali funghi hanno un aspetto pulverulento di colore bianco, verdastro o nero dovuto ad una fitta rete di filamenti e di sporangi, i contenitori delle spore, che invade l’ospite infiltrandosi in modo capillare (vedi Figura 3) Lo sviluppo di funghi e la formazione di micotossine sono possibili già quando una pianta coltivata si trova ancora in campo, e poi in tutte le successive fasi di conservazione e trasformazione. Le micotossine tuttavia non sono correlate direttamente alla crescita del fungo, ma risultano essere piuttosto una sua risposta a determinati stimoli ambientali. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 20 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 3 - Mais contaminato da Aspergillus (S1) Le micotossine preoccupano per diversi motivi: possono essere presenti anche in alimenti non visibilmente ammuffiti; hanno effetti tossici particolarmente gravi (vedi Tabella 3). sono attive anche a basse concentrazione; sono particolarmente stabili ai trattamenti fisici e chimico-fisici: molte risultano termostabili fino a 150°C ed all’essiccazione; trattamenti come molitura, radiazione, estrazione, raffinazione e fermentazione ne diminuiscono il contenuto ma non sono in grado di distruggerle completamente (B4) . Un trattamento chimico in grado di eliminarle è invece il trattamento con Ammoniaca e sali alcalini. 4.1 Diffusione e Tossicità Secondo stime effettuate dalla FAO nel 1985, un quarto della produzione mondiale di derrate destinate al consumo alimentare ed umano, sarebbe contaminato da micotossine. Questo è spiegato dal fatto che le spore dei funghi tossigeni sopra descritti sono prodotte in grandi quantità e sono ubiquitarie: dunque possono vivere in molti tipi di ambienti e vengono facilmente disseminate dalle correnti d’aria. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 21 Tesi di Laurea Loria Tino Tra i fattori che influiscono sulla crescita fungina e dunque sulla probabile produzione di micotossine, ci sono: elevata temperatura ambientale (30-40 °C) attività dell’acqua aw (acqua libera nell’alimento) pH (6-8 unità) ossigeno (> 2%) quantità di amido e lipidi E’ facile dedurre che i cibi a rischio sono quelli provenienti da regioni con clima tropicale e sub-tropicale (Figura 4) e composti da grandi quantità di amido e lipidi (B2). Si tratta di tutti i cereali (mais, frumento, orzo, avena,segale, ecc.) salvo il riso, i semi oleaginosi (arachidi, girasole, semi di cotone, ecc.), la frutta secca ed essiccata (mandorle, noci, nocciole, fichi secchi, ecc.), i semi di cacao e caffè, le spezie come il peperoncino, il pepe, lo zenzero, la frutta e verdura (uva, mele, pere,carote, pomodori, ecc). Sono di conseguenza suscettibili di contaminazione alcuni prodotti derivati da queste materie prime: per esempio farine ad uso umano e animale, derivati dei semi oleaginosi, esclusi gli oli raffinati (perché le tracce di micotossine che possono passare nell'olio greggio vengono rimosse dal trattamento con alcali usato nel processo di raffinazione), prodotti contenenti cacao, caffè, vino, birra, succhi di frutta e ortaggi, latte, prodotti contenenti spezie. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 22 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 4 - Aree del pianeta maggiormente interessate dalla presenza di micotossine L’esposizione dell’uomo e dell’animale può avvenire tramite ingestione di alimenti contaminati oppure tramite via aerea, in ambienti di lavoro dove siano presenti polveri di granaglie contaminate aero-disperse, o in ambienti domestici in cattive condizioni igieniche. Inoltre gli animali esposti a loro volta diventano fonte di esposizione se destinati a diventare alimenti o produttori di alimenti destinati all’uomo. Il rapporto tra la quantità di micotossina escreta e quella ingerita dall’animale è definito “carry over”, il trasferimento nelle carni è generalmente nullo ad accezione dei tessuti di fegato e rene (deputati alla detossificazione) e del latte che può contenere dei metaboliti tossici. (es. Aflatossina M1). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 23 Tesi di Laurea Loria Tino Micotossina Principali funghi produttori Aflatossine B1, B2, G1, G2 Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticum Aflatossina M1 Metabolita di B1 Fumonisine Fusarium moniliforme Ocratossina A Aspergillus Ochraceus, Penicillium viridicatum Patulina Aspergillus clavatus, Penicillium patulum Tricoteceni Fusarium, Myrothecium Zearalenone Fusarium Effetto tossico Alimenti più coinvolti Immunotossiche, epatotossiche, mutagene, cancerogene epatotossica epatotossiche, neurotossiche, cancerogene, Cereali (Mais), semi oleaginosi (arachidi) ed altra frutta secca, spezie Immunotossica, nefrotossica, cancerogena, teratogena Genotossica e cancerogena in misura minore. Neurotossiche, Emorragia meningea e cutanea, necrosi cutanea Effetti estrogenici Cereali, arachidi, caffè verde, cacao, spezie, liquirizia, carni suine e avicole, vino, birra. Mele, pere, carote e derivati (succhi di frutta) Latte e derivati Mais Cereali, specialmente mais Mais, granaglie Tabella 3- Principali micotossine, funghi produttori ed effetti tossici (B3) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 24 Tesi di Laurea Loria Tino 5 LE AFLATOSSINE Le aflatossine, ritenute a ragione le micotossine per eccellenza, sono state oggetto delle ricerche più approfondite e ancora oggi destano le maggiori preoccupazioni in quanto contaminanti dell’alimentazione di larga parte della popolazione mondiale che vive nelle fasce tropicali dove le caratteristiche del clima e la pressochè totale assenza di refrigerazione, facilitano la crescita delle muffe produttrici. 5.1 Cenni storici L’inizio della moderna tossicologia è databile al 1960, anno in cui venne dato grosso impulso alla ricerca delle micotossine, in seguito ad una grave intossicazione che colpì il settore avicolo in Inghilterra, divenuta successivamente nota con il nome di “malattia X del tacchino”. Più di 100.000 tacchini morirono dopo aver consumato farina di noci brasiliane ed arachidi contaminate. Il principale contaminante fungino isolato da quelle arachidi era Aspergillus flavus. Le indagini effettuate consentirono l’isolamento dell’agente eziologico ovvero una miscela di composti tossici fluorescenti, denominati aflatossine (B5) . Nel 1963, successivi studi (B6) , hanno portato all’identificazione, all’isolamento e alla caratterizzazione chimica delle aflatossine, si scoprì inoltre che tali sostanze potevano essere separate cromatograficamente in quattro diverse componenti, che furono distinte in B1, B2, G1 e G2, a seconda del colore della fluorescenza emessa (blue o green) in relazione all’irradiazione con luce ultravioletta a 360 nm ed alla loro mobilità cromatografia (B7). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 25 Tesi di Laurea Loria Tino Successivamente alla scoperta delle aflatossine Allcroft e Carnaghan (1963), ipotizzarono che alcuni residui di aflatossina ingeriti dagli animali con la razione, potessero ritrovarsi nel latte o in altri derivati. In vacche da latte alimentate con prodotti contaminati da aflatossina B1, venne ritrovata una sostanza tossica, che in esperimenti condotti sulle anatre risultò nociva quanto l’aflatossina B1, e che risultò legata anche alle frazioni caseiniche della cagliata. Tale sostanza rivelò una fluorescenza blu-viola simile a quella precedentemente osservata per l’aflatossina B1, ma in questo caso, dato il primitivo isolamento dal latte, gli venne attribuito il nome di aflatossina M o “milk toxin”. L'aflatossina M1 è stata quindi il primo metabolita idrossilato della B1 ad essere isolato e identificato (B9). Campbell ed altri (1970) nel cercare di chiarire l’eziologia del cancro al fegato nell’uomo prodotto dall’aflatossina B1, scoprirono per la prima volta, la presenza dell’aflatossina M1 nelle urine. Successivamente furono isolate a partire dalle urine e dal latte le aflatossine M1 e M2, identificandole come metaboliti della B1 e B2 dei mammiferi. 5.2 Struttura Chimica e proprietà chimico-fisiche Chimicamente sono composti eterociclici altamente ossigenati (B3) derivati dalla cumarina, a basso peso molecolare ( < 500 u.m.a.), alto punto di fusione (269 °C per Aflatossina B1) ed elevata Figura 5 - Cumarina termostabilità (fino a 250°C). Le Aflatossine del gruppo B sono bifuranocumarine fuse con un anello ciclopentenoico (di colore verde nella Figura 6). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 26 Tesi di Laurea Loria Tino Le Aflatossine del gruppo G sono bifuranocumarine fuse con un anello lattonico (di colore verde nella Figura 6). Le M1, M2 sono il prodotto di idrossilazione rispettivamente di B1 e B2 (gruppo –OH sull’anello bifurano) che si riscontrano nelle secrezioni degli organismo che li hanno metabolizzati (urine, latte, bile). Tra le molecole della serie 1 e le molecole della serie 2, la differenza risiede in un doppio legame sull’anello bifurano (di colore blu nella Figura 6). Figura 6 - Formule di struttura Aflatossine Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 27 Tesi di Laurea Loria Tino Afla Numero CAS Formula Massa mol. (uma) B1 1162-65-8 C17H12O6 312.28 B2 7220-81-7 C17H14O6 314.29 G1 1165-39-5 C17H12O7 328.28 G2 7241-98-7 C17H14O7 330.29 M1 6795-23-9 C17H12O7 328.28 M2 6885-57-0 C17H14O7 330.29 Nome IUPAC 2,3,6a,9a-tetrahydro-4methoxycyclopenta(c)furo(3',2':4,5)furo(2,3h)(1)benzo-pyran-1,11-dione 2,3,6aa,8,9,9aa-Hexahydro-4methoxycyclopenta(c)furo(2',3':4,5)furo(2,3h)chromene-1,11-dione 7AR,cis)3,4,7a,10a-tetrahydro-5-methoxy-1H,12Hfuro(3',2':4,5)furo(2,3-h)pyrano(3,4-c)chromene1,12-dione 1H,12H-furo(3',2':4,5)furo(2,3-h)pyrano(3,4c)(1)benzopyran-1,12-dione (6AR-cis)-2,3,6a,9a-tetrahydro-9a-hydroxy-4methoxycyclopenta(c)furo(3',2':4,5)furo(2,3h)(1)benzopyran-1,11-dione 2,3,6a,8,9,9a-Hexahydro-9a-hydroxy-4methoxycyclopenta(c)furo(3',2':4,5)furo(2,3-h)(1) benzopyran-1,11-dione Tabella 4- Tabella riepilogativa Aflatossine (S2) Solubilità: Le aflatossine risultano assai poco solubili in acqua (10-30 µg/mL), ma molto solubili nei solventi organici mediamente polari (es. metanolo, cloroformio, toluene). Stabilità: hanno alto punto di fusione (269 °C per AFB1), ma sono instabili sotto luce UV in presenza di O2 ed a pH estremi (pH<3 e pH>10) in presenza di ossidanti. Reattività: l’anello del lattone è sensibile a idrolisi alcalina, le aflatossine sono sensibili ad ammoniaca e ipoclorito di sodio. 5.3 Produzione da Aspergillus Le Aflatossine sono prodotte principalmente da alcuni ceppi di Aspergillus flavus e da quasi tutti i ceppi di Aspergillus parasiticus. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 28 Tesi di Laurea Loria Tino L’Aspergillus flavus, rappresenta la forma conidiofora (imperfetta) di un ascomicete la cui forma perfetta è caratterizzata dalla produzione di un asco, mentre nella forma imperfetta produce spore agame dette conidi. Figura 7 - Foto di Aspergillus flavus in SEM (microscopio elettronico a scansione) Le muffe appartenenti all’Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus sono estremamente diffuse nell’ambiente ed hanno la capacità di insediarsi, grazie alle micro-fessure operate da insetti e parassiti nei tessuti vegetali, e nel proseguo del loro accrescimento, di produrre micotossine e numerose spore fungine che per diffusione anemofila raggiungono altre piante. Come già detto nel capitolo delle micotossine, l’aspetto pulverulento delle muffe è dovuto ad una fitta rete di ife (filamenti) e di sporangi (contenitori di spore), che invadono l’ospite infiltrandosi in modo capillare (vedi Figura 3). Alcune specie di Aspergilli sono dannose per uomo ed animali, mentre altre possono essere impiegate per fini utilitaristici, come: l’Aspergillus orizae, capace di fermentare lo Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 29 Tesi di Laurea Loria Tino zucchero nel processo di produzione del sakè ed utilizzabile anche per la produzione di salsa di soia; l’Aspergillus wenti, anch’esso utilizzato per la preparazione della salsa di soia; dalle colture di Aspergillus flavus e A. fumigatus (uno dei principali costituenti del compost, identificato per la prima volta nel 1848) si possono ricavare antibiotici come: la flavicidina, la flavicina e la fumagatina. Recentemente anche la specie Aspergillus Ochraceoroseus è stata inserita tra quelle produttrici di aflatossine. In Giappone, poi, sono stati isolati l’Aspergillus tamarii e l’Aspergillus pseudo tamarii (B11) , mentre in Australia sono presenti due distinti sottogruppi di Aspergillus flavus, uno definito Aspergillus Australis. Su 3460 ceppi di A. flavus isolati da alimenti contaminati, solo il 74% è in grado di produrre aflatossine (B9) : Aspergillus flavus (maggiormente ubiquitario), produce le aflatossine B1 e B2 e talvolta la micotossina (acido ciclopiazonico) Aspergillus parasiticus (più frequente nei climi subtropicali e tropicali ha elevata affinità di crescita in frutta e semi oleosi), produce le aflatossine B1, B2, G1 e G2. Aspergillus nomius e A. bombycis, strettamente legati all’A. flavus, producono aflatossine B1, B2, G1 e G2. Aspergillus tamarii produce le aflatossine B1 e B2 e l’acido ciclopiazonico. Aspergillus australis, infine, produce aflatossine (B1, B2, G1 e G2) e acido ciclopiazonico. La sua presenza sembra essere confinata nell’emisfero sud, è stata infatti ad oggi verificata, in Argentina, in Australia, in Indonesia e in Sud Africa (B12). L’enorme mole di dati internazionali indicano l’Aspergillus flavus e l’Aspergillus parasiticus, come i maggiori responsabili, della percentuale d’aflatossine presente negli Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 30 Tesi di Laurea Loria Tino alimenti di tutto il mondo. Alla stregua di questi anche l’Aspergillus australis può considerarsi un grande serbatoio di aflatossine per il sud del mondo. 5.4 Fattori che ne influenzano la produzione I fattori estrinsechi che influiscono sulla produzione di aflatossine possono suddividersi in fisici, chimici, nutrizionali e biologici. 1. I fattori fisici includono temperatura, umidità relativa, luce, grado di aerazione e pH. La temperatura ottimale per A. flavus è 25°C, mentre per A. parasiticus varia tra 25 e 35°C. La produzione si blocca sotto i 13°C e sopra i 42°C. In generale la temperatura ottimale è compresa nell’intervallo 25-28°C. Un clima caratterizzato da temperatura elevata seguita da brusco calo (giornate calde e notti fredde, temporali) favorisce la produzione di aflatossine, così come in generale qualsiasi fattore di stress. La produzione di aflatossine risulta particolarmente abbondante in stagioni con temperature superiori alla media e piovosità inferiore alla media; Anche l’umidità relativa del substrato e l’umidità relativa ambientale sono fattori critici per la produzione di aflatossine, che aumenta quando la disponibilità di acqua varia in più o in meno (stress idrico) e si porta a livelli non più ottimali per lo sviluppo delle muffe. L’umidità relativa ambientale minima per la produzione di aflatossine varia tra l’83% e l’88%. L’impatto della disponibilità d’acqua (aw), sulla crescita e la produzione delle micotossine è notevole, per le aflatossine si hanno valori ottimali di aw pari a 0.85. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 31 Tesi di Laurea Loria Tino Le quantità maggiori di aflatossine sono prodotte a pH acidi. Valori di pH < 6 favoriscono B1 e B2, valori di pH > 6 favoriscono G1 e G2. Valori massimi di aflatossine si ottengono in un intervallo di pH tamponato tra 5 e 6. 2. I fattori chimici ad esempio riguardano l’uso di fungicidi; 3. I fattori nutrizionali includono la presenza di sostanze specifiche, come minerali (zinco), vitamine, acidi grassi, aminoacidi e le fonti di energia come l’amido, (B10) . 4. Tra i fattori biologici, gli insetti sono da considerare tra i maggiori responsabili della contaminazione sia per la veicolazione delle spore fungine, sia per il danneggiamento dei frutti, con un’aumentata esposizione degli stessi all’attacco fungino. Ma è da considerare anche lo stress della pianta (dovuto a fattori fisici visti prima) che può portare la rottura meccanica delle muffe, e la presenza di altre specie fungine (azione competitiva). 5.5 Contaminazione dei pistacchi La produzione di aflatossine può avvenire sia in campo, sia durante le fasi di essiccazione, stoccaggio, trasformazione, manipolazione e trasporto. La drupa del pistacchio è costituita da 3 parti: Esocarpo, detto anche mallo, involucro esterno di natura polposa Endocarpo, detto guscio, involucro di natura legnosa Seme, pistacchio, che rappresenta il frutto commestibile. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 32 Tesi di Laurea Loria Tino Poco prima della maturazione, il guscio del pistacchio può aprirsi parzialmente, ma l’involucro esterno (mallo) resta sostanzialmente intatto e dunque ha un azione protettiva. Talvolta il mallo può dividersi, questo avviene sia per il processo di crescita naturale sia per effetto di agenti esterni come gli insetti. Se il mallo si divide, i pistacchi sono maggiormente suscettibili alla contaminazione con spore di A. flavus e A. parasiticus veicolate dal vento o dagli insetti stessi. Figura 8 - Pistacchio cv Napoletana con mallo intero Figura 9 - Pistacchio IRAN con avvenuta rottura del mallo In Iran, Afghanistan e Iraq si coltivano specie caratterizzate da grosse noci con gusci che sono relativamente soggette ad un’apertura prematura, inoltre, i fattori climatici caratteristici di queste zone sono un altro elemento favorente. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 33 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 10 - Pistacchio IRAN con guscio aperto In Italia invece di coltivano specie (cultivar Napoletana) con noci di forma affusolata che meno frequentemente si aprono spontaneamente. Inoltre, il clima più temperato rappresenta un altro fattore sfavorevole alla contaminazione. In uno studio condotto negli Stati Uniti su una piantagione che possedeva dall’ 1% al 5% dei frutti con il mallo diviso, è emerso che il 20% dei campioni era contaminati da aflatossine, mentre non vi era alcuna contaminazione nei frutti col mallo intero (S7) . Un altro studio effettuato in Grecia nel 2012, Aflatoxin contamination in pistachio nuts: A farm to storage study (B14), con lo scopo di determinare le fasi di produzione, le condizioni e / o le pratiche di gestione che influenzano la produzione di aflatossine nei pistacchi, ha evidenziato quanto segue. Sono stati presi in esame 80 alberi in 4 pistacchieti (20 alberi per frutteto) della varietà Pistachia vera greco cv Egina. Cinque campioni sono stati prelevati da ogni frutteto per l'analisi delle aflatossine (totale 20 campioni): Il primo campione è stato prelevato prima della maturazione (31 luglio) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 34 Tesi di Laurea Il secondo quando il frutto era maturo (13 agosto) il terzo al momento della raccolta (20-30 agosto) il quarto alla fine del processo di essiccazione l'ultimo nel campione in stoccaggio (45 giorni dopo l'asciugatura) Loria Tino I risultati hanno mostrato che la fase più critica per contaminazione da aflatossine è quella di maturazione ed è stata rilevata una quantità di aflatossine totali sopra i limiti consentiti: da 11 μg/kg a 1361 μg/kg tra frutteti. Alla raccolta, la concentrazione di aflatossine era ancora più elevata raggiungendo 1420 μg/kg nel frutteto A. Livelli più elevati di aflatossine (> 1000 μg/kg) sono stati rilevati nei frutteti con pesanti infestazioni di insetti che indicano dunque una correlazione positiva tra contaminazione e infestazioni. Nelle fasi post-raccolta, la contaminazione da aflatossine rilevata è stata da 40 a 1200 μg/kg alla fine del processo di essiccazione e 650 - 1100 μg/kg nei prodotti stoccati, proporzionale agli stessi livelli di aflatossine nella fase di pre-raccolta ed alle condizioni di stoccaggio, questo ha evidenziato la proliferazione delle muffe nei prodotti conservati non adeguatamente. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 35 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 11 - Pistacchio IRAN contaminato da A.Flavus (S6) Durante la spedizione e lo stoccaggio la formazione di muffe è influenzata da molti fattori, tra cui il livello di umidità, temperatura, aerazione, infestazione da insetti nei silos; il tempo di stoccaggio, trattamenti chimici con fungicidi, densità delle spore e condizioni di conservazione (in particolare percolazione di acqua o condensa) (S7). Quando la raccolta avviene in tempo asciutto, la contaminazione da micotossine di solito non raggiungono proporzioni allarmanti. Diventa un problema invece quando la raccolta avviene in un clima molto umido. In molti paesi in via di sviluppo, la combinazione di apparecchiature di essiccazione insufficienti accoppiate con condizioni atmosferiche umide generano risultati in livelli di aflatossine inaccettabili. I pistacchi sono utilizzati in un gran numero di prodotti nell’industria alimentare come già descritto in precedenza, subiscono processi di tostatura, salatura e raffinazione ma come riportato, le aflatossine sono composti termostabili (fino a 250°C) e dunque tali processi non ne riducono la contaminazione. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 36 Tesi di Laurea Loria Tino La normativa inoltre, come descritto più avanti, vieta l’uso di prodotti chimici allo scopo di decontaminazione, cosi come la mescita con lotti di prodotto non contaminato. Il principio guida per contenere i livelli di contaminazione è quello di adottare un approccio cosiddetto “olistico”, vale a dire una associazione di azioni concertate lungo tutta la filiera agro-alimentare “dal campo alla tavola”. In definitiva, la prevenzione sul campo con l’uso di fungicidi nelle zone maggiormente a rischio, le corrette tecniche di coltivazione che riducono lo stress delle piante, la corretta essiccazione ed il controllo rigoroso dell’umidità nella fase di stoccaggio, unita all’adeguato trasporto sono i mezzi da perseguire per ottenere prodotti salubri. 5.6 Le importazioni in Europa ed il sistema RASFF Sul sito della comunità europea, sezione import/export di merci (S12) , è possibile consultare il flusso delle merci da e verso l’europa. Nello specifico caso dei pistacchi in guscio e sgusciati (codice prodotto: 080251) per l’anno 2014 è possibile estrapolare i dati di seguito riportati: Paese Valore importato in Europa (EURO) Quantità importata in Europa (Kg) Quantità Esportata dall'Europa (Kg) United States Iran, Islamic Republic of Turkey Argentina United Arab Emirates China, People's Republic of Syrian Arab Republic Madagascar Canada Lebanon 361.830.226 111.989.411 1.313.912 347.933 404.924 169.967 272.079 8.589 171.197 6.135 49.239.000 14.763.000 155.000 72.000 48.000 39.000 37.000 22.000 20.000 5.000 20.000 46.000 20.000 0 25.000 0 0 0 5.000 0 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 37 Tesi di Laurea Loria Tino Afghanistan Côte d'Ivoire Japan Switzerland Israel Ceuta Belarus Tunisia Serbia 1.436 2.257 132 0 612 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 16.000 22.000 23.000 30.000 31.000 46.000 67.000 74.000 Totale 476.526.816 64.402.000 613.000 Tabella 5 - Import/Export di Pistacchio per l'anno 2014 in EU Da questa tabella appare chiaro che gli Stati Uniti sono il più grosso importatore di Pistacchi in Europa con quasi 50mila tonnellate di prodotto esportato, seguito da Iran e Turchia. I maggiori acquirenti di pistacchio dall’Europa risultano invece essere Tunisia e Serbia. Paese Valore importato in Italia (EURO) Quantità importata in Italia (Kg) United States Iran, Islamic Republic of Argentina Japan Totale 17.328.240 2.767.398 347.933 2.129.000 367.000 72.000 20.443.571 2.568.000 Quantità Esportata dall'Italia (Kg) 3.000 3.000 Tabella 6 - Import/Export di Pistacchio per l'anno 2014 in Italia Da questa seconda tabella relativa al flusso di pistacchio in Italia, si conferma come maggiore importatore gli Stati Uniti anche in Italia, seguito dall’Iran. Riguardo il Totale di prodotto importato, si noti come l’Italia abbia importato 2.500 tonnellate di pistacchio nel 2014. N.B. nelle precedenti tabelle non sono inclusi i prodotti lavorati e semilavorati al pistacchio, e il mix di frutta secca. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 38 Tesi di Laurea Loria Tino Per quanto riguarda il controllo delle merci, nell’ambito della Comunità Europea è attivo il sistema RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) che consente di notificare in tempo reale la presenza di eventuali rischi per la salute pubblica connessi al consumo di alimenti o mangimi ed utilizzo di oggetti destinati a venire in contatto con alimenti. È un meccanismo di comunicazione del rischio rapido basato sull’utilizzo della posta elettronica e di schede di notifica standard. Questo sistema è entrato in vigore con la direttiva 92/59/CE del Consiglio Europeo relativa alla sicurezza degli alimenti (N4) . Quando uno Stato Membro viene a conoscenza, in seguito ai controlli effettuati, dell’esistenza di un rischio sanitario, lo notifica immediatamente alla Commissione Europea che a sua volta, sentito il parere dell’Autorità, lo trasmette a tutti gli altri Stati della Comunità tramite i “Punti di contatto” (enti di riferimento per ogni Stato Membro). Sulla base delle notifiche, la Commissione Europea può inoltre adottare decisioni relative a specifiche merci che possono rappresentare un rischio per la salute umana, subordinandone l’importazione in territorio comunitario a particolari condizioni. Le merci di provenienza extra CE possono entrare nel territorio comunitario solo attraverso i “Punti identificati di importazione”, cioè porti, aeroporti o punti di attraversamento terrestre autorizzati [N2]. In Italia, presso i punti identificati d’importazione sono presenti gli Uffici di Sanità Marittima e di Frontiera (USMAF) o le loro Unità Territoriali (UT), i quali, assieme ai Punti di Ispezione Frontaliera (PIF) e agli Uffici Veterinari Adempimenti CEE (UVAC), effettuano, tra le altre attività, i controlli igienico-sanitari sulle merci in ingresso destinate al consumo umano che possano rappresentare, anche solo potenzialmente, un rischio per la salute e Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 39 Tesi di Laurea Loria Tino la sicurezza delle persone. Gli USMAF sono strutture direttamente dipendenti dal Ministero della Salute. Figura 12 - Distribuzione territoriale degli USMAF (S9) Dal 2006 è diventato operativo per gli USMAF un applicativo informatico denominato “NSIS USMAF”, parte integrante del Nuovo Sistema Informativo Sanitario (NSIS); esso consente il collegamento in rete tra i 17 uffici USMAF, le 37 unità territoriali e gli Uffici centrali di coordinamento. Secondo quanto definito dal Regolamento (CE) 178/2002 (N5) , in caso di analisi con esito positivo, quindi di prodotto non regolamentare, deve esserne data notifica immediata alla Commissione Europea per attivare l’allerta. Ciò avviene mediante la trasmissione delle informazioni registrate nel NSIS USMAF al Punto di Contatto alla Commissione Europea, che entro 24 ore la inserisce nel sistema RASFF. Il flusso dei dati (NSIS – RASFF), per gli Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 40 Tesi di Laurea Loria Tino Uffici USMAF, avviene in entrambe le direzioni, in quanto gli stessi medici ed operatori addetti al controllo consultano, nella fase di valutazione delle richieste di importazione merce, sia il sistema NSIS (contenente le allerte generate in ambito nazionale dagli USMAF), sia il sistema RASFF per le notifiche in ambito comunitario. Ricevuta la notifica, la Commissione Europea (DG SANCO) trasmette immediatamente l’informazione a tutti gli stati membri, che devono notificare le misure d’allerta prese, compreso il rifiuto di carichi all’importazione in un dato punto identificato ed eventuali restrizioni o richiami di merce già distribuita sul mercato. L’allerta si conclude dopo il decimo campionamento negativo effettuato su casi analoghi. Come si legge nel REG. 16/2011/UE (N6) , le notifiche possono essere di diverso tipo: «notifica di allarme», una notifica di un rischio che richiede o potrebbe richiedere un’azione rapida in un altro paese membro; «notifica di informazione», una notifica di un rischio che non richiede un’azione rapida in un altro paese membro; questa può essere: o «notifica di informazione per follow-up», una notifica di informazione relativa a un prodotto già presente o che potrebbe essere immesso sul mercato in un altro paese membro; o «notifica di informazione per attenzione», una notifica di informazione relativa a un prodotto che è presente solo nel paese membro notificante; o non è stato immesso sul mercato; o non è più sul mercato; «notifica di respingimento alla frontiera», una notifica di respingimento di una partita, di un container o di un carico di alimenti o di mangimi come descritta all’articolo 50, paragrafo 3, lettera c), del regolamento (CE) n. 178/2002 (N5) . Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 41 Tesi di Laurea Loria Tino Il destino delle merci contaminate dipende dal contenuto di contaminante riscontrato. Per le contaminazioni da Aflatossine, nello specifico, l’art. 19 del Regolamento (CE) 882/2004 (N3) prevede: distruzione; trattamenti secondo l’art. 20 del Regolamento sopra citato per rendere conforme la partita, è vietata la diluizione; re-invio al paese d’origine o ad altro paese con normativa che ne consenta l’importazione, secondo quanto definito all’art. 21 Regolamento sopra citato uso a fini industriali o per estrazione dell’olio. Le condizioni di identificazione e circolazione in sicurezza della merce destinata a trattamenti sul territorio nazionale sono descritte nel documento SANCO/1208/2005[N2]. In particolare, per le merci potenzialmente contaminate da aflatossine, la Decisione della Comunità Europea 06/504/CE stabilisce differenti frequenze di controlli, che variano dal 5% al 100% del carico, a seconda della matrice e della provenienza dello stesso [N2]. Sul sito del RAFSS (S10) è possibile consultare i report annuali delle notifiche, nonché la lista costantemente aggiornata di tutte le notifiche in atto dal 1979 ad oggi con la possibilità di eseguire ricerche inserendo la “categoria prodotto” (tipo di alimento), la “categoria di rischio” (es. micotossine), la “parola chiave” (es. Aflatossine), la nazione che ha dato l’allerta ecc. Facendo una rapida ricerca nel periodo 2014-2015, inserendo i seguenti dati: categoria prodotto = nuts, nuts product and seeds categoria di rischio = mycotoxins Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 42 Tesi di Laurea Loria Tino keywords = pistachio, aflatoxin Ed elaborando la tabella dei risultati, sono emerse : 86 notifiche nell’ anno 2014 67 notifiche nel periodo Gennaio-Giugno 2015 E’ possibile consultare le tabelle elaborate nei documenti in allegato: Allegato 1 – Notifiche RASFF anno 2014 relativa alle aflatossine nel pistacchio in guscio e sgusciato importato in UE Allegato 2 - Notifiche RASFF periodo Gennaio-Giugno 2015 relative alle aflatossine nel pistacchio in guscio e sgusciato importato in UE Dai dati, si riscontra che circa il 90 % delle notifiche sono state “notifica di respingimento alla frontiera ”, inoltre sia per il 2014 che per il 2015, nel 55% dei casi si è trattato di pistacchi provenienti dall’Iran, seguono Stati Uniti e Turchia con circa il 20% a testa dei casi. Durante questi 18 mesi presi in esame, l’Italia ha trasmesso 33 notifiche (il 21 % del totale). In tutte le notifiche, il contenuto di aflatossine è superiore al tenore massimo ammesso per legge, e in bel 14 casi supera i 200 µg/kg (20 volte superiore). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 43 Tesi di Laurea Loria Tino In un caso particolare notificato dalla Spagna il 06/05/2015 riguardante pistacchio in guscio proveniente dall’Iran (cod. rif. 2015.AUV), il contenuto di AFB1 era di 796 µg/kg, quasi 1 mg/Kg! 5.7 Normativa A livello comunitario, il Regolamento (CE) 1881/2006 (N7) “che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari”, è stato modificato dal Regolamento (UE) 165/2010 (N8) per quanto riguarda le sole aflatossine. L’EFSA ha infatti deciso di innalzare i tenori massimi di aflatossina B1, aflatossine totali (Somma di B1, B2, G1 e G2) ed aflatossina M1 in prodotti alimentari quali cereali, frutta secca, spezie, prodotti per l’infanzia e latte. Per quanto riguarda i Pistacchi Sgusciati [rif. 2.1.6 in Tabella 7] (incluso pistacchio tritato, pasta pura al 100%, e tutte le altre forme usate come ingredienti nei prodotti derivati di pistacchio), si è passato da un tenore massimo fissato nel REG (CE) 1881/2006 di 2,0 μg/kg per AFB1 e 4,0 μg/kg per AFtot all’attuale tenore massimo del Reg. (UE) 165/2010 di 8,0 μg/kg per AFB1 e 10 μg/kg per AFtot . Per il Pistacchio in Guscio [rif. 2.1.2 in Tabella 7] (considerato come prodotto che deve subire trattamento fisico prima del consumo umano allo scopo di ridurre il quantitativo di aflatossine, come ad esempio la cernita per eliminare quelli visibilmente ammuffiti) l’attuale tenore massimo è di 12,0 μg/kg per AFB1 e 15 μg/kg per AFtot . Dal nuovo regolamento si legge che: Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 44 Tesi di Laurea Loria Tino “Il gruppo di esperti scientifici sui contaminanti nella catena alimentare (CONTAM) dell’Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA), in data 25 gennaio 2007, ha concluso che l’innalzamento da 4 μg/kg a 8 o a 10 μg/kg dei tenori massimi di aflatossine totali nelle mandorle, nelle nocciole e nei pistacchi avrebbe effetti modesti sulle stime di esposizione alimentare, sul rischio di tumori e sui margini di esposizione calcolati. Il gruppo di esperti ha concluso inoltre che l’esposizione alle aflatossine da tutte le fonti dovrebbe essere al livello più basso ragionevolmente ottenibile, perché le aflatossine sono genotossiche e cancerogene. I dati dimostrano che si potrebbe ridurre l’esposizione alimentare totale alle aflatossine se, grazie a una più efficace applicazione delle normative e a una diminuzione dell’esposizione da fonti alimentari diverse da mandorle, nocciole e pistacchi, venisse ridotto il numero di prodotti alimentari altamente contaminati che arrivano sul mercato.” Il rapporto è stato pubblicato su l’EFSA Journal n°446 del 2007 (N9) . (Nds) In pratica dicono si ridurre il numero di prodotti contaminati importati diversi dalla frutta secca, ma intanto hanno alzato il tenore massimo di aflatossine per permettere l’ingresso di mandorle, nocciole e pistacchi esteri. Prodotti alimentari Tenori massimi (μg/kg) 2.1. Aflatossine 2.1.1. Arachidi e altri semi oleosi ( ) da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari ad eccezione: —delle arachidi e degli altri semi oleosi da sottoporre a pressatura per la produzione di oli vegetali raffinati Mandorle, pistacchi e semi di albicocca da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari Nocciole e noci del Brasile da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari 2.1.2. 2.1.3. B1 40 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte Totali 5 8,0 ( ) 5 12,0 ( ) 5 8,0 ( ) M1 5 — 5 — 15,0 ( ) 15,0 ( ) 5 15,0 ( ) pagina 45 Tesi di Laurea 2.1.4. 2.1.5. 2.1.6. 2.1.7. 2.1.8. 2.1.9. 2.1.10. 2.1.11. 2.1.12. 2.1.13. 2.1.14. 2.1.15. 2.1.16. 2.1.17. (1) (2) (3) (4) (5) Loria Tino 5 10,0 ( ) 5 4,0 ( ) 5 10,0 ( ) 5 10,0 ( ) 2,0 ( ) 5 4,0 ( ) — 5,0 10,0 — 2,0 4,0 — 2,0 4,0 — 5,0 10,0 — — — 0,050 5,0 10,0 — 0,10 — — — — 0,025 0,10 — 0,025 Frutta a guscio, diversa dalla frutta a guscio di cui ai punti 2.1.2 e 2.1.3, da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quale ingrediente di prodotti alimentari 40 Arachidi e altri semi oleosi ( ) e relativi prodotti di trasformazione, destinati al consumo umano diretto o all’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari, ad eccezione: — degli oli vegetali crudi destinati alla raffinazione — degli oli vegetali raffinati Mandorle, pistacchi e semi di albicocca destinati al consumo umano diretto o all’impiego quali ingredienti di prodotti 41 alimentari ( ) Nocciole e noci del Brasile destinate al consumo umano diretto o 41 all’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari ( ) Frutta a guscio, diversa dalla frutta a guscio di cui ai punti 2.1.6 e 2.1.7, e relativi prodotti di trasformazione, destinati al consumo umano diretto o all’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari 5,0 ( ) Frutta secca da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quale ingrediente di prodotti alimentari Frutta secca e relativi prodotti di trasformazione, destinati al consumo umano diretto o all’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari Tutti i cereali e loro prodotti derivati, compresi i prodotti trasformati a base di cereali, eccetto i prodotti alimentari di cui ai punti 2.1.12, 2.1.15 e 2.1.17 Granturco e riso da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari 6 Latte crudo ( ), latte trattato termicamente e latte destinato alla fabbricazione di prodotti a base di latte Le seguenti specie di spezie: Capsicum spp. (frutti secchi dello stesso, interi o macinati, compresi peperoncini rossi, peperoncino rosso in polvere, pepe di Caienna e paprica) Piper spp. (frutti dello stesso, compreso il pepe bianco e nero) Myristica fragrans (noce moscata) Zingiber officinale (zenzero) Curcuma longa (curcuma) Miscele di spezie contenenti una o più delle suddette spezie Alimenti a base di cereali e altri alimenti destinati ai lattanti e ai 3 7 bambini ( ) ( ) Alimenti per lattanti e alimenti di proseguimento, compresi il latte 4 8 per lattanti e il latte di proseguimento ( ) ( ) 9 10 Alimenti dietetici a fini medici speciali ( ) ( ) destinati specificamente ai lattanti 2,0 ( ) 8,0 ( ) 5,0 ( ) 5 5 5 — — — 5 5 GU L 37 del 13.2.1993, pag. 1. GU L 364 del 20.12.2006, pag. 5. Codex General Standard for Contaminants and toxins in foods (CODEX STAN 193-1995) The EFSA Journal (2007) 446, pagg. 1-127. Dichiarazione del gruppo di esperti scientifici sui contaminanti nella catena alimentare, su richiesta della Commissione europea, sugli effetti per la salute pubblica di un innalzamento dei tenori di aflatossine totali da 4 μg/kg a 10 μg/kg nella frutta a guscio diversa da mandorle, nocciole e pistacchi. The EFSA Journal (2009) 1168, pagg. 1-11. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 46 Tesi di Laurea Loria Tino (40) Semi oleosi di cui ai codici NC 1201, 1202, 1203, 1204, 1205, 1206, 1207 e prodotti derivati di cui al codice NC 1208; i semi di melone rientrano nel codice ex 1207 99. (41) Nel caso in cui i relativi prodotti derivati/di trasformazione siano derivati/trasformati esclusivamente o quasi esclusivamente a partire dalla frutta a guscio in questione, i tenori massimi definiti per la corrispondente frutta a guscio si applicano anche ai prodotti derivati/di trasformazione. Negli altri casi si applica ai prodotti derivati/di trasformazione l’articolo 2, paragrafi 1 e 2.»; Per tutte le altre note si veda il REG (CE) 1881/2006 Tabella 7 – Tabella aggiornata dal Regolamento (UE) 165/2010 (N8) relativa al tenore massimo di Aflatossine nei prodotti alimentari Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 47 Tesi di Laurea Loria Tino REG (CE) 1881/2006 Prodotto AFB1 Reg. (UE) 165/2010 AFtot AFB1 AFtot μg/kg pistacchi destinati al consumo umano diretto o all’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari, incluso pistacchio tritato, pasta pura al 100%, pistacchi da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano o dell’impiego quali ingredienti di prodotti alimentari 2,0 4,0 8,0 10,0 5,0 10,0 12,0 15,0 Tabella 8 - riepilogo aumento livelli aflatossine in UE nel 2010 Dunque i criteri seguiti nei Regolamenti per la fissazione dei livelli si basano essenzialmente sulla differenza tra i prodotti alimentari destinati all’uso umano per i quali sia necessario impiegare trattamenti fisici per la riduzione del tenore di aflatossina prima che l’alimento sia idoneo al consumo rispetto a quei prodotti alimentari già pronti per il consumo. Inoltre nei due Regolamenti è vietato l’uso di agenti chimici per decontaminare le partite di prodotti contaminati e la possibilità di miscelare partite conformi a quelle non conformi. Si evidenzia inoltre che gli stessi limiti massimi tollerabili sono stati fissati anche sugli ingredienti. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 48 Tesi di Laurea Loria Tino 6 TOSSICITA’ DELLE AFLATOSSINE L’impatto delle aflatossine sulla salute dipende dalla quantità di aflatossina assunta con gli alimenti, dalla tossicità del composto, dal peso corporeo dell’individuo, dalla presenza di altre micotossine e da fattori dietetici. Per stabilire un rapporto di causalità tra l’ingestione di aflatossine e una specifica malattia umana devono essere soddisfatti alcuni criteri: presenza di aflatossine negli alimenti, accertata esposizione alle aflatossine, correlazione fra esposizione e incidenza di una determinata malattia, riproducibilità dei caratteristici sintomi negli animali da esperimento, simile modalità di azione nell’uomo e nei modelli animali. Una misura dell’esposizione sull’uomo è oggi possibile grazie alla messa a punto della metodica per l’individuazione di biomarcatori molecolari consistenti nella determinazione quantitativa delle aflatossine o dei loro derivati metabolici nei fluidi biologici dei soggetti esposti. Questo tipo di test è stato usato per indagini epidemiologiche in alcune aree dell’Africa e dell’Asia, dove il 95% circa dei sieri testati è risultato positivo all’analisi dell’addotto aflatossina-albumina. In alternativa, il rischio per l’uomo viene valutato in maniera indiretta, partendo dalla tossicologia animale e dall’analisi statistica di dati epidemiologici relativi a popolazioni a rischio. Sono stati finora accertati almeno otto eventi epidemiologici di aflatossicosi acute dell’uomo. In uno di essi, verificatosi nell’India occidentale e associato al consumo di mais contaminato mediamente da 2 ppm di aflatossina B1, sono stati registrati 400 casi di epatite cronica di cui 100 con esito mortale. Inoltre, gli studi epidemiologici condotti sulle popolazioni a rischio dell’Africa centro-meridionale (Kenia, Monzambico) e della Tailandia hanno chiaramente Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 49 Tesi di Laurea Loria Tino indicato l’esistenza di una correlazione positiva tra ingestione di aflatossine con la dieta e incidenza del cancro del fegato. Le aflatossine sono state trovate anche in preparati di biopsia di fegato di bambini sudanesi affetti da epatiti croniche, nonché nel latte materno di donne sudanesi (si ricorda che il cancro primario del fegato è soprattutto una malattia delle popolazioni giovani delle regioni tropicali e subtropicali, mentre è relativamente raro in Europa e in America del Nord). Casi indiscussi di fibrosi epatica sono stati constatati nell’uomo dopo una contaminazione prolungata di farine contaminate da A. flavus. Varie organizzazioni internazionali come la Food and Agriculture Organization, la World Health Organization, la Food and Drug Administration, l’International Agency for Research on Cancer e il Joint Expert Committee on Food Additives (FAO, WHO, FDA, IARC, JECFA), sono costantemente impegnate nella valutazione del rischio per la salute umana ed animale derivante dalle micotossine. L’Istituto Superiore della Sanità ha più volte ribadito, che qualora mangimi contaminati vengano usati nell'alimentazione di animali da allevamento; anche i prodotti da questi derivati, possono risultare contaminati. Recenti osservazioni hanno riscontrato la presenza dell’aflatossina B1, in un’ampia varietà di prodotti alimentari, confermando cosi la persistenza della stessa nel mais, grano, semi di lupino, fava, latte, yogurt, formaggi e uova. Le aflatossine sono essenzialmente delle epatotossine dotate anche di attività cancerogena, mutagena e probabilmente teratogena. Tra esse la più potente è la B1 che per questo è stata oggetto di molte approfondite ricerche. La scala di tossicità è cosi stabilita: B1 > M1 > G1 > B2 > G2 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 50 Tesi di Laurea Loria Tino Le manifestazioni di tossicità generate dalle aflatossine possono essere di vario ordine in conseguenza dell’ampia gamma di specie fungine che le producono, della diversa tossicità intrinseca, della dose, dell’organo bersaglio, del sesso, dell’età e della specie animale. L’incidenza di certi tipi di cancro pare essere fortemente condizionata dall’elevata tossicità di alcune aflatossine, proprio questo aspetto desta perplessità circa la sicurezza di mangimi ed alimenti. 6.1 Tossicocinetica L’aflatossina B1 dopo l’assunzione da parte di un vertebrato superiore può essere metabolizzata ad altri composti, alcuni dei quali sono caratterizzati da una maggiore o minore tossicità. Queste trasformazioni comprendono reazioni di prima fase (riduzione, ossidazione e idrolisi) e di seconda fase che consentono la combinazione con un composto naturale prodotto dall’organismo. 6.1.1 Assorbimento Le aflatossine sono composti caratterizzati da una elevata lipofila, quando assunte per via orale vengono assorbite prevalentemente a livello intestinale e passano al torrente circolatorio dove si legano alle albumine. L’assorbimento attraverso il sistema respiratorio è stato accertato nell’uomo in addetti alla macinazione dei mangimi ma l’importanza di questa modalità di intossicazione non è stata attualmente quantificata. 6.1.2 Distribuzione Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 51 Tesi di Laurea Loria Tino Le aflatossine tendono a distribuirsi nel grasso e nei tessuti molli, tuttavia le concentrazioni più elevate di residui si riscontrano negli organi coinvolti nei processi di detossificazione: il rene e soprattutto il fegato. Esiste una correlazione fra la quantità di tossina ingerita e la presenza di residui in questa ultima sede. 6.1.3 Metabolismo Reazioni di fase 1 La reazione più importante nel metabolismo di prima fase dell’aflatossina B1 è l’ossidazione da parte di enzimi microsomiali che avviene prevalentemente a livello epatico. Il fegato rappresenta la sede metabolica dove, ad opera delle ossidasi a funzione mista citocromo P-450 dipendenti, presenti nella frazione microsomiale, si giunge alla formazione di diversi metaboliti (aflatossina Q1, P1, B2a, M1, M2, aflatossicolo, ecc.) e degli intermedi epossidi. (B16) Mediante l’azione di enzimi a funzione mista citocromo P-450 dipendenti viene prodotto l’AFB1 8,9 epossido, una delle sostanze a più alto potere cancerogeno attualmente conosciute. Mediante idrossilazione si può avere la formazione di aflatossina M1 e Q1; attraverso una reazione di O-demetilazione si ottiene l’aflatossina P1. Questi ultimi due composti sono caratterizzati da una tossicità molto inferiore rispetto alla B1 (B16). L’aflatossicolo, prodotto dalla riduzione della B1, in natura viene velocemente riconvertito a B1 e ne costituisce quindi una riserva(B16). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 52 Tesi di Laurea Loria Tino Reazioni di fase 2 Il processo di detossificazione dell’organismo nei confronti delle aflatossine avviene principalmente attraverso due reazioni: il B1-8,9-epossido viene legato al glutatione (reazione catalizzata dalla GSH-transferasi) ed in minor misura trasformato in aflatossicolo; l’attività di questo enzima varia molto nelle differenti specie animali e questo è attualmente ritenuto il motivo delle enormi differenze di suscettibilità a questa tossina da parte delle varie specie animali studiate. Altri metaboliti (AFM1; AFP1; AFQ1) vengono coniugati con l’acido glucuronico. Le reazioni di seconda fase diminuiscono la tossicità ed aumentano la idrosolubilità e la polarità dei composti favorendone l’escrezione. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 53 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 13 - Metabolismo aflatossina B1 6.1.4 Escrezione Per quanto riguarda l’escrezione dell’AFB1, una frazione della tossina viene eliminata attraverso il tratto intestinale, ma le principali vie di escrezione sono rappresentate da quella biliare (in forma di AFB1-glutatione) e urinaria (come aflatossina M1). Anche il latte è una via di escrezione dell’AFB1 (come AFM1), costituendo in tal modo, a causa della rilevante tossicità di questo metabolita, una potenziale fonte di assunzione durante la fase della lattazione. Figura 14 - Escrezione dei metaboliti di AFB1 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 54 Tesi di Laurea Loria Tino 6.2 Tossicodinamica Le aflatossine hanno la capacità di interferire con il metabolismo energetico, inibendo l’attività delle catene di trasporto degli elettroni. Successivamente alla biotrasformazione, tali sostanze interagiscono con diverse macromolecole dell’organismo (DNA, RNA, proteine e carboidrati) e possono indurre mutazioni genetiche, inibizione dei sistemi enzimatici e alterazioni del metabolismo dell’interferone coinvolto nelle risposte immunitarie e nelle reazioni antinfiammatorie. Attualmente sono noti due tipi di interazione con il DNA da parte delle aflatossine: la prima consiste in un legame reversibile non covalente con i siti attivi della macromolecola, la seconda in un legame molto stabile di tipo covalente che porta alla formazione degli addotti del DNA. In questo caso non si lega al DNA l’aflatossina, ma il suo metabolita 8,9-epossido. L’epossido ha elevato potenziale cancerogenetico a sua volta determinato dalle reazioni con gli acidi nucleici. L’alterazione nell’espressione di particolari geni, detti proto- oncogèni, presenti in forma inattiva in tutte le cellule e attivabili anche da una singola mutazione, può portare ad alterazioni nella regolazione dello sviluppo, della proliferazione e dell’iperplasia cellulare; queste alterazioni possono eventualmente progredire verso una evoluzione maligna. Mentre la formazione di addotti con il DNA è responsabile dell’attività cancerogena, la reazione tra l’epossido e le proteine potrebbe essere responsabile della tossicità acuta dell’aflatossina B1. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 55 Tesi di Laurea Loria Tino Anche la diminuzione della sintesi proteica operata dalle aflatossine avviene mediante due meccanismi: un azione disaggregante sui poliribosomi e sul RER epatici; il blocco della trascrizione da parte della RNA-polimerasi DNA-dipendente, con conseguente diminuzione della sintesi proteica cellulare. Un effetto è l’inibizione a livello epatico della sintesi dei fattori della coagulazione ed anche fenomeni di steatosi, infatti la diminuita sintesi di proteine utili al trasporto dei lipidi (apoproteine per le lipoproteine) causa alterazione della mobilizzazione e del trasporto dei lipidi con conseguente degenerazione grassa del fegato. Infine le aflatossine determinano anche alterazione del metabolismo dei carboidrati con diminuzione delle riserve epatiche di glicogeno. Gli effetti tossici conseguenti dovuti all’esposizione all’aflatossine sono correlati alla dose ed al tempo di esposizione: vengono distinte due diverse forme di intossicazione, acuta e cronica. 6.3 Tossicità Acuta L’aflatossina (AFB1) è stata classificata come composto molto tossico (dose letale mediana DL50 1-50 mg/kg) per molte specie animali ed estremamente tossico (DL50 < 1mg/kg) per alcune particolarmente sensibili come trota, gatto e anatroccolo. Quest’ultimo, per l’elevata sensibilità (la DL50 è 0,35 per AFB1 in animali di un giorno), in passato veniva utilizzato per la prova biologica atta a stabilire l’eventuale contaminazione delle derrate alimentari (B16). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 56 Tesi di Laurea Loria Tino Per l’uomo la DL50 per AFB1 oscilla tra 0,6 e 10 mg/Kg di peso corporeo. In Tabella 9 sono riportati i valori di DL50 per alcune specie animali. Specie coniglio DL50 espressa in mg/kg 0,3 trota 0,3 anatroccolo gatto 0,35 0,55 tacchinotto 0,4-0,6 cane 0,5-1 suini appena svezzati 0,6 gallina ovaiola 0,2-1 pulcino 1-1,5 Uomo 0,6 - 10 ratto 5-18 Tabella 9 - DL50 in diverse specie L’intossicazione acuta da aflatossine (aflatossicosi acuta) è caratterizzata da depressione ed anoressia seguite da anemia, ascite, ittero e diarrea. L’organo di elezione per la detossificazione, il fegato, presenterà necrosi emorragiche e ingrossamento delle cellule epatiche (colore grigiastro, struttura fibrosa, lobi allargati e bordi arrotondati); inoltre, possono essere interessati anche, reni, sistema nervoso centrale e tessuti, questi ultimi mostreranno una maggiore predisposizione alle lesioni cutanee, con ritardo della coagulazione ematica. La morte si verifica di norma entro poche ore o giorni ed è dovuta alla gravità delle lesioni epatiche. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 57 Tesi di Laurea Loria Tino 6.4 Tossicità Cronica Quindi gli effetti prodotti in conseguenza dell’ingestione di alimenti contaminati variano in relazione alla tipologia d’animale, al tessuto colpito, alla quantità ingerita, e ad altri fattori che possono condurre alla formazione di carcinomi. Nel 1987 il Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA), ha dichiarato che l’aflatossina B1 è il più potente epatocancerogeno naturale conosciuto per tutte le specie di mammiferi studiate. È dimostrato sperimentalmente che le aflatossine sono potenti cancerogeni in grado produrre cancro al fegato anche in virtù di un’azione combinata tra aflatossine e virus dell’epatite B (HBV) nell’eziologia del tumore epatico primario, è bene ricordare che produce negli individui portatori di HBV tossicità circa 30 volte superiore. Recenti studi effettuati in una fascia sociale ad alto rischio come quella dei consumatori di stupefacenti marjiuana ed eroina, ottenuti da piante che veicolano aflatossine, hanno rilevato un’infezione più aggressiva da HBV ed HIV. Nel 20% dei casi di eroinomani esaminati in Olanda ed Inghilterra vi è la positività sierica per l'aflatossina B1, l’aflatossina B2 e l’aflatossicolo. Anche il frequente consumo di bassi livelli di aflatossine è generalmente associabile a malattie croniche come il cancro, aspetto questo, che desta particolare timore. Studi epidemiologici effettuati nei primi anni settanta in alcuni Stati dell’Africa e del Sud Est Asiatico hanno dimostrato che in casi di prolungata esposizione umana alle aflatossine Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 58 Tesi di Laurea Loria Tino esiste una correlazione lineare fra consumo alimentare e incidenza di cirrosi epatica e epatocarcinoma. I dati sulla tossicità cronica per l’uomo sono derivati in gran parte da limiti basati su dati di origine animale, talvolta troppo alti a causa della differente sensibilità, mostrata dalle diverse specie animali. Per questo l’Europa e gli organismi internazionali non hanno fissato una dose giornaliera accettabile (DGA) per le aflatossine. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 59 Tesi di Laurea Loria Tino 7 DETERMINAZIONE ANALITICA DELLE AFLATOSSINE 7.1 Campionamento Riuscire ad ottenere un campione rappresentativo di pistacchi per la determinazione della contaminazione da aflatossine è particolarmente difficile, dato che è stata verificata un’incidenza della contaminazione fungina che riguarda un numero molto basso di pistacchi. Come dimostrato da vari studi, infatti, in 30 kg di campione può essere contenuto un singolo pistacchio contaminato; d’altra parte i frutti di pistacchio possono contenere un livello di aflatossine decisamente alto, nell’ordine di 1.000 µg; per tale motivo da un singolo frutto contaminato può derivare una contaminazione media di circa 33 μg/kg di prodotto, considerando 30 kg di prodotto come unità base, come consigliato dalla Comunità europea. Nell’attuazione dei cicli di campionamento ci si ispira ai principi enunciati nel Reg. (CE) n. 401/2006 Allegato I. 7.2 Scelta del metodo di analisi Un metodo analitico per l’analisi delle micotossine deve: (B15) 1. Essere adatto ai programmi di monitoraggio (screening per il controllo qualità dei materiali nella produzione di alimenti / mangimi); 2. Consentire il rispetto dei tenori massimi stabiliti dalle normative internazionali (determinazione di micotossine a livelli inferiori ai tenori massimi ammissibili, secondo criteri di accettabilità definiti); Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 60 Tesi di Laurea Loria Tino 3. Permettere la raccolta di informazioni sull'esposizione umana e animale alle micotossine (studi di valutazione del rischio); I parametri richiesti per l’accettabilità di un metodo di analisi sono: Specificità (o selettività): abilita di un metodo di determinare un analita in presenza di composti potenzialmente interferenti; Limiti di rivelabilità (LOD): la più piccola quantità di analita che può essere rivelata sulla base del rapporto segnale/ rumore dello strumento usato; Limite di quantificazione (LOQ) : la più piccola quantità di analita che può essere purificata e quantificata con un metodo; Intervallo di applicabilità: intervallo di concentrazione dell’analita in cui e stato provato il metodo e per il quale sono noti i valori di precisione ed accuratezza; Accuratezza: definisce il grado di concordanza fra il valore medio di un certo numero di misure ed il valore vero attribuito al parametro da misurare; Precisione: grado di accordo di misurazioni ripetute in modo indipendente applicando lo stesso metodo su uno stesso materiale; Ripetibilità: esprime la deviazione di una serie di misure ripetute rispetto al loro valore medio; Riproducibilità: distribuzione dei risultati di prove reciprocamente indipendenti ottenuti in condizioni di “riproducibilità”. La riproducibilità intra-laboratorio può essere misurata all’interno dello stesso laboratorio con lo stesso metodo, sullo stesso materiale da saggio, da differenti operatori, strumenti, ad intervalli di tempo relativamente lunghi. La riproducibilità inter-laboratorio può essere valutata mediante studi collaborativi (identico materiale da saggio e metodo analitico, differenti laboratori, operatori e strumenti. Esempio prove interlaboratorio circuiti UNICHIM, FAPAS). Esattezza o recupero: può essere stabilita solo per mezzo di un materiale di riferimento certificato (MRC). Se non e disponibile un MRC, l’esattezza è valutata dall’analisi di Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 61 Tesi di Laurea Loria Tino campioni fortificati, cioè arricchiti con una quantità nota dell’analita da rilevare e si definisce recupero. L’esattezza o recupero rappresenta il rapporto tra il valore medio misurato per un analita in un MRC o in un campione fortificato ed il suo valore certificato o noto, espresso come percentuale di tale valore. Incertezza di misura: può essere intesa come la stima dell’intervallo dei valori entro cui cade il valore vero di una misura. Questa definizione deriva dal fatto che ogni misura e caratterizzata da variabilità, che si può verificare durante i vari stadi della procedura analitica. 7.3 Confronto delle tecniche analitiche applicabili Nel corso degli anni sono state sviluppate e normate per le Aflatossine diverse metodologie, ormai applicate dalla stragrande maggioranza dei laboratorio nel mondo. Ma l’utilizzo di metodi analitici validati non è garanzia sufficiente per ottenere risultati affidabili nella determinazione delle aflatossine. Un fondamentale requisito a supporto dell’affidabilità è l’utilizzo di tecniche di assicurazione della qualità dei risultati che prevedano, ove possibile, l’utilizzo di materiali di riferimento certificati (ad es. JRC/IRMM) e la partecipazione a circuiti d’interconfronto (ad esempio FAPAS®). È inoltre altrettanto importante stimare l’incertezza di misura: attualmente sono disponibili specifiche guide che indichino come effettuare tale stima (ad es. EURACHEM/CITAC Guide CG4 “Quantifying Uncertainty in analitycal Measurement” ). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 62 Tesi di Laurea Loria Tino Tecnica Vantaggi Contro TLC - permette determinazioni precise per livelli superiori a 2 µg/Kg - costi limitati - Eccellenti performance (specificità, accuratezza, precisione) - bassi livelli di rivelabilità - sicurezza per l’operatore - pochi punti critici - risultati rapidi - analisi simultanea di molti campioni - alta sensibilità - non richiede attrezzature costose - semplice da utilizzare dopo breve training dell’operatore - fase di automazione - valida per screening - Analisi simultanea di micotossine - altamente sensibile e selettiva - possibilità di ridurre ed eliminare la fase di clean-up - non è necessaria la derivatizzazione - Uso di solventi considerati pericolosi per l’ambiente e l’operatore IAC-HPLC con derivatizzazio ne pre o post colonna e rivelazione fluorimetrica Saggi ELISA ImmunoEnzimatici LC-MS/MS con IAC multianticorpo Riferimenti Normativi AOAC-993.17 - costoso strumentazione - costo IAC - richiede addestramento dell’operatore - tempi di analisi - derivatizzazione - interferenze dovute alla matrice - possibili falsi positivi/negativi - Cross-reattività con altre micotossine (specificità) - Ripetibilità e riproducibilità critiche - necessità dell’analisi di conferma AOAC 991.31 - costi elevati strumentazione - costi IAC - richiede addestramento dell’operatore - elevati costi di manutenzione In fase di sviluppo CEN EN 12955:1999 AOAC 993.16 Tabella 10 - Confronto tecniche analitiche per le aflatossine Generalmente i laboratori che si trovano a gestire grandi quantitativi di campioni, preferiscono eseguire la determinazione con metodi di screening (es. ELISA), che però richiede alta esperienza dell’operatore per evitare errori come i falsi positivi-negativi. Cosi facendo si riducono i costi ed i tempi per le analisi, solo in caso di campioni con valori prossimi o superiori al limite di legge viene eseguita l’analisi di conferma in HPLC. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 63 Tesi di Laurea Loria Tino 7.4 Metodo analitico Applicato L’analisi delle aflatossine è stata eseguita utilizzando un metodo interno validato nel 2010 dal laboratorio Progetto Ambiente & C. s.a.s. (Catania). La validazione è stata necessaria per ottenere la certificazione col sistema italiano di accreditamento “ACCREDIA” avvenuta il 4 maggio 2010 per le 10 prove in esame tra qui quella della determinazione della aflatossine sulla frutta secca, cereali, mangimi e prodotti derivati. La procedura è stato sviluppata partendo dal metodo normato UNI EN 12955:1999 (N10) aggiornata anni dopo dalla UNI EN ISO 16050:2011 (N11) . Io personalmente ho preso parte alla fase di validazione, coordinata dal responsabile del laboratorio Dott. Chim. Danilo Pulvirenti e dal direttore tecnico Dott. Chim. Salvatore Pulvirenti, in quanto tecnico di laboratorio per il suddetto centro analisi dal 2008 ad oggi. 7.4.1 Principio del metodo Le aflatossine presenti nel campione sottoposto ad analisi vengono prima estratte con appropriato solvente, poi purificate mediante l’uso di colonne monouso ad immunoaffinità (IAC), dunque determinate mediante l’uso di un cromatografo liquido a fase inversa con rivelatore fluorimetrico previa derivatizzazione. La determinazione quantitativa dei vari composti viene effettuata con le aree dei rispettivi picchi cromatografici sulla base di opportune rette di taratura di miscele di riferimento. I risultati sono di norma espressi in μg/Kg di Aflatossina B1 e di Aflatossine Totali (somma di B1, B2, G1 e G2). 7.4.2 Fasi operative Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 64 Tesi di Laurea Loria Tino Dopo aver costruito la retta di taratura, utilizzando soluzioni standard di riferimento a titolo noto, si passa alla fase di determinazione di seguito schematizzata: Preparazione del campione da sottoporre ad analisi; Estrazione delle aflatossine dalla matrice; Clean-up per eliminare le sostanze interferenti; Separazione cromatografica mediante HPLC; Derivatizzazione post-colonna per rendere più visibili alcune aflatossine; Determinazione quantitativa mediante uso di rivelatore fluorimetrico; Calcolo del risultato e dell’incertezza di misura associata. 7.4.3 Reagenti e Soluzioni Tutte i reattivi utilizzati devono essere di grado analitico, inoltre la vetreria usata deve essere decontaminata mediante lavaggio con Ipoclorito di sodio al 1% per 1 notte. Solventi per HPLC – Acqua, Metanolo, Acetonitrile. Soluzione derivatizzante PBPB (piridinio idrobromuro per bromuro) 100 mg/L: sciogliere 100 mg di PBPB in circa 50 ml di acqua per HPLC. Quindi portare a volume in un matraccio tarato da 1 L. La soluzione è stabile per quattro giorni se conservata ed utilizzata in luogo fresco (Temperatura non superiore ai 25 ºC) ed al riparo dalla luce diretta del sole. Tampone PBS a pH 7.2 (Phosphate Buffer saline): Miscelare 60 ml di soluzione 23,873 g/l di sodio fosfato bibasico (Na2HPO4*12 H20) e 30 ml di soluzione 9,078 g/l di potassio fosfato monobasico (KH2PO4). Misurare il pH e correggerlo fino a pH 7.2 usando le due soluzioni. Se il pH è più alto usare la soluzione di potassio diidrogeno fosfato. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 65 Tesi di Laurea Loria Tino Soluzione Estraente Metanolo:Acqua 80:20 v/v : Unire 80 ml di Metanolo per HPLC a 20 ml di acqua per HPLC. Soluzione al 1 % v/v di Acetonitrile in Toluene. Porre in un matraccio tarato da 100 ml, 1 ml di acetonitrile e portare a volume con toluene. Materiale di Riferimento per Aflatossina B1, B2, G1 e G2 acquistati singolarmente ed in polvere (es. vials da 1 mg). Soluzione Madre ~ 10 mg/L per Aflatossina B1: Sciogliere tutto il contenuto presente nella vials del materiale di riferimento ( ~ 1 mg) in soluzione 1 % v/v di Acetonitrile in Toluene, portare a volume di 100 mL. Soluzione Madre ~ 10 mg/L per Aflatossina B2: Sciogliere tutto il contenuto presente nella vials del materiale di riferimento ( ~ 1 mg) in soluzione 1 % v/v di Acetonitrile in Toluene, portare a volume di 100 mL. Soluzione Madre ~ 10 mg/L per Aflatossina G1: Sciogliere tutto il contenuto presente nella vials del materiale di riferimento ( ~ 1 mg) in soluzione 1 % v/v di Acetonitrile in Toluene, portare a volume di 100 mL. Soluzione Madre ~ 10 mg/L per Aflatossina G2: Sciogliere tutto il contenuto presente nella vials del materiale di riferimento ( ~ 1 mg) in soluzione 1 % v/v di Acetonitrile in Toluene, portare a volume di 100 mL. 7.4.4 Strumentazione Bilancia analitica con sensibilità di 0,0001 g; pH-metro; Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 66 Tesi di Laurea Loria Tino Omogeneizzatore; Agitatore magnetico; Sistema di evaporazione rotante con pompa da vuoto (rotavapor); Colonne ad immunoaffinità monouso per aflatossine (tipo Afla-clean o equivalenti); HPLC con pompa reciprocante a 3 vie (ELEMENTO B in Figura 15) e sistema di iniezione (ELEMENTO A in Figura 15) Colonna cromatografica C18, dimensioni particelle 5um, lunghezza 250 mm, diametro interno 4.6 mm (ELEMENTO C in Figura 15); Sistema per derivatizzazione post-colonna, formato da: Pompa per soluzione derivatizzante (ELEMENTO D in Figura 15); Valvola a T (ELEMENTO E in Figura 15) 1 - flusso proveniente dalla pompa derivatizzante, 2 – flusso proveniente dalla colonna cromatografica, 3 – flusso in uscita per il rivelatore. Il tubo in uscita 3 dalla valvola T è di lunghezza 1 m per fare in modo che avvenga la reazione di bromurazione. Rivelatore fluorimetrico (FLD) per HPLC (ELEMENTO F in Figura 15); Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 67 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 15 - HPLC con derivatizzatore post colonna utilizzato in laboratorio 7.4.5 Condizioni operative Rivelatore fluorimetrico: λecc = 366 nm; λem = 436 nm; Fase Mobile: Acqua:Metanolo:Acetonitrile 54 : 29 : 17; Flusso eluizione 1 ml/min; Volume di iniezione (loop) = 50 µL; Flusso pompa derivatizzante 0,4 ml/min. 7.4.6 Procedura di calibrazione Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 68 Tesi di Laurea Loria Tino Determinazione della concentrazione delle soluzioni madre. Le soluzioni madre, preparata come descritto, hanno una concentrazione non nota. Per conosce l’esatta concentrazione di tali soluzioni, cosi da poter preparare soluzioni standard a titolo noto, bisogna misurare l’assorbanza di queste soluzioni a 350 nm allo spettrofotometro UV-VIS utilizzando come bianco la soluzione al 1 % v/v di acetonitrile in toluene. Dalla lettura di assorbanza e applicando la seguente formula si ricava la concentrazione delle quattro aflatossine: Conc.(mg / L) ABS MW 1000 Dove: ABS: assorbanza di ciascuna soluzione di aflatossina letta a 350 nm; MW: peso molecolare di ciascuna aflatossina; ε: estinzione specifica di ciascuna aflatossina (in toluene-acetonitrile); Aflatossina MW (gr/mol) Ε B1 312 19300 B2 314 21000 G1 328 16400 G2 330 18300 Tabella 11 - Parametri per il calcolo della concentrazione delle aflatossine Preparazione soluzione di Lavoro 100 ng/mL: Se la concentrazione delle soluzioni madre è esattamente 1 mg-L, prelevare 1 mL per ogni soluzione di ciascun aflatossina ed inserirle nel medesimo matraccio da 100 mL, portare a secco in corrente di azoto e successivamente portare a volume con la fase mobile. Se la concentrazione risulta differente, eseguire gli opportuni calcoli per ottenere la concentrazione finale prefissata. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 69 Tesi di Laurea Loria Tino Preparazione soluzione Standard n° 1 (2 ng/ml): Prelevare 1 ml di soluzione di lavoro 100 ng/mL e trasferirli in un matraccio tarato da 50 mL, portare a volume con la fase mobile. Preparazione soluzione Standard n° 2 (5 ng/ml): Prelevare 2,5 ml di soluzione di lavoro 100 ng/mL e trasferirli in un matraccio tarato da 50 mL, portare a volume con la fase mobile. Preparazione soluzione Standard n° 3 (10 ng/ml): Prelevare 5 ml di soluzione di lavoro 100 ng/mL e trasferirli in un matraccio tarato da 50 mL, portare a volume con la fase mobile. Costruzione delle rette di taratura. Avviare lo strumento attenendosi a quanto indicato nelle condizioni operative, dunque lasciare condizionare la colonna per almeno 30 minuti. Iniettare le 3 soluzioni di calibrazione preparate al momento dell’uso ed acquisire i cromatogrammi. Processare i cromatogrammi elaborando la migliore retta passante per i punti di calibrazione (bestfit lineare) e verificare che il valore di regressione lineare R2 sia > 0,98. Se la retta non è soddisfacente, reiniettare le soluzioni standard. Ordine di eluizione 1 2 3 4 Aflatossina RT G2 5,07 min G1 5,76 min B2 6,79 min B1 8,05 min Tabella 12 - Tempi di ritenzione Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 70 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 16 - Cromatogramma ottenuto per la soluzione standard n°2 Figura 17 - Rette di calibrazione ottenute nelle condizioni descritte sopra Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 71 Tesi di Laurea Loria Tino 7.4.7 Preparazione del campione Il campione deve essere finemente triturato e ben omogeneizzato prima di essere sottoposto ad analisi. Nel caso di pistacchio sgusciato, questo viene macinato direttamente. Nel caso di pistacchio in guscio, questo deve essere precedentemente sgusciato e poi macinato, il risultato viene espresso sulla parte commestibile come da regolamento. 7.4.8 Estrazione In una beuta da 100 mL pesare 25,00 g ± 0,01 g di aliquota di prova macinata e aggiungere 50 ml di una soluzione estraente. Porre la beuta su agitatore magnetico per 30 minuti al termine dei quali, dopo breve sedimentazione, filtrare su filtro di carta raccogliendo il filtrato. Figura 18 - Estrazione Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 72 Tesi di Laurea Loria Tino Prelevare 2 ml con pipetta graduata di filtrato e portarli in un matraccio tarato da 10 ml. Portare a volume con la soluzione di PBS pH 7.2. 7.4.9 Clean-up La purificazione dell’estratto viene eseguita mediante colonnine ad immunoaffinità (IAC) specifiche per aflatossine (tipo aflaclean come in foto) che non hanno bisogno di essere condizionate. Sono in commercio anche colonnine multi-anticorpo e colonnine rigenerabili. Figura 19 - Meccanismo delle IAC Il meccanismo di separazione è di tipo immunoaffine proprio perché la micotossina si lega al sito specifico per l’anticorpo che si trova nel setto della colonnina. Il materiale estraneo viene eliminato per lavaggio con acqua e successivamente il legame aflatossina-anticorpo è rimosso mediante eluizione con opportuno solvente. L’ estrazione e la purificazione possono essere anche eseguite in fase solida (SPE) risparmiando dunque sul costo delle IAC, a discapito però della selettività. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 73 Tesi di Laurea Loria Tino Dunque: fare eluire la soluzione preservante presente nella colonnina rimuovendo il tappo superiore ed inferiore. Immettere i 10 mL di estratto diluito col PBS nella colonnina mediante pipetta pasteur. Una volta eluito tutto l’estratto, riempire il matraccio con 10 ml di acqua deionizzata ed immetterli nella colonnina per eliminare le impurezze. Tappare la colonnina nell’estremità inferiore ed inserirla in un palloncino da 50 mL con tappo a smeriglio. Introdurre 1 ml di metanolo ed attendere 5 minuti. Togliere il tappo inferiore e fare eluire il metanolo attraverso la colonnina nel pallone da 50 mL. Estrarre col altri 3 mL di metanolo poco per volta. Portare a secco al rotavapor Riprendere con 1 mL di fase mobile il campione è pronto per l’analisi strumentale Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 74 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 20 - Clean-up del campione 7.4.10 Analisi del campione L’estratto purificato e ripreso con 1 mL di fase mobile è pronto per l’analisi. Dunque, dopo aver fatto condizionare la colonna per almeno 30 minuti nelle stesse condizioni operative descritte per la costruzione della retta di calibrazione, vengono prelevati ~ 150 µL di campione con una siringa per HPLC ed introdotti nell’iniettore predisposto con loop da 50 µL. Le aflatossine in miscela verranno separate in colonna cromatografica, all’uscita della quale reagiranno con la soluzione di PBPB per essere derivatizzate. La derivatizzazione è necessaria per le aflatossine B1 e G1 in quanto tali molecole non sono dotate di elevata fluorescenza. Reagendo col bromo, esse subiranno bromurazione del doppio legame sull’anello bifurano. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 75 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 21 - reazione di derivatizzazione Figura 22 - Effetto della derivatizzazione sui picchi cromatografici Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 76 Tesi di Laurea Loria Tino La derivatizzazione post-colonna può anche essere eseguita con soluzione di Iodio a 60 °C (iodurazione del doppio legame) oppure con raggi UV a 254 nm (derivatizzazione fotochimica). Oppure può essere eseguita pre-colonna con acido trifluoroacetico (TFA) che idrata il doppio legame. Dopo la derivatizzazione il rivelatore misurerà la fluorescenza, ed il software dello strumento acquisirà il segnale registrando il cromatogramma. Dal tempo di ritenzione RT, specifico per ogni singola aflatossina in miscela, e dall’area del picco interpolata con la retta di taratura, il software fornirà il risultato in ng/mL che servirà al calcolo del risultato di residuo sul campione. Nel caso in qui la risposta cada al di fuori del limite superiore del campo di linearità, prelevare un aliquota di campione inferiore e rieseguire l’analisi. 7.4.11 Calcolo ed espressione del risultato Dal report cromatografico, estrarre il risultato in ng/mL per ogni singola aflatossina individuata nel campione. Dunque procede al calcolo del risultato in µg/Kg (ppb) di campione come segue: Aflatossina ng/g = V estraente mL V finale mL ng ∗ ∗ Risultato in V purificato mL P aliquota g mL Dove: V estraente = Volume miscela estraente (50 mL) V purificato = Volume prelevato per purificazione (2 mL) Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 77 Tesi di Laurea Loria Tino P aliquota = Peso del campione analizzato (25 g) V finale = Volume finale usato per riprendere l’estratto (1 mL) Semplificando: Aflatossina ng/g = 25 mL ng ∗ Risultato in P aliquota g mL Il risultato in ng/g è equivalente a µg/kg (ppb). Procedere al calcolo dell’incertezza estesa (U) da associare al risultato, interpolando linearmente i dati relativi riportati in prestazioni del metodo. Dunque esprimere il risultato come segue: Aflatossina B1 = Risultato µg/kg ± U µg/kg Aflatossine Totali = Somma (B1 + B2 + G1 + G2) µg/kg ± U µg/kg Le cifre significative dell’incertezza da associare alla misura possono essere al massimo due, preferibilmente una. Il risultato deve essere arrotondato allo stesso numero di cifre decimali dell’incertezza che andremo ad associare. Le normali regole dell’arrotondamento possono essere applicate sia per l’incertezza che per il risultato. 7.4.12 Validazione e Prestazioni del metodo La validazione è la “conferma, sostenuta da evidenze oggettive, che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione prevista sono stati soddisfatti” (ISO 9000:2000). Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 78 Tesi di Laurea Loria Tino In accordo alla norma EN ISO/IEC 17025:2000, che definisce i requisiti del sistema di garanzia della qualità nel laboratorio di prova, un metodo di analisi puo essere validato secondo vari schemi. Tra questi sono stati scelti la validazione mediante partecipazione a circuiti inter-laboratorio (profency test) e studi intra-laboratorio. La Decisione 98/179/CE della Commissione Europea richiede che il laboratorio di controllo ufficiale partecipi periodicamente ai proficiency test riconosciuti internazionalmente. La partecipazione ai circuiti inter-laboratorio è importante per valutare le prestazioni analitiche del laboratorio, e confrontarle con quelle di altri laboratori. Il laboratorio ha preso parte al circuito FAPAS durante il periodo tra 2008-2012. Per quanto riguarda la validazione nello studio intra-laboratorio, sono state eseguite una serie di fortificazioni (per la precisione 10 repliche) ai tre diversi livelli di contaminazione (2 ppb, 5 ppb e 10 ppb). I risultati del recupero medio percentuale ottenuto (come si può osservare nella tabella) e dei coefficienti di variazione CV % sono soddisfacenti a tutti i livelli di fortificazione. Il metodo dunque garantisce un elevato recupero dell’analita e la deviazione standard dei dati indica anche una ripetibilità accettabile. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 79 Tesi di Laurea Aflatossina B1 Loria Tino REC. LOD medio µg/Kg % 96 0,1 LOQ µg/Kg 0,2 Concentrazione ai livelli di taratura µg/Kg Scarto tipo di ripetibilità µg/Kg CV (%) Incertezza estesa µg/Kg L1 2,0 0,4 20 0,6 L2 5,0 0,5 10 0,9 L3 10,0 0,8 8 1,0 Campo di applicazione: LOQ –> 20,0 µg/Kg Campo di linearità: 2 µg/Kg -> 10 µg/Kg N.B. Per tutte le aflatossine sono presi come riferimento i valori calcolati per B1. Tabella 13 - prestazioni del metodo Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 80 Tesi di Laurea Loria Tino 8 SCOPO DELLA TESI Lo scopo del lavoro di tesi è stato quello di verificare se il pistacchio commercializzato a Bronte, che, come visto dai dati delle importazioni e da quanto dichiarato dagli operatori del settore, proviene per il 75% da paese Extra UE (in particolare Iran, Turchia e Stati Uniti), sia conforme ai requisiti richiesti dalle vigenti norme circa il limite massimo residuo di aflatossine. Dunque per verificare l’efficienza dei controlli ufficiali eseguiti dai laboratori pubblici, volti a tutela della salute. Analizzando inoltre dei campioni di pistacchio di produzione propria, si è verificato anche il livello di contaminazione per le aflatossine nel pistacchio DOP di Bronte. 8.1 Scelta dei campioni Come precedentemente detto, il pistacchio al naturale ed il semilavorato viene venduto prevalentemente in 5 forme differenti e le forme “pistacchio tritato” e “pasta pura di pistacchio al 100%”, sono quelle a maggior rischio di contraffazione. Dunque proprio queste ultime sono state prese in considerazione per eseguire le analisi di controllo sul contenuto di Aflatossine in prodotti commercializzati a Bronte. I campioni analizzati sono sei, cinque di questi sono di pistacchio tritato ed uno di pasta di pistacchio pura al 100%. Inoltre due campioni di pistacchio tritato sono di produzione propria (allo scopo di verificare con certezza il residuo di aflatossine nel pistacchio prodotto a Bronte), mentre i rimanenti quattro campioni sono stati acquistate da aziende operanti nel territorio di Bronte. Tali aziende, oltre al punto vendita di Bronte, hanno tutte un sito internet per la commercializzazione in Italia/Europa. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 81 Tesi di Laurea Loria Tino Figura 23 - Campioni sottoposti ad analisi Campione numero Tipo di prodotto Azienda 1 Pistacchio tritato 2 Pistacchio tritato 3 Pistacchio tritato 4 Pistacchio tritato Pistacchio tritato Produzione // propria (anno 2013) Produzione // propria (anno 2015) AZIENDA 1 Azienda con proprio marchio, che delega la produzione a terzi. AZIENDA 2 Bar, gelateria, pasticceria. AZIENDA 3 Azienda di produzione e lavorazione. AZIENDA 4 Azienda di produzione e lavorazione. 5 6 Pasta pura di pistacchio al 100% Tipologia azienda Indicazione sulla provenienza Prodotto nel territorio a marchio DOP Prodotto nel territorio a marchio DOP Prodotto nello stabilimento di Bronte Quantità Prezzo 2 Kg // 2 Kg // Confezione da 100 g 4,00 € Assente Confezione da 100 g Confezione da 100 g 6,00 € Vasetto da 100 g 4,00 € Prodotto nello stabilimento di Bronte Assente 4,50 € Tabella 14 - Tabella riepilogativa campioni Come riportato in tabella, il campione 1 e il campione 2 sono costituiti da pistacchio prodotto a Bronte in due anni di produzione differenti, 2013 e 2015. Il campione 1 dunque è stato conservato per 2 anni in un sacco di juta, esposto all’aria ma la riparo Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 82 Tesi di Laurea Loria Tino dalla luce del sole, umidità e fonti di calore. Questo per verificare l’efficienza del tradizionale metodo di conservazione. E’ importante notare le scarse o assenti informazioni sulla provenienza del prodotto. Il venditore del campione n°3, che riporta in etichetta “Prodotto nello stabilimento di Bronte…”, ha dichiarato sotto mia esplicita domanda che il prodotto è di importazione extra UE, questa informazione è assente nella confezione. 8.2 Dati sperimentali ottenuti Dai report cromatografici ottenuti si è proceduto al calcolo del risultato, il riepilogo dei dati ed il giudizio di conformità sono indicati nelle tabelle seguenti: AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AF TOTALI (µg/Kg) (µg/Kg) (µg/Kg) (µg/Kg) (µg/Kg) 1 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 2 < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ < LOQ 3 1,0 ± 0,3 < LOQ < LOQ < LOQ 1,0 4 2,4 ± 0,4 0,2 ± 0,2 1,0 ± 0,3 < LOQ 3,6 5 2,8 ± 0,4 < LOQ < LOQ < LOQ 2,8 6 2,4 ± 0,4 0,3 ± 0,2 0,5 ± 0,3 < LOQ 3,2 N.B. Valori corretti per il recupero LOQ Limite di quantificazione (vale 0,2 µg/Kg per il metodo applicato dal laboratorio) # Tabella 15 - Dati sperimentali ottenuti AF Totali LMR per AF GIUDIZIO DI (µg/Kg) Totali (µg/Kg) CONFORMITA’ 1 < LOQ CONFORME 2 < LOQ CONFORME < LOQ 3 1,0 1,0 CONFORME < 8,0 < 10,0 4 2,4 3,6 CONFORME 5 2,8 2,8 CONFORME 6 2,4 3,2 CONFORME LMR = Limite massimo del residuo come da Reg. (UE) 165/2010. LOQ = Limite di quantificazione (vale 0,2 µg/Kg per il metodo applicato dal laboratorio) # AFB1 (µg/Kg) < LOQ LMR per AFB1 (µg/Kg) Tabella 16 - Giudizio di conformità per i campioni Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 83 Tesi di Laurea Loria Tino Di seguito si riportano i cromatogrammi ottenuti per i sei campioni analizzati. Figura 24 - Cromatogrammi campioni Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 84 Tesi di Laurea Loria Tino 8.3 Analisi dei Risultati Tutti i campioni analizzati sono risultati conformi. Ma come si vede dai dati ottenuti, per i due campioni di produzione propria (C1 e C2) per i quali si ha l’assoluta certezza della proveniente, il residuo di aflatossine è minore del LOQ (0,2 μg/Kg). Invece per tutti e quattro i campioni acquistati sono stati rilevati livelli maggiori del LOQ. Nel 75 % dei casi, tre campioni su quattro (2 di pistacchio tritato e 1 di pasta pura al 100 % di pistacchio) sono stati quantificati livelli di contaminazione medi superiori a 2 μg/Kg per AFB1 e 3 μg/Kg per AF totali. Alla luce di quanti discusso, è plausibile la totale assenza di aflatossine nel pistacchio DOP di Bronte per: Clima sfavorevole allo sviluppo di Aspergillus Tecnica di produzione e trasformazione all’avanguardia Tecniche di stoccaggio del prodotto ottimali Dunque, seppur conformi, viene da pensare che i prodotti che presentano un residuo quantificabile di aflatossine siano stati mal prodotti, mal conservati o miscelati in parte o del tutto con pistacchio di importazione, che dai dati diffusi dal sistema RASFF risultano mediamente contaminati. C’è da aggiungere inoltre che se vigesse ancora il REG. (CE) 1881/2006, che fissava il LMR per AFB1 a 2 μg/Kg (modificato dal Reg. (UE) 165/2010 a 8 μg/Kg) questi 3 campioni in Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 85 Tesi di Laurea Loria Tino oggetto sarebbero risultati “non conformi” e dunque non commercializzabili. Ma come definito dagli esperti scientifici dell’ EFSA: “l’innalzamento da 4 μg/kg a 8 o a 10 μg/kg dei tenori massimi di aflatossine totali nelle mandorle, nelle nocciole e nei pistacchi avrebbe effetti modesti sulle stime di esposizione alimentare, sul rischio di tumori e sui margini di esposizione calcolati. Ma l’esposizione alle aflatossine da tutte le fonti dovrebbe essere al livello più basso ragionevolmente ottenibile, perché le aflatossine sono genotossiche e cancerogene. Questo riducendo l’esposizione alimentare alle aflatossine da fonti diverse da mandorle, nocciole e pistacchi, e riducendo il numero di prodotti alimentari altamente contaminati che arrivano sul mercato.” Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 86 Tesi di Laurea Loria Tino 9 CONCLUSIONI Il rischio sanitario collegato alle micotossine, e alle aflatossine in particolare, è universalmente riconosciuto. Le aflatossine, come discusso, sono epatotossiche, genotossiche e cancerogene. Dai dati diffusi da organismi internazionali e nazionali sui controlli effettuati, si evidenzia una diffusa contaminazione nei prodotti destinati all’alimentazione umana. A partire dal 1965, anno in cui sono stati definiti i limiti massimi per le aflatossine nelle arachidi, l’Europa ha preso provvedimenti legislativi relativi a livelli massimi ammissibili per le più importanti micotossine in molte matrici alimentari, oltre a provvedimenti relativi a metodi per il campionamento, requisiti per l’analisi, condizioni per l’importazione e a programmi coordinati per il controllo ufficiale. Oggi infatti si sono creati dei piani di monitoraggio efficaci e praticabili dediti non solo al controllo delle derrate prodotte nel nostro paese, ma soprattutto incentrati su un attento e qualificato controllo di prodotti provenienti da Paesi extra UE nella fase dell’ingresso nel nostro Paese. La trasparenza sull’etichetta però rimane un problema attuale in Europa. Dal REG. (UE) 1169/2011, sulle informazioni da riportare in etichetta, si legge: Art.26 “L’indicazione del paese d’origine o del luogo di provenienza è obbligatoria nel caso in cui l’omissione di tale indicazione possa indurre in errore il consumatore in merito al paese d’origine o al luogo di provenienza reali dell’alimento.” Ma questa si applica agli alimenti e non agli ingredienti, recentemente la Coldiretti ha dichiarato che circa un terzo della produzione complessiva dei prodotti agroalimentari venduti in Italia ed esportati con il marchio made in Italy contiene in realtà materie prime straniere. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 87 Tesi di Laurea Loria Tino Nulla peraltro vieta agli operatori di aggiungere su base volontaria informazioni ulteriori in merito all'origine dei prodotti e/o delle materie prime. Per quanto riguarda i prodotti al pistacchio acquistati, si evidenziano informazioni non chiare sulla provenienza della materia prima e ciò induce il consumatore a pensare che l’origine sia uguale al luogo di produzione. Questo è a sfavore dei prodotti di eccellenza del nostro paese, e nel caso del pistacchio di DOP di Bronte, prodotti che sono assolutamente privi di residui di micotossine come emerso dal presente lavoro. E’ dunque opportuno concludere che la sicurezza alimentare e la trasparenza sulle etichette è un obbiettivo comune che può essere raggiunto con impegno, responsabilità e rispetto delle normative da parte di tutti gli operatori interessati. Questo per impedire che eventuali falle possano provocare danni con gravi ripercussioni sulle filiere coinvolte e soprattutto sulla fiducia dei consumatori nel sistema europeo di tutela. Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 88 Tesi di Laurea Loria Tino 10 ALLEGATI Allegato 1 – Notifiche RASFF anno 2014 relativa alle aflatossine nel pistacchio in guscio e sgusciato importato in UE # Data Classificazione Notificata da Provenienza Conc. AFB1 Conc. AF (µg/kg) tot (µg/kg) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 20/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 295,8 295,8 17/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Bulgaria Iran 289,1 313,2 29/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Slovakia Iran 280,2 310,7 01/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Bulgaria Iran 267,0 282,0 05/08/2014 Notifica di allarme Italy Iran 261,0 282,0 25/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 228,5 233,2 15/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 163,0 176,0 14/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Lithuania Iran 146,0 155,0 28/08/2014 Notifica di allarme Slovakia Iran 141,5 155,4 23/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 119,0 253,0 28/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Turchia 96,4 104,7 12/09/2014 notifica di respingimento alla frontiera Greece Iran 93,8 24/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 86,4 93,2 22/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 84,5 93,9 18/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 84,0 93,0 15/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 76,7 87,0 02/04/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 71,6 78,0 08/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Bulgaria Iran 71,6 80,6 23/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 70,4 79,5 18/06/2014 notifica di respingimento alla frontiera Cyprus Iran 67,3 70,7 04/07/2014 Notifica di allarme Germany Stati Uniti 62,1 66,9 08/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 61,8 67,6 12/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 60,5 68,0 15/09/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 57,5 21/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Netherlands Turchia 55,0 25,0 17/11/2014 notifica di respingimento alla frontiera Lithuania Iran 54,0 56,0 23/01/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 51,0 57,0 13/01/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 50,0 53,0 27/02/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Siria 49,4 52,9 19/09/2014 notifica di respingimento alla frontiera France Iran 46,0 50,0 18/02/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 43,8 09/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Lithuania Iran 43,0 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte 48,0 pagina 89 Tesi di Laurea Loria Tino # Data Classificazione Notificata da Provenienza Conc. AFB1 Conc. AF (µg/kg) tot (µg/kg) 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 21/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 41,9 20/06/2014 Notifica di allarme Netherlands Stati Uniti 40,0 03/09/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Turchia 39,1 45,3 28/10/2014 Notifica di allarme Netherlands Stati Uniti 38,0 42,0 17/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 37,8 25/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 33,4 36,3 04/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Afghanistan 32,0 40,0 11/08/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 31,7 24/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Afghanistan 31,6 33,9 23/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 31,0 34,6 20/06/2014 Notifica di allarme Netherlands Iran 31,0 34,0 14/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Lithuania Iran 30,0 14/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 29,8 14/04/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 28,4 31,7 29/05/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 27,7 30,0 20/06/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Siria 27,6 30,9 10/01/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 27,6 41,6 02/04/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 27,0 31,9 07/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Turchia 26,4 29,8 05/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Turchia 25,1 27,9 18/06/2014 notifica di respingimento alla frontiera United Kingdom Stati Uniti 25,0 27,8 17/01/2014 notifica di respingimento alla frontiera United Kingdom Turchia 24,2 25,9 12/11/2014 notifica di respingimento alla frontiera Spain Iran 24,0 05/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 23,9 26,0 04/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 23,8 25,9 09/04/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 23,4 24,2 22/05/2014 Notifica di allarme Germany Turchia 23,2 25,9 29/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 23,0 25,0 27/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 22,6 25,0 27/02/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 22,0 25,0 10/11/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 21,6 20/06/2014 notifica di informazione per attenzione Netherlands Stati Uniti 21,0 21,0 29/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Poland Stati Uniti 20,9 23,2 25/07/2014 notifica di respingimento alla frontiera United Kingdom Stati Uniti 20,5 24,0 28/02/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 18,9 20,6 11/03/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 18,4 18,4 11/08/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 17,5 25/03/2014 Notifica di allarme Slovakia Iran 17,3 21,2 13/01/2014 notifica di respingimento alla frontiera France Turchia 16,8 16,8 13/05/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Siria 16,7 32,3 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte 46,6 pagina 90 Tesi di Laurea Loria Tino # Data Classificazione Notificata da Provenienza Conc. AFB1 Conc. AF (µg/kg) tot (µg/kg) 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 01/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Bulgaria Iran 16,0 02/12/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Turchia 16,0 27/08/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 14,8 26/05/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 14,4 12/12/2014 notifica di informazione per follow-up Belgium Stati Uniti 14,0 19/09/2014 notifica di respingimento alla frontiera France Iran 13,7 14,6 11/09/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 13,1 14,8 10/09/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 12,7 14,1 01/04/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 12,3 14,0 15/10/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 12,1 13,5 21/05/2014 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 11,4 14,5 19/11/2014 notifica di respingimento alla frontiera Poland Turchia 11,3 07/04/2014 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 10,1 11,7 19/02/2014 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Turchia 4,3 26,0 17,0 16,0 Allegato 2 - Notifiche RASFF periodo Gennaio-Giugno 2015 relative alle aflatossine nel pistacchio in guscio e sgusciato importato in UE # Data Classificazione Notificata da Provenienza Conc. AFB1 Conc. AF (µg/kg) tot (µg/kg) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 06/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Spain Iran 796,0 862,0 09/01/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Turchia 545,0 559,0 03/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 350,0 390,0 11/02/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 295,5 21/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Netherlands Stati Uniti 220,0 260,0 07/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 195,0 215,0 27/02/2015 Notifica di allarme Netherlands Iran 190,0 210,0 26/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Greece Iran 170,7 186,6 07/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Spain Turchia 170,0 185,0 05/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 153,5 08/05/2015 Notifica di allarme Netherlands Iran 140,0 160,0 21/05/2015 notifica di informazione per attenzione Luxembourg Stati Uniti 136,0 144,0 16/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Romania Iran 135,4 187,5 17/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 126,0 145,0 21/01/2015 notifica di respingimento alla frontiera Bulgaria Iran 118,5 128,0 07/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 111,0 120,0 30/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 103,0 119,0 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 91 Tesi di Laurea Loria Tino # Data Classificazione Notificata da Provenienza Conc. AFB1 Conc. AF (µg/kg) tot (µg/kg) 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 04/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Stati Uniti 96,9 152,0 17/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 95,7 113,0 20/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera France Turchia 90,0 100,0 17/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 76,2 83,4 17/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 75,0 88,2 03/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera France Stati Uniti 71,0 80,0 12/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Spain Iran 67,0 30/01/2015 notifica di respingimento alla frontiera Greece Iran 64,2 72,7 22/04/2015 Notifica di allarme Italy Iran 51,3 56,3 29/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Stati Uniti 47,6 53,3 17/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 47,5 47,5 28/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 43,4 47,2 11/02/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 38,9 42,3 04/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Stati Uniti 35,0 36,6 19/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 33,8 20/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 33,7 24/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 32,2 22/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 32,0 36,0 13/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Iran 30,6 32,4 13/04/2015 notifica di informazione per attenzione Belgium Giordania 29,9 39,9 11/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Turchia 29,0 33,0 30/01/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 28,6 07/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 28,1 28,1 20/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera France Turchia 28,0 29,0 20/03/2015 notifica di informazione per attenzione Belgium Afghanistan 27,9 31,5 29/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 27,1 23/01/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 26,3 27,4 23/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Bulgaria Iran 25,2 26,9 03/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Spain Iran 24,0 13/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Stati Uniti 24,0 26,3 11/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Stati Uniti 22,7 24,3 07/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Spain Iran 22,5 25,0 14/01/2015 notifica di respingimento alla frontiera Netherlands Turchia 22,0 27,0 30/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera United Kingdom Iran 21,8 26,1 19/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 21,5 23,6 08/01/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 20,0 25,1 21/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Netherlands Stati Uniti 20,0 20,0 20/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Turchia 19,4 21,7 02/03/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 19,2 14/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Bulgaria Turchia 18,9 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte 38,0 22,3 pagina 92 Tesi di Laurea Loria Tino # Data Classificazione Notificata da Provenienza Conc. AFB1 Conc. AF (µg/kg) tot (µg/kg) 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 11/05/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Iran 18,7 20/02/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 17,1 17,1 25/02/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Iran 16,7 19,1 09/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Stati Uniti 16,5 17,4 17/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Italy Afghanistan 16,4 18,4 20/04/2015 notifica di respingimento alla frontiera Spain Iran 15,9 17,6 29/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Belgium Stati Uniti 15,5 16,8 03/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera France Stati Uniti 11,4 53,0 05/01/2015 notifica di respingimento alla frontiera Bulgaria Turchia 10,3 26,0 24/06/2015 notifica di respingimento alla frontiera Germany Turchia 9,9 Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 93 Tesi di Laurea Loria Tino 11 RIFERIMENTI 11.1 Sitografia S 1. S 2. S 3. S 4. S 5. S 6. S 7. S 8. S 9. S 10. S 11. https://www.google.it https://it.wikipedia.org https://en.wikipedia.org http://www.agraria.org http://www.istat.it http://www.americanpistachios.org/ http://www.fao.org/ http://www.dosicily.com http://www.salute.gov.it/ http://ec.europa.eu/food/safety/rasff/index_en.htm (RAFSS) http://madb.europa.eu/madb/statistical_form.htm (Import/export di merci UE) 11.2 Bibliografia B 1. LA FILIERA DEL PISTACCHIO IN SICILIA (CORERAS 2007) B 2. COUNCIL FOR AGRICOLTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY (CAST 2003 ) - “Mycotoxins: Risks in Plant, Animal and Human Systems.” Ames/IO USA. B 3. TOSSICOLOGIA II EDIZIONE (PICCIN 2008) – Galli, Corsini, Marinovich B 4. BOTANICA MEDICA, FARMACEUTICA E VETERINARIA (ZANICHELLI - 1993) - A.Ceruti, M. Ceruti, G. Vigolo B 5. Aspergillus flavus and Turkey X Disease. Toxic metabolites of Aspergillus flavus (NATURE - 1962) - Nesbitt, B.F., O’Kelly, J., Sargeant, K., Sheridan, A. B 6. Rev. Trav. Chim (1963) van Dorp, D.A., Van Der Zijden, A.S.N., Beerthuis, R.K., Spaareboom, S.,Ord, W.,O., De Jong, K., Kenuing, R. B 7. The Merck Index, 13 th ed. (Merck 2001) O’Neil, M.J., Smith, A., Heckelman. B 8. Isolation and structure of aflatoxins M1 and M2. (Tetrahedron Lett. 1966) - Holzapfel, C.W., Steyn, P.S., Purchase, I.F.H. B 9. Le micotossine nelle piante e nelle derrate alimentari (L’Italia Agricola - 1988) Bottalico, A. B 10. Mycotoxins and animal foods (Boca Raton – 1991) Wyatt, R.D., Smith, J.E., Henderson, R.S. B 11. Aflatoxin and cyclopiazonic acid production by a sclerotium producing Aspergillus tamarii strani (Appl. Environ. Microbiol – 1996) - Goto, T., Wicklow, D.T., Ito, Y. B 12. Cryptic speciation and recombination in the aflatoxin-producing fungus Aspergillus flavus. ( Proc. Natl. Acad. USA – 1998) - Geiser, D.M., Pitt, J.I., Taylor, J.W. B 13. La chimica degli alimenti (Zanichelli - 2005) - Tom Coultate. B 14. Aflatoxin contamination in pistachio nuts: A farm to storage study (ELSEVIER - 2012) Georgiadou, A. Dimou, S. Yanniotis Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 94 Tesi di Laurea Loria Tino B 15. ANGELO VISCONTI - Sviluppi diagnostici nell’analisi delle micotossine - IV Congresso Nazionale sulle Micotossine Roma, Giugno 2012 B 16. Tossicologia Veterinareia - Aflatossine – (Ambrosiana 1994) Pompa G. Beretta C. 11.3 Normative N 1. REG. 21/2010/CE del 12 gennaio 2010 N 2. SANCO/1208/2005 rev. 1 - Guidance document for competent authorities for the control of compliance with EU legislation on aflatoxins N 3. REG. 882/2004/CE - Controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali N 4. DIR 92/59/CEE - Relativa alla sicurezza generale dei prodotti N 5. REG. 178/2002/CE - che stabilisce i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare, istituisce l'Autorità europea per la sicurezza alimentare e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare N 6. REG. 16/2011/UE - recante disposizioni di applicazione relative al sistema di allarme rapido per gli alimenti ed i mangimi N 7. REG. 1881/2006/CE - che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari N 8. REG. 165/2010/UE - modifica, per quanto riguarda le aflatossine, del regolamento (CE) n. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari N 9. l’EFSA Journal n°446 (1-127) del 2007 - OPINION OF THE SCIENTIFIC PANEL ON CONTAMINANTS IN THE FOOD CHAIN ON A REQUEST FROM THE COMMISSION RELATED TO THE POTENTIAL INCREASE OF CONSUMER HEALTH RISK BY A POSSIBLE INCREASE OF THE EXISTING MAXIMUM LEVELS FOR AFLATOXINS IN ALMONDS, HAZELNUTS AND PISTACHIOS AND DERIVED PRODUCTS. N 10. UNI EN 12955:1999 - “Determinazione di aflatossina B1 e della somma di aflatossine B1, B2, G1 e G2 nei cereali, frutti in guscio e prodotti derivati – Metodo per cromatografia liquida ad alta risoluzione con derivatizzazione post-colonna e purificazione in colonna di immuno affinità. N 11. UNI EN ISO 16050:2011 – “Prodotti alimentari - Determinazione di aflatossina B1 e del contenuto totale di aflatossine B1, B2, G1 e G2 nei cereali, nelle noci e nei prodotti derivati - Metodo per cromatografia liquida ad alta risoluzione Le Aflatossine nel pistacchio commercializzato a Bronte pagina 95