Phadebact® Salmonella Test

53-1146-02,May-12
Phadebact®
Salmonella Test
Istruzioni per l´Uso
MKL Diagnostics AB
Kung Hans Väg 3
SE-192 68 Sollentuna
Sweden
Stafilococchi ricoperti di anticorpi
Co-agglutinazione
Microorganismo con gli
antígeni corrispondenti
UTILIZZO
Phadebact Salmonella Test è stato messo a punto per l’identificazione dei seguenti gruppi sierologici di Salmonella
O:2, O:4, O:7, O:8, O:9 e O:3 (precedentemente A, B, C1, C2-3, D e E).
SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST
I membri del gruppo Enterobacteriaceae sono responsabili della maggior parte delle infezioni intestinali in animali e in
uomini in tutto il mondo. Anche se molti dei membri Enterobacteriaceae sono stati messi in connessione con la diarrèa
come una delle sue cause, soltanto i membri delle famiglie generali Escherchia, Salmonella, Shighella e Yersinia sono
stati chiaramente riconosciuti come patogeni enterici (1).
Le infezioni umane da Salmonella possono causare vari sintomi clinici e possono coinvolgere sia siti intestinali che
extraintestinali (2). La sindrome più comune è quella di enterocolite semplice nella quale il paziente tipico, dopo un
periodo di incubazione che va da 4 a 48 ore, è affetto da nausea, vomito, crampi, diarrèa e febbre. Dopo la guarigione,
alcuni pazienti possono continuare ad espellere organismi per settimane o mesi, mentre è insolita la permanenza di
tali organismi per un periodo di più anni.
La salmonellosi è una malattia primaria veicolata dal cibo che si verifica più frequentemente in estate. Ogni anno più
di 40.000 (1987) isolati umani sono segnalati negli Stati Uniti. Poichè questi isolati secondo le stime rappresentano
approssimativamente 1% delle persone clinicamente malate – si stima che annualmente negli Stati Uniti possono
verificarsi più di 4 milioni di casi di salmonellosi sintomatica (3), (4).
L’identificazione di Salmonella è importante per le implicazioni sia cliniche che epidemiologiche. I batteri appartenenti
alla famiglia Enterobacteriaceae sono identificati principalmente tramite test per reazioni biochimiche. La conferma del
gruppo sierologico degli isolati di Salmonella è basata sul test dell’antigene-O somatico che viene eseguito dalla maggior
parte dei laboratori clinici. Un test sierologico completo, includendo l’identificazione per tipi (basata su antigeni flagellari
o capsulari) può essere ottenuto tramite l’invio dell’isolato ad un laboratorio di riferimento. Delle infezioni umane da
salmonella identificate, circa il 98% fanno parte dei gruppi sierologici O:2, 4, 7, 8, 9, e 3 (5). Soltanto 10, dei più di 1800
sierotipi di Salmonella segnalati, sono responsabili di più del 70% di questi isolati umani (6).
Se si utilizza il convenzionale antisiero policlonale adsorbito bisogna prestare un’attenzione particolare all’identificazione
biochimica degli isolati a causa delle reazione sierologiche incrociate con altri Enterobacteriaceae.
Phadebact Salmonella Test si basa sulla tecnica di co-agglutinazione.
Antigeni del gruppo sierologico O, di- o trisaccaridi sono stati sintetizzati e utilizzati come immunogeni per la produzione
di antisieri altamente specifici rispetto ad un gruppo sierologico, evitando in questa maniera l’adsorpsione e permettendo
una identificazione affidabile e rapida. Si richiede soltanto la strumentazione indispensabile di laboratorio, mentre non
è necessaria nessuna formazione speciale del personale.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Phadebact Salmonella Test è un test di co-agglutinazione contenente un reagente Salmonella per ognuno dei sei gruppi
sierologici O:2, 4, 7, 8, 9 e 3. I reageni sono composti di anticorpi di coniglio altamente specifici legati alla proteina
A di stafilococchi non-vitali (7). Quando una goccia di sospensione contenente qualsiasi dei gruppi sierologici sopra
citati viene mescolata con il corrispondente reagente, i determinanti specifici dell’antigene-O della parete cellulare
legeranno agli anticorpi sulla superficie dello Stafilococco. In questo modo si forma una grata di co-agglutinazione
visibile ad occhio nudo.
REAGENTI
Ogni confezione Phadebact Salmonella Test contiene 2 mL di reagenti sufficiente per 50 rilevazioni. I reagenti sono
colorati blu (blu Metilene) per facilitare l’interpretazione dei risultati.
Reactive ingredients
•
Reagente Salmonella gruppo O:2
Anticorpi specifici di coniglio, legati a stafilococchi non vitali, 1 fiala.
•
Reagente Salmonella gruppo O:4
Anticorpi specifici di coniglio, legati a stafilococchi non vitali, 1 fiala.
•
Reagente Salmonella gruppo O:7
Anticorpi specifici di coniglio, legati a stafilococchi non vitali, 1 fiala.
•
Reagente Salmonella gruppo O:8
Anticorpi specifici di coniglio, legati a stafilococchi non vitali, 1 fiala.
•
Reagente Salmonella gruppo O:9
Anticorpi specifici di coniglio, legati a stafilococchi non vitali, 1 fiala.
•
Reagente Salmonella gruppo O:3
Anticorpi specifici di coniglio, legati a stafilococchi non vitali, 1 fiala.
Altri componenti
•
Contagocce
•
Slides usa e getta
•
Istruzioni per l’Uso
Precauzioni
Per un uso diagnostico in vitro.
Attenzione! I controlli contengono Sodio azide (NaN3) come conservante. Il Sodio azide può reagire con il piombo ed
il rame presenti nell’impianto idraulico formando metalli azidi altamente espolosivi. Pertanto, se si utilizza l’impianto
idraulico per disfarsi dei controlli, far scorrere grande quantità di acqua per prevenire accumulo di azide. Fare riferimento
alle procedure di decontaminazione così come illustrato da CDC.
Preparazione dei reagenti
I reagenti sono PRONTI PER L’USO.
Modalità di conservazione e scadenza
La data di scadenza è riportata sull’etichetta esterna e sulle etichette delle fiale. Si raccomanda di conservare il kit ad
una temperatura di 2-8°C. I reagenti devono essere protetti dal congelamento.
RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI
Si prega di riferirsi ad un libro di testo standard di microbiologia per quanto riguarda l’informazione sulla preparazione
delle colture primarie. Dopo l’inoculazione, il terreno deve essere incubato a 35-37°C per 18-24 ore (8). Se la piastra
primaria contiene un numero sufficiente di colonie sospette di essere Salmonella la co-agglutinazione può essere
eseguita direttamente. In caso contrario, trasfirire le colonie di apparenza tipica in un angolo di terreno nutriente e
incubare per altre 18-24 ore.
Ci sono tanti terreni adeguati con diverse selettività per la coltivazione della piastra primaria i quali permettono la crescita
di certi batteri enterici patologici e inibiscono la crescità dei batteri Gram-positivi e alcuni batteri Gram-negativi (8). Questi
terreni permettono anche la differenziazione iniziale dei batteri attraverso la morfologia delle colonie (Tabella 1). Colonie
sospette di Salmonella possono quindi essere testate con il sistema di rilevazione Phadebact® Salmonella Test:
•
Preparare una sospensione pesante di batteri in 500μl di soluzione salina o PBS (phosphate buffered saline).
•
Goccie di questa suspensione vengono usati per il test.
Tabella 1.
Agar
Deoxycholate
citrate
Agar
Bismuth
Sulfite
MacConkey
Agar
Agar
XLD
convesse,
senza colore,
2-3 mm
rosse, liscie,
1-2 mm
senza colore,
traslucide,
2-3 mm
Salmonella
convesse,
senza colore,
2-3 mm
rosse, centro
nero,
1-2 mm
centro nero su
colonie rosse
centro nero,
bordo traslucido
aureola intono
alla colonia,
lucentezza
metallico
(48 ore)
senza colore,
traslucide,
1-2 mm
S.typhi
convesse,
senza colore,
2-3 mm
rosse, liscie
senza colore
0,5-1 mm con
lucentezza ero,
spesso con un
punto grigio al
centro
colonie nere
rotonde
(48 ore)
senza colore,
traslucide,
1-2mm
rosse,
2-3 mm
colonie opache,
gialle
poche colonie
rosa ombelicate,
1-2 mm
-
-
-
-
Organismo
Shigella
E. coli
Y. enterocolitica
senza colore
o rosa chiare,
1-2 mm
(48 ore)
Agar
SS
senza colore,
traslucide,
1-2 mm
-
poche piccole
colonie rosa
senza colore,
traslucide,
0,5 mm (48 ore)
Agar
Verde
brillante
-
rosa-bianche,
opache,
1-3 mm
-
-
-
Protocollo del test
Nota! Sospendere i reagenti interamente tramite agitazione o rotazione vorticale.
Mettere una goccia di ogni reagente
dei gruppi Salmonella sul proprio
ovale marcato sulla slide. Fig. 1.
Aggiungere una goccia della
sospensione batterica ad ogni
goccia di reagente sulla slide.
Fig 2.
Fig. 2
Fig. 1
Mescolare le gocce interamente ma
gentilmente con un ochiello usa e
getta. Usare un nuovo ochiello per
ciascun reagente. Fig. 3.
Fig. 4
Fig. 3
Fare oscillare la slide e leggere i risultati
entro un minuto. Fig 4.
Stabilità della miscela finale di reazione
La reazione di co-agglutinazione è stabile, ma una buona pratica di laboratorio suggerisce che il risultato va letto entro 1
minuto mentre la miscela è ancora umida (notare che c’è il rischio che il seccarsi dei reagenti può essere misinterpretato
come una reazione positiva).
Calibrazione
Nessuna calibrazione è necessaria.
Controllo di qualità
Controllo positivo
Come controllo deve essere utilizzata una famiglia Salmonella identificata in laboratorio per ciascuno dei gruppi
sierologici O:2, 4, 7, 8, 9 e 3. Nella procedura del test la famiglia di controllo è trattata nella stessa maniera dei batteri
sconosciuti.
Controllo negativo
L’uso simultaneo di tutti e sei i reagenti, quando si testa un organismo sconosciuto, costituisce un controllo negativo
implicito.
Aspetto della reazione
Nessuna reazione
Reazione positiva
RISULTATI
Risultato positivo
L’identità del campione come Salmonella dei gruppi O:2, 4, 7, 8, 9 o 3 viene confermata se in uno dei sei reagenti
viene osservato un precipitato blu, la co-agglutinazione, e se nessuna reazione o una reazione debole si verifica negli
altri cinque reagenti.
Risultato negativo
Una reazione molto debole o nessuna reazione in tutti e sei i reagenti costituisce un risultato negativo. Un risultato
negativo suggerisce fortemente che i batteri testati non sono Salmonella dei gruppi sierologici O:2, 4, 7, 8, 9 o 3.
LIMITI DELLA PROCEDURA
•
Le famiglie O:11 (precedentemente F) e O:54 producevano agglutinazione nel reagente O:3. La reazione O:54
è reciproca (cioè assorbibile) e documentata nella litteratura. La reattività O:11 è relativamente debole ma
caratteristica.
•
Come in tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non deve essere basata sul risultato di un unico test,
ma deve essere fatta dal medico soltanto dopo che i risultati clinici e laboratorici sono stati validati.
•
L’alta sensibilità del test non esclude la possibilità di risultati falsamente negativi.
CARATTERISTICHE DI RENDIMENTO
Specificità e sensibilità
Un totale di 826 campioni consistenti sia di isolati clinici che di famiglie batteriche di riferimento sono stati analizzati
(9).
L’identità degli isolati clinici è stata stabilita ad un livello di genere/specie tramite test biochimici e sierologici
convenzionali.
Il rendimento complessivo del Phadebact Salmonella Test è stato il seguente:
Gruppo Salmonella
Isolati fecali
Numero positive in CoA
O:2
O:4
O:7
O:8
O:9
O:2
18
18
0
0
0
0
0
O:4
118
0
118
0
0
0
0
O:3
O:7
64
0
0
64
0
0
0
O:8
70
0
0
0
70
0
0
O:9
77
0
0
0
0
77
0
O:3
47
0
0
0
0
0
47
O:11
3
0
0
0
0
0
3
O:13-O:50
34
0
0
0
0
0
0
O:51-O:53
3
0
0
0
0
0
0
O:54
1
0
0
0
0
0
1
O:55-O:67
10
0
0
0
0
0
0
5
0
0
0
0
0
0
E. coli
200
0
0
0
0
0
0
Altri isolati fecali1)
176
0
0
0
0
0
0
Altri non O:2,4,7,8,9,3
1)
No
di familie
Includendo Citrobacter sp., Morganella sp., Proteus sp., Serratia sp., Shigella sp.
In totale 394 isolati di Salmonella O:2, 4, 7, 8, 9 e 3 and 432 altri isolati sono stati testati con una sensibilità del 100%
(394/394) ed una specificità del 99.1% (428/432).
GARANZIA
I dati di rendimento qui presentati sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi cambiamento o modifica
nelle procedure non raccomandato da MKL Diagnostics AB può affettare i risultati. In tal caso, MKL Diagnostics AB disconosce tutte le
garanzie, espresse, implicite o statuarie, incluse le garanzie implicate nella commerciabilità e nella convenienza per
l’uso. MKL Diagnostics AB, e i sui rivenditori autorizzati, in tali casi non saranno considerati responsabili per qualsiasi danno
diretto, indiretto o consequenziale.
Riferimenti:
1.
Manual of Clinical Microbiology. ASM, 1985 4th edition, p. 264.
2.
Parket M T: Principles of bacteriology, virology and immunology. Vol. 2, 7th edition, 1984.
3.
Rennels M B, Levine M M: Classical bacterial diarrhoea; perspectives and update - Salmonella, Shigella,
Escherichia coli, Aeromonas and Pleisiomonas. Pediatric Infectious Disease, Vol. 5, No. 1, p.92, 1986.
4.
Centers for Disease Control: Human Salmonella isolates: United States, 1983. MMWR 39: 693-695, 1984.
5.
Saphra I, Winter J W: An Evaluation of Human Infections Identified at the New York Salmonella Center. The
New England Journal of Medicine, Vol. 256, No. 24, p. 1128-1134, 1987.
6.
Human Salmonella Isolates - United States 1982. Journal of American Medical Association. Vol, 250, No. 22, p.
3030, 1983.
7.
Christensen P, Kahlmeter G, Johnsson S, Kronvall G: New method for the serological grouping of streptococci
with specific antibodies adsorbed to Protein A containing staphylococci. Infect. Immun. 7 (1973), p. 881-885.
8.
Manual for Laboratory Investigations of Acute Enteric Infections. World Health Organization, CDD/83.3.
9.
Data on file, MKL Diagnostics AB.
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