Salmonella Agglutinating Sera [IT]

Salmonella
Agglutinating Sera IT
1. FINALITÀ D’USO
I sieri agglutinanti per Salmonella sono concepiti per i test di
agglutinazione su vetrino o in provetta per l’identificazione
sierologica delle colture di Salmonella a scopo epidemiologico
e diagnostico. I sieri appropriati possono anche essere utilizzati
come antisieri di controllo per le Stained Salmonella Suspensions8
e gli antisieri H di Salmonella possono essere utilizzati nelle
procedure di inversione di fase1.
2. Riassunto e spiegazione del test
Secondo la classificazione di Kauffmann-White, il genere
Salmonella è classificato in sierotipi in base alle combinazioni
di antigeni somatici (O) e flagellari (H) che sono identificati
mediante test di agglutinazione2. A causa delle numerose relazioni
antigeniche esistenti tra Salmonella e i microrganismi di altri
generi, le procedure di identificazione devono includere test
colturali e biochimici, oltre a quelli sierologici. I sieri agglutinanti
sono concepiti essenzialmente er l’uso come test di conferma,
ma possono essere utilizzati, osservando le dovute precauzioni,
anche come test di screening7.
I sieri vengono adsorbiti in modo da rimuovere le agglutinine
di altri antigeni di Salmonella e l’agglutinina “paracolon” α. I
Salmonella Somatic Agglutinating Sera (serie ZC) sono destinati
all’identificazione degli antigeni O nei test di agglutinazione su
vetrino, ma possono essere utilizzati anche nei test di conferma
in provetta.
I Salmonella Flagellar Agglutinating Sera (serie ZD) sono concepiti
per l’identificazione degli antigeni H. I sieri polivalenti devono
essere utilizzati nei test di agglutinazione su vetrino. I sieri
monovalenti possono essere utilizzati anche in test preliminari
su vetrino, ma i risultati così ottenuti devono essere confermati
mediante agglutinazione in provetta. Ad eccezione del fattore
i, gli antigeni H di fase 1 che ricorrono con maggiore frequenza
possono essere identificati mediante test di agglutinazione su
vetrino utilizzando i Rapid Diagnostic Sera (tabella 1).
Tabella 1
Tabella 2
Schema tipico di reazioni di agglutinazione in provettadi tre
antigeni H correlati e antisieri corrispondenti
Antisiero
G
fg
gm
gp
fg
1:800
1:800
<1:200
<1:200
gm
1:800
<1:200
1:800
<1:200
gp
1:800
<1:200
<1:200
1:800
3. PRINCIPIO DEL METODO
I test sierologici sono basati sul principio che gli anticorpi presenti
nel siero, prodotti in seguito all’esposizione ad antigeni batterici,
agglutinano con i batteri che possiedono gli antigeni omologhi.
4. REAGENTI
4.1. Componenti del kit
Antigene
Ogni flacone, dotato di dispensatore e
contagocce, contiene 2 ml di liquido ed è
fornito pronto per l’uso.
Durante la conservazione, alcuni sieri
possono presentarsi leggermente torbidi,
il che non indica necessariamente
deterioramento e solitamente non
interferisce con i risultati. Prima dell’uso,
tali sieri possono essere chiarificati
mediante centrifugazione o filtrazione su
membrana (0,45 µm). Un aspetto molto
torbido è indice di contaminazione, per cui
tali sieri devono essere eliminati.
Siero 1
+
+
+
–
–
–
+
Siero 2
+
–
+
–
+
+
–
Siero 3
–
+
+
+
+
–
–
Per i sierotipi H aventi determinanti comuni (per esempio, il
gruppo G: fg, gm, gp, gq, gst), i sieri polivalenti designati da
lettera maiuscola devono reagire all’incirca allo stesso titolo
con i microrganismi che possiedono questo fattore nei test
di agglutinazione in provetta. I sieri contrassegnati da lettera
minuscola devono reagire con microrganismi che possiedono
antigeni omologhi a una diluizione maggiore di almeno 2 provette
rispetto a quella dei microrganismi che possiedono antigeni
eterologhi con fattori comuni (per un esempio, fare riferimento
alla tabella 2).
5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI DI IMPIEGO
Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
Esclusivamente per uso clinico.
Per informazioni su componenti potenzialmente pericolosi, fare
riferimento alle schede di sicurezza fornite dal produttore e alle
informazioni riportate sulle etichette dei prodotti.
5.1. Precauzioni di sicurezza
5.1.1
Trattare tutti i batteri in accordo con le norme vigenti
in materia.
5.1.2
Dopo l’uso il materiale non monouso deve essere
sterilizzato con un’adeguata procedura; il metodo
ottimale è la sterilizzazione in autoclave per almeno
15 minuti a 121°C. Il materiale monouso deve essere
sterilizzato in autoclave o incenerito.
Test di agglutinazione su vetrino
Fase 1
Dispensare due gocce distinte (40 µl ciascuna) di
soluzione salina allo 0,85% su un vetrino. Emulsionare
con un’ansa aliquote della coltura in esame in ciascuna
goccia di soluzione salina allo 0,85% fino a ottenere una
sospensione omogenea piuttosto densa.
5.1.5
Gli antisieri somatici di Salmonella contengono
fenolo allo 0,5% e gli antisieri flagellari di Salmonella
contengono sodio azide allo 0,1%. Sebbene la
concentrazione sia bassa, è noto che entrambi sono
tossici per ingestione e contatto con la pelle. Evitare
di ingerire i reagenti. Se uno di questi reagenti dovesse
venire a contatto con la pelle o gli occhi, lavare
immediatamente le aree interessate sciacquando
abbondantemente con acqua.
Fase 2
Aggiungere come controllo una goccia (40 µl) di soluzione
salina allo 0,85% a una sospensione e miscelare.
Aggiungere una goccia (40 µl) di antisiero intero (non
diluito) all’altra sospensione e miscelare.
Fase 3
Agitare delicatamente con movimento oscillatorio il
vetrino per un minuto e osservare l’agglutinazione
utilizzando una fonte di luce indiretta su fondo scuro.
Eliminare il vetrino utilizzato secondo le norme di
disinfezione e smaltimento in vigore.
5.1.6
10.Centrifuga.
11. Soluzione salina contenente formalina allo 0,5% oppure brodo
con formalina.
12. Acido tioglicolico allo 0,2%.
7.1. Procedura del test
Non pipettare con la bocca. Durante il trattamento dei
campioni e l’esecuzione del dosaggio utilizzare guanti
monouso e una protezione per gli occhi. Al termine,
lavarsi accuratamente le mani.
Fare riferimento anche alla sezione Avvertenze e precauzioni
di impiego
Affinché mantengano la loro attività almeno fino alla data di
scadenza indicata sull’etichetta del flacone, i sieri devono essere
conservati a 2-8°C.
Gli antisieri somatici di Salmonella sono
conservati in soluzione di fenolo allo 0,5%
e gli antisieri flagellari di Salmonella in
soluzione di sodio azide allo 0,1%. I sieri
sono prodotti nel coniglio.
Gli schizzi di materiali potenzialmente infettivi devono
essere immediatamente asciugati con carta assorbente
e l’area interessata deve essere decontaminata con
un disinfettante battericida d’uso comune oppure con
alcol al 70%. I materiali utilizzati per asciugare gli schizzi,
inclusi i guanti, devono essere smaltiti seguendo la
stessa procedura prevista per i rifiuti a rischio biologico.
5.1.4
Fare riferimento alle informazioni riportate sulla Confezione.
4.2. Descrizione, preparazione per l’uso e raccomandazioni
per la conservazione
Schema delle reazioni di agglutinazione dei Rapid Diagnostic
Sera e sierotipi H corrispondenti
Antigene
b
d
E
G
k
L
r
5.1.3
In accordo con le norme di buona pratica di laboratorio,
si raccomanda vivamente di trattare i campioni e i
reagenti come potenzialmente infettivi e di prendere
tutte le necessarie precauzioni.
5.2. Precauzioni analitiche
5.2.1
Non usare gli antisieri oltre la data di scadenza indicata.
Evitare la contaminazione microbica degli antisieri
poiché potrebbe portare a risultati errati e ridurre la
validità del prodotto.
5.2.2
Non modificare la procedura del test, i tempi di
incubazione o le temperature. Non diluire.
5.2.3
Dopo l’uso, riportare i sieri alle temperature di
conservazione raccomandate.
6. Prelievo, trasporto e conservazione dei
campioni
Si raccomanda l’uso di colture fresche cresciute su terreni non
selettivi, per esempio agar nutriente.
Per maggiori informazioni sul prelievo e il trattamento del
campione, si consiglia di consultare la bibliografia specializzata.
7. PROCEDURA
Materiali forniti
Gli antisieri sono disponibili in flaconi provvisti di dispensatore
e contagocce.
Materiale necessario ma non fornito
1. Soluzione salina allo 0,85%.
2.Vetrini.
3. Ansa per batteriologia e becco Bunsen.
4. Fonte di luce su fondo scuro.
5. Provette e portaprovette.
6. Bagnomaria regolabile con termometro.
7.Cronometro.
8.Pipette.
9. Sono disponibili sospensioni colorate (SS01/R30855001–
SS03/R30855201, SS04/R30952801–SS08/R30953201, SS09/
R30855301, SS11/R30953301, SS12/R30855401, SS13/
R30953401) da utilizzare come controlli.
Test di agglutinazione in provetta
Sebbene le sospensioni vitali possano essere utilizzate come
antigeni, occorre prestare molta attenzione a non contaminare
il laboratorio.Un antigene O ucciso può essere preparato
riscaldando una sospensione salina (0,85%) a 100°C per 10
minuti, centrifugando e riportando il deposito in sospensione in
soluzione salina allo 0,85%. Evitare l’uso di fenolo o formalina nella
preparazione di un antigene O poiché queste sostanze inibiscono
l’agglutinazione O in presenza di antigeni H. Gli antigeni H per i test
di agglutinazione in provetta possono essere preparati portando
in sospensione i microrganismi in soluzione salina con formalina
allo 0,5% o aggiungendo formalina alle colture in brodo.3 A causa
della scarsa mobilità dei microrganismi, le colonie prelevate da
terreni di isolamento primario possono risultare inadeguate
per la determinazione del sierotipo H. Si può ovviare a tale
inconveniente mediante una subcoltura in una provetta a becco
di clarino con agar molle, su una piastra Petri con agar allo 0,5%
oppure in una provetta Craigie con agar allo 0,2% e prelevando il
bordo principale della coltura dopo l’incubazione.
Fase 1
Preparare una sospensione a bassa concentrazione di
batteri (all’incirca 109 microrganismi per ml).
Fase 2
Effettuare diluizioni seriali di antisiero in volumi di 0,5 ml
da 1:10 a 1:320 per le determinazioni dei fattori O e Vi e
da 1:25 a 1:800 per i fattori H.
Fase 3
Aggiungere in ogni provetta 0,5 ml di sospensione
antigenica. La diluizione dell’antisiero risulterà pertanto
raddoppiata.
Fase 4
Includere anche una provetta di controllo contenente
soltanto la sospensione e la soluzione salina.
Fase 5
Dare dei colpetti alle provette per miscelarne il
contenuto. Incubare le provette con fattore O a 50°C per
4 ore, le provette con fattore Vi dapprima a 37°C per 2 ore
e successivamente per 18 ore a 2-8°C [lasciarle riscaldare
a temperatura ambiente (18-30°C) prima di procedere
alla lettura dei risultati] e le provette con fattore H a 50°C
per 2 ore.
Fase 6
Dare dei colpetti alle provette ed esaminare
l’agglutinazione utilizzando una fonte di luce forte di
fondo.
inversione di fase
Molti sierotipi di Salmonella possiedono antigeni H bifasici. Spesso
in una coltura si evidenziano entrambe le fasi. Tuttavia, nel caso
in cui soltanto una singola fase risultasse rilevabile, potrebbe
essere necessario isolare e identificare l’altra. A tal fine occorre
allestire una subcoltura o subcolture ripetute su una piastra
Petri con agar allo 0,5% oppure in una provetta Craigie1 con
agar allo 0,2% contenente 1% del siero agglutinante per la fase
identificabile, mentre per l’altra fase occorre analizzare al termine
dell’incubazione il bordo principale della coltura.
8. RISULTATI
Agglutinazione su vetrino
L’agglutinazione deve essere forte e chiaramente visibile entro
un minuto. Nel controllo con soluzione salina non deve verificarsi
alcuna agglutinazione visibile; in caso contrario, la sospensione
non è idonea all’analisi con questo metodo.
In alcuni ceppi l’agglutinazione O potrebbe venire nascosta dalla
presenza dell’antigene Vi. Tale fenomeno può essere identificato
mediante un test di agglutinazione su vetrino o in provetta
utilizzando il Salmonella Agglutinating Serum (Vi). In presenza
di antigene Vi, una sospensione salina del microrganismo deve
essere riscaldata a 100°C per un’ora in modo da distruggere
l’antigene Vi e quindi centrifugata; una sospensione salina fresca
del deposito deve essere rianalizzata con gli antisieri O per
l’identificazione degli antigeni O. Va ricordato che l’antigene Vi
non è riconducibile esclusivamente a Salmonella.
Agglutinazione in provetta
In una reazione O o Vi positiva si osserva una chiara agglutinazione
granulare: l’agglutinazione H ha un caratteristico aspetto
flocculare.Si può osservare che il liquido tende a diventare limpido
e che un sedimento si solleva come massa granulare per poi
ricadere sui fondo alla provetta se la si agita delicatamente con
un dito. In una reazione negativa e nel controllo con la soluzione
salina, l’aspetto della sospensione deve rimanere immutato e,
dando un colpetto alla rovetta, deve comparire il tipico vortice.
Se nel controllo con la soluzione salina si riscontra agglutinazione,
la sospensione ha un aspetto irregolare e non è idonea
all’agglutinazione in provetta. Il titolo è dato dalla diluizione del
siero nell’ultima provetta che mostra agglutinazione. Un titolo
pari o prossimo a quello indicato nell’etichetta del flacone indica
che l’antigene è dello stesso sierotipo dell’antisiero.
Se i sieri vengono utilizzati come controlli per l’attività delle
sospensioni colorate, seguire la procedura descritta nelle
istruzioni per l’uso fornite insieme alle sospensioni colorate O e
H di Salmonella. Si deve ottenere un titolo compreso tra due delle
diluizioni seriali indicate sull’etichetta del flacone.
9. CONTROLLO DI QUALITÀ
Si raccomanda di testare il prodotto durante l'uso con colture
positive e negative note. Esempi di colture positive per i sieri
agglutinanti O di Salmonella (ZC) e per i sieri agglutinanti H di
Salmonella (ZD) sono riportati rispettivamente nelle tabelle 3 e 4.
Se un antisiero agglutina con una coltura negativa nota oppure
non agglutina con una coltura positiva nota, deve essere eliminato.
Tabella 3
Colture del controllo positivo Range o Salmonella (zC)
Codice
NCTC
Rif.
ZC11/R30956701 10431
ZC12/R30956801 5787
ZC13/R30956901 3048
ZC14/R30957001 3048
ZC15/R30957101 5745
ZC16/R30957201 6947
ZC17/R30957301 5765
ZC18/R30957401 6021
ZC19/R30957501 5783
ZC20/R30957601 6016
ZC21/R30957701 6533
ZC22/R30957801 5794
ZC23/R30957901 5787
ZC24/R30958001 5797
ZC25/R30958101 5798
ZC26/R30958201 8271
ZC27/R30958301 6759
ZC28/R30958401 5799
ZC29/R30958501 5800
ZC30/R30958601 5732
ZC31/R30958701 6020
ZC32/R30958801 9918
ZC33/R30958901 6586
ZC34/R30959001 8492
ZC35/R30959101 6851
ZC36/R30959201 7898
ZC37/R30959301 7401
Specie di Salmonella
Salmonella paratyphi A
Salmonella newbrunswick
Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium
Salmonella bareilly
Salmonella virginia
Salmonella enteritidis
Citrobacter ballerupensis
Salmonella zanzibar
Salmonella rubislaw
Salmonella grumpensis
Salmonella carrau
Salmonella newbrunswick
Salmonella gaminara
Salmonella kirkee
Salmonella blukwa
Salmonella taksony
Salmonella kentucky
Salmonella minnesota
Salmonella schleissheim
Salmonella telaviv
Salmonella godesberg
Salmonella adelaide
Salmonella mgulani
Salmonella champaign
Salmonella allandale
Salmonella waycross
Struttura
antigenica9
1,2,12:a:– *
3,15:Iv:1,7
4,5:i:1,2
4,5:i:1,2
6,7:y:1,5
8:d:–
1,9,12:gm:–
–
3,10:k:1,5
11:r:enx
13,22:d:1,7
6,14,24:y:1,7
3,15:lv:1,7
16:d:1,7
17:b:1,2
18:z4z24:–
1,3,19:i:z6
8,20:i:z6
21:b:enx
4,12,27:b:–
28:y:enz15
30:gm:–
35:fg:–
38:i:1,2
39:k:1,5
1,40:k:1,6
41:z4z23:–
Controllo negativo per tutti i codici ZC e ZD: Hafnia alvei NCTC
8535
*microrganismo di categoria 3
Tabella 4
Colture del controllo positivo Range H Salmonella (zD)
Codice
ZD02/R30959801
ZD03/R30959901
ZD04/R30160101
ZD05/R30160201
ZD06/R30160301
ZD07/R30160401
ZD08/R30160501
ZD09/R30160601
ZD10/R30160701
ZD11/R30160801
ZD12/R30160901
ZD13/R30161001
ZD14/R30161101
ZD15/R30161201
ZD16/R30161301
ZD17/R30161401
ZD18/R30161501
ZD19/R30161601
ZD20/R30161701
ZD21/R30161801
ZD22/R30161901
ZD23/R30162001
ZD24/R30162101
ZD25/R30162201
ZD26/R30162301
ZD27/R30162401
NCTC
Rif
6947
5793
5783
5756
7886
9929
6947
5727
3072
5727
6020
9890
9890
9918
9676
10480
3158
3048
5783
5793
5787
5793
9606
6016
5745
10214
Specie di Salmonella
Salmonella virginia
Salmonella worthington
Salmonella zanzibar
Salmonella narashino
Salmonella mississippi
Salmonella yolo
Salmonella virginia
Salmonella abortusequi
Salmonella anatum
Salmonella abortusequi
Salmonella telaviv
Salmonella milwaukee
Salmonella milwaukee
Salmonella godesberg
Salmonella dublin
Salmonella moscow
Salmonella senftenberg
Salmonella typhimurium
Salmonella zanzibar
Salmonella worthington
Salmonella newbrunswick
Salmonella worthington
Salmonella rowbarton
Salmonella rubislaw
Salmonella bareilly
Salmonella kaolack
Struttura
antigenica9
8:d:–
1,13,23:z:lw
3,10:k:1,5
6,8,a:enx
1,13,23:b:1,5
35:c:–
8:d:–
4,12:enx:–
3,10:eh:1,6
4,12:enx:–
28:y:enz15
43:fg:–
43:fg:–
30:gm:–
1,9,12:gp:–
9,12:gq:–
1,3,19:gst:–
4,5:i:1,2
3,10:k:1,5
1,13,23:z:lw
3,15:lv:1,7
1,13,23:z:lw
16:mt:–
11:r:enx
6,7:y:1,5
47:z:1,6
Codice
ZD28/R30162501
ZD29/R30162601
ZD30/R30162701
ZD31/R30162801
ZD32/R30162901
ZD33/R30163001
ZD34/R30163101
ZD35/R30163201
ZD36/R30163301
ZD37/R30163401
ZD38/R30163501
ZD39/R30163601
NCTC
Rif.
7401
5799
7405
–
6388
7411
8572
5785
3048
7409
5785
6480
Specie di Salmonella
Salmonella waycross
Salmonella kentucky
Salmonella illinois
Salmonella simsbury
Salmonella tennessee
Salmonella weslaco
Salmonella fresno
Salmonella newington
Salmonella typhimurium
Salmonella donna
Salmonella newington
Salmonella florida
Struttura
antigenica9
41:z4z23
8,20:i:z6
3,15,34:z10:1,5
1,3,19:z27:–
6,7,1:z29
42:z36:–
9,46:z38:–
3,15,34:eh:1,6
4,5:i:1,2
30:lv:1,5
3,15,34:eh:1,6
1,6,14,25:d:1,7
NOTA: salvo indicazione contraria, tutte le colture appartengono
alla categoria 2, come indicato nelle linee guida ACDP.
10. INTeRpReTAzIONe DeI RISULTATI
L’estensione dell’esame sierologico dipende dalla finalità
dell’indagine. Per ottenere un riscontro sierologico della
presenza di Salmonella, le colture devono essere analizzate con
i sieri polivalenti O e H e con il siero Vi. Se occorre un’analisi più
approfondita, normalmente si determina l’antigene O utilizzando
i sieri appropriati e successivamente si analizza per rilevare
l’antigene H più probabile, come indicato nella classificazione di
Kauffmann-White2,4,5,6.
11. LIMITI DeL MeTODO
Sebbene non sia fattibile fornire i sieri a fattore singolo per tutti
gli antigeni noti di Salmonella, è disponibile un’ampia gamma di
sieri che permette di identificare con un alto grado di accuratezza
la maggior parte dei tipi di Salmonella isolati.
Gli antisieri permettono soltanto l’identificazione sierologica; per
la completa identificazione di un microrganismo occorre eseguire
in parallelo anche test biochimici.
Anche se i sieri sono stati adsorbiti per ridurre al minimo reazioni
crociate, non si può completamente escludere tale eventualità
con altri antigeni di Salmonella o con microrganismi correlati di
altre specie.
12. RISULTATI ATTeSI
Agglutinazione visibile in presenza di antigeni omologhi.
13. CARAtteRiStiCHe SPeCiFiCHe Di PReStAzione
Fare riferimento alla sezione interpretazione dei risultati.
14. BIBLIOgRAFIA
1
2
3
4
5
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7
8
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Kauffmann, F. (1966). The Bacteriology of Enterobacteriaceae.
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20,134.
taylor, J. (1967). The isolation and identification of salmonellae. A.C.P.
Broadsheet No. 58.
Remel Stained Salmonella Suspension, Instructions for Use.
Kauffman-White Scheme.
15. CONFezIONe
ZC11/R30956701.....2 ml
ZC12/R30956801.....2 ml
ZC13/R30956901.....2 ml
ZC14/R30957001.....2 ml
ZC15/R30957101.....2 ml
ZC16/R30957201.....2 ml
ZC17/R30957301.....2 ml
ZC18/R30957401.....2 ml
ZC19/R30957501.....2 ml
ZC20/R30957601.....2 ml
ZC21/R30957701.....2 ml
ZC22/R30957801.....2 ml
ZC23/R30957901.....2 ml
ZC24/R30958001.....2 ml
ZC25/R30958101.....2 ml
ZC26/R30958201.....2 ml
ZC27/R30958301.....2 ml
ZC28/R30958401.....2 ml
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ZD05/R30160201.....2 ml
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ZD26/R30162301.....2 ml
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ZD29/R30162601.....2 ml
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ZD32/R30162901.....2 ml
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ZD36/R30163301.....2 ml
ZD37/R30163401.....2 ml
ZD38/R30163501.....2 ml
ZD39/R30163601.....2 ml
legenda dei simboli
Numero di codice
Dispositivo medico per la diagnostica in vitro
Consultare le istruzioni per l’uso (IFU)
Limiti temperatura (Temp. conservazione)
Codice lotto (numero lotto)
Data di scadenza
Ultima diluizione che presenta agglutinazione
positiva
Prodotto da
IFU X7823A, Rivisto Ottobre 2013
Remel Europe Ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT
UK
Per l’assistenza tecnica, rivolgersi al distributore di zona.