Wellcolex Colour Salmonella [IT]

4. REAGENTI
Wellcolex*
Colour Salmonella
R30858301.........................50 Tests
R30858302.........................200 Tests
Componenti del kit
Wellcolex* Colour
Salmonella
50 test
200 test
(ZC50/R30858301) (ZC52/R30858302)
IT
1. FINALITÀ D’USO
Wellcolex* Colour Salmonella costituisce una semplice e rapida
procedura analitica qualitativa al lattice per lo screening, la
rilevazione e l’identificazione presuntiva del sierogruppo della
Salmonella da brodo di selenite F e su mezzi solidi. Il test
Wellcolex* Colour Salmonella è stato classificato come altamente
complesso in base a CLIA.
2. Riassunto e spiegazione del test
Il genere Salmonella è causa, nell’uomo, di una vasta serie
di condizioni patologiche che vanno da forme leggere di
gastroenteriti fino a gravi febbri enteriche che possono avere
esito letale; esistono inoltre portatori asintomatici. Una precoce
e attendibile identificazione delle Salmonelle è quindi utile sia
per la scelta di un’appropriata terapia, sia ai fini del controllo
di epidemie. L’identificazione primaria di questi microrganismi
richiede procedure sia biochimiche che sierologiche. Test
sierologici definitivi prevedono l’uso di un elevato numero di
antisieri rivolti verso gli antigeni somatici ‘O’ e ciliari ‘H’ e vengono
eseguiti essenzialmente in centri di riferimento. Può essere
molto utile per il laboratorio clinico identificare l’isolato a livello
di sierogruppo ‘O’ prima di inviarlo ai laboratori di riferimento4.
3. PRINCIPIO DEL METODO
Nel test Wellcolex* Colour Salmonella, un campione proveniente
da coltura in brodo di selenite F (dopo incubazione di 18 - 24
ore) o una sospensione di batteri provenienti da agar solido
vengono fatti reagire con due reagenti. Ognuno di questi reagenti
è costituito da una miscela di sospensioni di particelle di lattice
rosse, blu e verdi. Ogni sospensione è rivestita con anticorpi
specifici per diversi sierogruppi di Salmonella. In presenza di un
antigene omologo, uno dei colori della miscela si agglutinerà
e l’identità dell’antigene si manifesterà tramite il colore delle
particelle aggregate con un cambiamento contrastante del colore
del fondo. Ciascuna combinazione è facilmente distinguibile dalle
altre e da un risultato negativo nel quale le particelle restano in
una sospensione grigio-marrone omogenea e dal risultato non
specifico occasionale nel quale tutte le particelle si agglutinano
in aggregati di colore grigio-marrone contro un fondo chiaro.
1.Reagente al
lattice 1
1 contagocce
(tappo bianco)
4 contagocce
(tappi bianchi)
2.Reagente al
lattice 2
1 contagocce
(tappo bianco)
4 contagocce
(tappi bianchi)
3.Controllo
positivo rosso
1 contagocce
(tappo rosso)
1 contagocce
(tappo rosso)
4.Controllo
positivo blu
1 contagocce
(tappo blu)
1 contagocce
(tappo blu)
5.Controllo
positivo verde
1 contagocce
(tappo verde)
1 contagocce
(tappo verde)
6.Bastoncini
di miscelazione
monouso
2 mazzetti
5 mazzetti
7.Cartoncini di
reazione monouso
1 confezione
4 confezioni
8.Dispensatori
del campione
monouso
2 confezioni
8 confezioni
9.Provette
di sospensione
monouso
1 confezione
–
10.Istruzioni per
l’uso
1
1
11.Guida alla
lettura
1
1
Reagente al lattice 2
Un flacone contagocce (ZC50/
R30858301) o quattro flaconi
contagocce (ZC52/R30858302)
contenenti una sospensione grigiomarrone di particelle al lattice di
polistirene in tampone contenente
Bronidox® allo 0,05% come
conservante. Le particelle al lattice
sono rivestite di anticorpi di coniglio
con la seguente specificità:
Lattice rosso
Vi
Lattice blu Salmonella dei gruppi E e G
Lattice verde Salmonella di gruppo A
Controllo positivo rosso
Sospensione di batteri uccisi di
organismi con antigeni di Salmonella
dei gruppi B e Vi contenenti Bronidox®
allo 0,05% e formalina allo 0,5% come
conservanti.
Controllo positivo blu
Sospensione di batteri uccisi di
organismi con antigeni di Salmonella
dei gruppi C ed E contenenti Bronidox®
allo 0,05% e formalina allo 0,5% come
conservanti.
Affinché mantengano la propria attività fino alla data di scadenza
del kit, tutti i componenti devono essere conservati a 2-8°C, salvo
indicazione contraria.
Una volta aperto, carte reazione deve essere conservato a
temperatura ambiente (da 18 a 30 ° C)
5. Descrizione,
preparazione
per
l’uso
e
raccomandazioni per la conservazione
Fare riferimento anche alla sezione Avvertenze e precauzioni
di impiego.
con la seguente specificità:
Lattice rosso
Salmonella di gruppo B
Lattice blu Salmonella di gruppo C
Lattice verde Salmonella di gruppo D1
Reagente al lattice 1
Un flacone contagocce (ZC50/
R30858301) o quattro flaconi
contagocce (ZC52/R30858302)
contenenti una sospensione grigiomarrone di particelle al lattice di
polistirene in tampone contenente
Bronidox® allo 0,05% come
conservante. Le particelle al lattice
sono rivestite di anticorpi di coniglio
Controllo positivo verde
Sospensione di batteri uccisi di
organismi con antigeni di Salmonella
dei gruppi A e D1 contenenti Bronidox®
allo 0,05% e formalina allo 0,5% come
conservanti.
6. Avvertenze e precauzioni di impiego
Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
Esclusivamente per uso professionale.
Per informazioni su componenti potenzialmente pericolosi, fare
riferimento alle schede di sicurezza fornite dal produttore e alle
informazioni riportate sulle etichette dei prodotti.
6.1. Precauzioni di sicurezza
1.
I controlli positivi rosso, blu e verde contengono formalina
allo 0,5% che è classificata dalle Direttive della Comunità
Economica Europea (CEE) in applicazione come irritante
(Xi). Di seguito sono riportate le frasi di Rischio (R) e di
Sicurezza (S) appropriate.
Xi
R43 Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle
S24Evitare il contatto con la pelle
S37 Usare guanti adatti
2.
In accordo con le norme di buona pratica di laboratorio, si
raccomanda vivamente di trattare tutti i campioni clinici
e i materiali come potenzialmente infettivi e di utilizzarli
prendendo tutte le precauzioni necessarie. La procedura
deve essere eseguita preferibilmente in una camera di
sicurezza per uso microbiologico1.
3.Dopo l’uso, il materiale non monouso deve essere
sterilizzato con un’adeguata procedura; il metodo preferito
è la sterilizzazione in autoclave per 15 minuti a 121°C; il
materiale monouso deve essere sterilizzato in autoclave o
incenerito. Gli schizzi di materiali potenzialmente infettivi
devono essere immediatamente asciugati con carta
assorbente e l’area interessata deve essere decontaminata
con un disinfettante oppure con alcol al 70%. I materiali
usati per pulire gli schizzi, guanti inclusi, devono essere
smaltiti osservando le stesse precauzioni previste per i
rifiuti a potenziale rischio biologico. Non sterilizzare in
autoclave i materiali contenenti ipoclorito di sodio.
4.
Non pipettare con la bocca. Indossare guanti monouso,
il camice da laboratorio e occhiali protettivi mentre si
trattano i campioni e si esegue il test. Al termine, lavarsi
accuratamente le mani.
5.
Se tali reagenti dovessero venire a contatto con la pelle
o gli occhi, lavare immediatamente le aree interessate
sciacquando abbondantemente con acqua.
6.Evitare di ingerire i reagenti.
6.2. Precauzioni analitiche
1.
Non usare i reagenti oltre la data di scadenza indicata.
2.Evitare la contaminazione microbiologica dei reagenti
poiché potrebbe ridurre la durata del kit e dare luogo a
risultati errati.
3.
Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura
ambiente (18‑30°C) prima dell’uso. Immediatamente
dopo l’uso, riportare i reagenti alle temperature di
conservazione raccomandate. Se i Reagenti al lattice
mostrano segni di aggregazione quando vengono
dispensati per la prima volta, si può supporre che essi siano
stati congelati e pertanto non devono essere utilizzati.
4.
Conservare i Reagenti al lattice in posizione verticale a
2-8°C. Dopo un periodo di conservazione prolungato,
potrebbero formarsi degli aggregati o potrebbe verificarsi
un essiccamento intorno all’apertura dei flaconi dei
Reagenti al lattice. In questo caso, agitare energicamente
i Reagenti al lattice per qualche secondo fino a quando
non sono stati riportati in sospensione.
5.
Gli operatori affetti da difetti di visione cromatica sono
solitamente in grado di identificare l’agglutinazione,
tuttavia possono riscontrare difficoltà nel differenziare le
reazioni cromatiche. In caso di problemi, la lettura deve
essere effettuata da persone con vista normale.
6.
La qualità del brodo di selenite F utilizzato per
l’arricchimento della Salmonella riveste particolare
importanza poiché un brodo che sia stato surriscaldato,
che contenga un precipitato rosso, che sia stato
conservato per periodi di tempo lunghi o a temperature
superiori agli 8°C può dare luogo a risultati insoddisfacenti
e pertanto non deve essere utilizzato5.
7.
È importante che il flacone contagocce sia utilizzato
tenendolo in posizione verticale e che la goccia si formi
all’estremità del beccuccio. Se il beccuccio è bagnato,
potrebbe formarsi una goccia di volume errato nell’area
circostante e non esattamente all’estremità. In questo
caso, asciugare il beccuccio prima di procedere.
8.
L’uso di un agitatore rotante su una superficie piana è
fondamentale. Per una prestazione ottimale, accertarsi
che l’agitatore rotante sia piano e sia stato calibrato a 150
± 5 rpm.
9.
Non toccare le aree di reazione dei cartoncini. È importante
accertarsi che i Cartoncini di reazione siano in posizione
perfettamente orizzontale rispetto all’agitatore, altrimenti
sarà difficile osservare chiari schemi di agglutinazione.
10. Accertarsi che i Controlli positivi siano riportati in
sospensione, agitando energicamente a mano o al Vortex
per dieci secondi. NON agitare al Vortex i Reagenti al
lattice.
7. Prelievo del campione e preparazione DELLE
COLTURE
Il test può essere eseguito direttamente su brodo di selenite F
dopo 18-24 ore di incubazione. La qualità del brodo di selenite
F è molto importante (fare riferimento alla sezione Precauzioni
analitiche).
Il test può anche essere eseguito su colonie non fermentanti il lattosio
che crescono in coltura primaria su terreni selettivi (per esempio
agar MacConkey, agar enterico Hektoen oppure agar di xiloso lisina
desossicolato), in sottocoltura da brodo di arricchimento su questi
terreni oppure in coltura pura (per esempio piastre di agar
nutritivo o provette a becco di clarino).
Se occorre confermare il risultato del test, la sospensione batterica
utilizzata per il test colorato può essere ripartita in sottocolture ai
fini di un’ulteriore identificazione; è possibile altresì utilizzare la
stessa sospensione per l’analisi con il dosaggio Wellcolex* Colour
Shigella (ZC51/R30858401).
Per maggiori informazioni sul prelievo del campione e la
preparazione delle colture si consiglia di consultare la bibliografia
specializzata2,3,4.
8. PROCEDURA
Materiali forniti
Il kit Wellcolex* Colour Salmonella contiene materiali sufficienti
per 50 test (ZC50/R30858301) o 200 test (ZC52/R30858302) (fare
riferimento all sezione Componenti del kit).
Materiali necessari ma non forniti
1.
Soluzione salina sterile allo 0,85%.
2.
Il test deve essere eseguito su un agitatore a fondo piano
con un diametro orbitale di 32 mm (1,25 in.)/38 mm
(1,5 in.) ad una velocità approssimata di 150 rpm. La
velocità e il diametro orbitale sono fondamentali per la
performance del dosaggio.
3.
Provette o flaconi in vetro piccoli idonei per la bollitura
dei campioni di brodo di selenite F che risultino positivi
per l’antigene Vi.
4.
Bagnomaria bollente.
5.
Soluzione salina sterile contenente 0,5 ml di formaldeide
al 35% per 100 ml da utilizzare nel caso di un risultato
positivo per l’antigene Vi con sospensioni batteriche.
6.
Le Provette di sospensione monouso non vengono
fornite con il kit ZC52/R30858302. L’identificazione delle
colonie può essere eseguita con questo kit utilizzando una
provetta adeguata in vetro o in plastica (polistirene) inerte.
Non sono necessari altri materiali o strumentazione.
Preparazione del brodo di arricchimento
1.
Accertarsi che il brodo di selenite F venga portato a
temperatura ambiente (18-30°C) prima dell’inoculazione.
2.
Inoculare un campione di feci della grandezza di un pisello
o 0,5 ml di feci liquide in 3 ml di soluzione salina sterile o
di brodo di selenite F in un contenitore con tappo a vite.
Emulsionare agitando energicamente o al Vortex; prima
dell’emulsione provvedere a frantumare i campioni solidi.
3.
Lasciare riposare per qualche minuto in modo da ridurre
il rischio della formazione di aerosol. Inoculare il brodo in
rapporto di 1 volume di emulsione per 10 volumi di brodo
e incubare per 18‑24 ore a 37°C. Assicurarsi che il tappo del
flacone o della provetta non sia completamente avvitato
in modo da permettere la circolazione di aria.
NOTA: i migliori risultati si ottengono eseguendo
l’inoculazione diretta del brodo di selenite F9. È essenziale
che i campioni di feci della grandezza di un pisello
siano frantumati ed emulsionati nel brodo prima
dell’incubazione.
Procedura del test
NOTA: durante l’esecuzione del test è opportuno osservare le
precauzioni idonee al trattamento di colture vive.
Test su brodo
NOTA: NON MISCELARE IL BRODO DI SELENITE F PRIMA DEL TEST.
Fase 1
Fase 2
Risospendere i Reagenti al lattice 1 e 2 agitandoli
energicamente per alcuni secondi. Tenendo il flacone
in posizione verticale, dispensare una goccia di ciascun
Reagente al lattice facendola cadere liberamente in
un cerchio distinto del Cartoncino di reazione tenuto in
posizione piana. Eliminare le bolle d’aria con l’estremità
del Bastoncino di campionamento.
Con un Dispensatore del campione monouso tenuto in
posizione verticale, trasferire una goccia (40 µl) di brodo
di selenite F inoculato facendola cadere liberamente
in ciascuno dei due cerchi, prestando attenzione a non
agitare il brodo quando viene rimosso dall’incubatore.
È importante che il campione di brodo venga prelevato
appena al di sopra dei detriti fecali ma che non contenga
tali detriti. Prestare attenzione a non dispensare bolle
d’aria. Procedere allo smaltimento del dispensatore nel
rispetto delle vigenti norme di sicurezza.
Fase 3Miscelare il contenuto di ogni cerchio con un Bastoncino
e spandere fino a coprire l’intera area. Lo stesso
bastoncino può essere utilizzato per entrambi i cerchi e
deve essere smaltito nel rispetto delle vigenti norme di
sicurezza.
Fase 4
Posizionare il cartoncino in un apposito agitatore
rotante su una superficie piana e agitare a 150 ±
5 rpm per 2 minuti (fare riferimento alla sezione
Precauzioni analitiche). Spegnere l’agitatore e osservare
l’agglutinazione senza rimuovere il cartoncino
dall’agitatore. Il cartoncino deve essere tenuto a una
normale distanza di lettura dagli occhi (25‑35 cm). Non
usare lenti di ingrandimento. Lo schema di reazione
ottenuto è chiaro ed è visibile in normali condizioni di
illuminazione.
In caso di incertezza sulla presenza dell’agglutinazione,
il test deve essere ripetuto utilizzando una goccia (40
µl) di brodo negativo. Non deve essere visibile alcuna
agglutinazione. Il risultato può essere utilizzato per il
confronto.
Fase 5Eliminare i cerchi del cartoncino di reazione usati
secondo le norme di sicurezza vigenti. Accertarsi che i
Reagenti al lattice siano riposti in frigorifero (2-8°C).
Identificazione delle colonie
Fase 1Dispensare all’incirca 200 µl di soluzione salina in una
Provetta di sospensione. Si può utilizzare il Dispensatore
del campione monouso che è graduato a circa 200 µl.
Fase 2Da una coltura incubata per una notte, raccogliere una o
due colonie di dimensioni medie (1-2 mm) sospettate di
contenere Salmonella dalla piastra di coltura, utilizzando
l’estremità piatta del Bastoncino di campionamento ed
emulsionare con attenzione i batteri nella soluzione
salina. Se si tratta di colonie piccole sarà necessario
raccogliere più colonie, in modo da ricoprire l’estremità
del Bastoncino. Procedere allo smaltimento del
Bastoncino nel rispetto delle vigenti norme di sicurezza.
Fase 3
Risospendere i Reagenti al lattice 1 e 2 agitandoli
energicamente per alcuni secondi. Tenendo il flacone
in posizione verticale, dispensare una goccia di ciascun
Reagente al lattice facendola cadere liberamente in un
cerchio distinto del Cartoncino di reazione tenuto in
posizione piana. Eliminare le bolle d’aria con l’estremità
del Bastoncino di campionamento.
Fase 4
Con un Dispensatore del campione monouso tenuto
in posizione verticale, trasferire una goccia (40 µl)
di sospensione batterica in ciascuno dei due cerchi,
lasciandola cadere liberamente. Prestare attenzione a
non dispensare bolle d’aria. Procedere allo smaltimento
del dispensatore nel rispetto delle vigenti norme di
sicurezza.
Fase 5Miscelare il contenuto di ogni cerchio con un Bastoncino
e spandere fino a coprire l’intera area. Lo stesso
bastoncino può essere utilizzato per entrambi i cerchi e
deve essere smaltito nel rispetto delle vigenti norme di
sicurezza.
Fase 6
Posizionare il cartoncino in un apposito agitatore
rotante su una superficie piana e agitare a 150 ±
5 rpm per 2 minuti (fare riferimento anche alla
sezione Precauzioni analitiche). Spegnere l’agitatore e
osservare l’agglutinazione senza rimuovere il cartoncino
dall’agitatore. Il cartoncino deve essere tenuto a una
normale distanza di lettura dagli occhi (25‑35 cm). Non
usare lenti di ingrandimento. Lo schema di reazione
ottenuto è chiaro ed è visibile in normali condizioni
di illuminazione. In caso di incertezza sulla presenza
dell’agglutinazione, il test va ripetuto utilizzando una
goccia (40 µl) di soluzione salina. Non deve essere visibile
alcuna agglutinazione. Il risultato può essere utilizzato
per il confronto.
Fase 7Eliminare i cerchi del cartoncino di reazione usati
secondo le norme di sicurezza vigenti. Accertarsi che i
reagenti al lattice siano riposti in frigorifero (2-8°C).
9. Risultati
Lettura dei risultati
Fare riferimento alla guida alla lettura del Wellcolex* Colour
Salmonella.
Negativo
Nessuno dei due Reagenti al lattice si agglutina e l’aspetto
omogeneo color grigio-marrone rimane sostanzialmente invariato
nel corso del test (figura 1). Va osservato comunque che, anche
in una reazione negativa, si potrebbero riscontrare lievi tracce di
granulosità, a seconda dell’acutezza visiva dell’operatore.
Positivo
Si verifica un cambiamento di colorazione nella reazione causata
dall’agglutinazione di una delle sospensioni al lattice colorate
nella miscela che causa un cambiamento contrastante del colore
del fondo (figure da 3 a 5). Solitamente si agglutina un unico
colore in un Reagente al lattice, tuttavia con una coltura mista
di Salmonella, due colori possono agglutinarsi in un Reagente
al lattice (figure da 6 a 8) o un unico colore in entrambi i
Reagenti. Tali reazioni sono facilmente distinguibili. Se le reazioni
differiscono da quelle riportate nelle figure da 3 a 8, la velocità ed
il funzionamento dell’agitatore rotante devono essere controllati
e, se necessario, regolati.
Non specifico
Tutte le particelle si agglutinano dando luogo ad aggregati color
grigio-marrone su fondo chiaro (figura 9). Può verificarsi che
si formino aggregati color grigio-marrone in presenza di una
reazione positiva. Se si è prodotto un chiaro cambiamento di
colorazione nel test, gli aggregati grigio-marrone devono essere
ignorati.
Detriti
In alcuni casi, specialmente quando si analizzano le colture in
brodo, possono apparire dei grumi nella miscela di reazione (figura
2). Queste formazioni si differenziano facilmente dalle reazioni
positive o negative. Tali grumi sono generalmente dovuti a residui
presenti nel brodo usato. Se il risultato non è chiaro, il campione
deve essere rianalizzato dopo la sedimentazione di tali detriti.
NOTA: il brodo di selenite F che fornisca un risultato presuntivo
positivo o un risultato non interpretabile deve essere confermato
o comunque ulteriormente studiato usando procedure
convenzionali2,3,4.
10. Controllo di qualità
Controllo visivo
I Reagenti al lattice vanno sempre esaminati nel momento in cui
sono dispensati sul Cartoncino di reazione e, se si osservano segni
di aggregazione prima dell’aggiunta del campione di brodo o della
sospensione batterica, non devono essere utilizzati.
Procedure di controllo
I test di controllo qualità devono essere effettuati con ciascuna
spedizione e nuovo numero di lotto dei kit ricevuti. Ogni
laboratorio deve rispettare le norme vigenti locali e governative.
Procedura del controllo positivo
Confermare la performance dei Reagenti al lattice utilizzando i
Controlli positivi forniti.
Fase 1Dispensare 3 gocce di Reagente al lattice 1 e 3 gocce di
Reagente al lattice 2 su 6 differenti Cerchi di reazione (una
goccia per cerchio).
Fase 2 Aggiungere una goccia di ciascun Controllo positivo in 2 dei
Cerchi di reazione (di cui uno contenente il Reagente al lattice
1 e un altro il Reagente al lattice 2).
Fase 3Miscelare i reagenti utilizzando un Bastoncino di
campionamento monouso per ciascun Controllo positivo.
Fase 4 Ruotare il cartoncino a 150 ± 5 rpm per 2 minuti su un
agitatore rotante meccanico. Allo scadere dei 2 minuti,
un’agglutinazione definitiva deve essere visibile in tutti i 6
Cerchi di reazione.
Fase 5Eliminare il Cartoncino di reazione usato secondo le norme di
sicurezza.
La colorazione del lattice agglutinato nel Reagente 1 e Reagente 2
deve corrispondere alla colorazione del Controllo positivo (blu,
rosso o verde).
Al posto del Controllo positivo possono essere utilizzate colture
stock di sierogruppi noti di Salmonella.
Procedura del controllo negativo
Ripetere la procedura del test utilizzando soluzione salina o brodo
di arricchimento al posto del campione. Non deve prodursi alcuna
agglutinazione significativa.
11. Interpretazione dei risultati
Un risultato positivo (agglutinazione colorata) indica la presenza e
identifica al contempo il sierogruppo di Salmonella (o la presenza
dell’antigene Vi) nel campione nel modo seguente:
REAZIONE
FONDO
REAGENTE
1
COMMENTI PER
TEST SU SELENITE
2
SIEROGRUPPO
IDENTIFICATO
Agglutinazione
verde o verde
oliva in un
reagente.
viola/rosa
D
Agglutinazione
blu in un
reagente
arancione/
rosa
Agglutinazione
rossa in un
reagente
turchese
B
Macchioline
irregolari rosso
scuro/marrone
in entrambi i
reagenti 1 e 2
grigio/
marrone
uniforme
negativo
Nessuna
agglutinazione
grigio/
marrone
uniforme
C
negativo
A
Le variazioni
dei colori
dipendono dal
colore del brodo
di selenite.Una
reazione positiva
può essere
parzialmente
nascosta da
agglutinati rosso/
marrone.
EoG
Vi
Ciò dipende
dai residui (se
un reagente
mostra molti
più agglutinati
dell’altro,
sospettare un
risultato positivo
– vedere di
seguito).
Agglutinazione
fine, granulare
rosso scuro/
marrone di solito
presente nella
stessa misura
in entrambi i
reagenti
Agglutinazione
turchese in un
reagente
trasparente
o grigio/
marrone
chiaro
rosa
non specifico
CeD
AeE
oG
Agglutinazione
arancione in un
reagente
azzurro
BeD
A e Vi
Agglutinazione
viola in un
reagente
verde
BeC
EoG
e Vi
Se la reazione è
più evidente in
un reagente, si
può ipotizzare
una reazione
positiva.
Controllare
accuratamente
i colori. Portare
a ebollizione 0,5
ml di campione
come descritto
sotto.
Controllare
il colore con
attenzione.
NOTA: usando il brodo di selenite F, i colori del fondo sopra indicati
possono essere mascherati e apparire di colore rosa o rosso/
marrone. In tal caso, l’identificazione va fatta soltanto in base al
colore delle particelle al lattice agglutinate.
Se si individua l’antigene Vi (agglutinazione rossa con il Reagente
al lattice 2), prelevare un campione fresco di brodo di selenite
F oppure preparare una nuova sospensione della coltura in
soluzione salina contenente formalina allo 0,5% in un’apposita
provetta o flacone per uccidere i batteri. Immergere la provetta
in un bagnomaria bollente per 5 minuti, fare raffreddare e
rianalizzare con il Reagente al lattice 1. In alternativa, preparare
almeno 400 µl di una nuova sospensione di coltura in soluzione
salina o in acqua distillata. Immergere in un bagnomaria bollente
per 30 minuti, fare raffreddare e rianalizzare con il Reagente
al lattice 1. L’agglutinazione evidenzierà il sierogruppo della
Salmonella; se non si verifica alcuna agglutinazione con il Reagente
al lattice 1, la coltura non contiene Salmonella. Tenere in debita
considerazione che l’antigene Vi continuerà a reagire con il
Reagente al lattice 2 anche dopo l’ebollizione.
Un risultato negativo indica che il campione in esame non contiene
antigeni appartenenti ai sierogruppi di Salmonella identificabili
con il test. Le crescite miste di colonie che non fermentano il
lattosio si riscontrano con frequenza in colture di feci e, se si
ottiene un risultato negativo, potrebbe risultare necessario
ripetere il test su altre colonie selezionate prima di eliminare la
coltura come negativa.
Se si ottiene una reazione non specifica, il risultato non
è interpretabile e devono essere seguite delle procedure
convenzionali per l’identificazione2,3,4.
Nel brodo di arricchimento, le reazioni non specifiche possono essere
riconducibili alla presenza di campioni fecali a elevato contenuto di
muco. Trasferire 0,5 ml o più del brodo in un’idonea provetta o flacone
in vetro, svitare il tappo e posizionare in un bagnomaria bollente per
5 minuti. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente (18-30°C) e
ripetere la procedura del test. Un campione del brodo di
arricchimento va analizzato allo stesso modo di un controllo
negativo.
12. Limiti del metodo
Wellcolex* Colour Salmonella è previsto come procedura di
screening per le Salmonelle provenienti da brodo di selenite F
e mezzi solidi come test di identificazione della coltura. Il test
è in grado di identificare gli isolati di Salmonella a livello di
sierogruppo, il che rappresenta un risultato soddisfacente per
la maggioranza delle indagini se a garantire l’identificazione
completa vi è la disponibilità di un laboratorio di riferimento4.
Per l’identificazione definitiva sono necessarie le procedure
biochimiche e sierologiche usuali2,3,4; i risultati del dosaggio
Wellcolex* Colour Salmonella possono essere presi come
riferimento per la selezione di antisieri appropriati.
Si possono riscontrare talvolta reazioni false positive a causa
della presenza di antigeni comuni in specie o generi eterologhi,
quale il Citrobacter, che possono essere differenziati tramite
convenzionali procedure biochimiche. Inoltre, l’antigene Vi può
essere riscontrato in batteri diversi dalla Salmonella2 che possono
essere differenziati rianalizzando un campione di brodo o una
sospensione della colonia portata a ebollizione per rimuovere
l’antigene Vi; se non c’è alcuna agglutinazione visibile tranne
quella con il lattice rosso nel Reagente al lattice 2, l’organismo
non è Salmonella. Va prestata particolare attenzione ai casi in cui
uno di questi organismi sia presente insieme alla Salmonella nel
brodo di arricchimento; prima di riportare i risultati, è opportuno
confermare il risultato con una sottocoltura del brodo.
Un risultato negativo non conferma l’assenza di Salmonella. Il test,
per esempio, pur non essendo in grado di rilevare l’intera gamma
dei sierogruppi di Salmonella, rileva il sierogruppo presente in
oltre il 99% dei ceppi riscontrati nelle infezioni umane in Gran
Bretagna6 e in oltre il 98% negli Stati Uniti7. Inoltre, in alcune
colture in brodo il livello di Salmonella può essere insufficiente
per fornire un risultato positivo.Ciò può verificarsi per esempio
con brodo che non sia stato incubato per almeno 18-24 ore.
Alcuni preparati di qualità inferiore di brodo di selenite F
contengono un precipitato di colore rosso mattone; i risultati
ottenuti nei test eseguiti con questo mezzo vanno interpretati
con cautela.
13. RISULTATI ATTESI
I ceppi appartenenti ai gruppi A, B, C, D, E o G o dotati dell’antigene
Vi presenteranno agglutinazione di colore rosso, blu o verde con
il corrispondente Reagente al lattice 1 o 2.
14. Caratteristiche specifiche di prestazione
Valutazione esterna
Per valutare il dosaggio Wellcolex* Colour Salmonella sono stati
condotti due studi:
(a)
Uno studio multicentrico che ha coinvolto cinque
laboratori di sanità pubblica in Gran Bretagna e tre
laboratori ospedalieri negli Stati Uniti, eseguito con colture
routinarie di Salmonella.
Il personale di ciascun laboratorio ha eseguito dei test
su uno o più dei seguenti campioni da ciascun campione
fecale:
1)
Brodo di arricchimento di selenite (selenite F).
2)
Colonie lattosio-negative provenienti direttamente da
sottocolture di brodo di arricchimento su piastre di agar
selettivo differenziale.
3)
Colonie lattosio-negative provenienti direttamente
da piastre primarie di agar selettivo differenziale
(MacConkey, XLD, DCA, SS e Hektoen).
4)
Sottocolture pure di colonie lattosio-negative su agar
nutritivo.
È stato utilizzato un agitatore per tutta la procedura.
I risultati sono riportati nelle tabelle 1 e 2.
La performance del dosaggio Wellcolex* Colour Salmonella
è stata determinata confrontando i risultati delle analisi
batteriologiche tradizionali dei campioni.
In questo studio, la sensibilità e specificità del dosaggio
Wellcolex* Colour Salmonella (fare riferimento alle tabelle
1 e 2) sono state le seguenti:
Sensibilità
(b)
Specificità
Colture su
piastra primaria
100% (65/65)
99,2% (127/128)
Sottocolture
in brodo di
arricchimento
100% (176/176)
100% (147/147)
Colture pure
99,5% (191/192)
98,0% (100/102)
Brodi di selenite
94,2% (114/121)
99,7% (305/306)
Sono state riscontrate 9 colture di non-Salmonella
contenenti l’antigene Vi, di cui nessuna ha reagito nel test
con i componenti gruppo-specifici.
Il valore predittivo di un risultato positivo è risultato
del 99,3% (432/435) su coltura in piastra e del 99,1%
(114/115) su brodo di selenite. I valori predittivi negativi
sono risultati rispettivamente pari al 99,7% (374/375) ed
al 97,8% (305/312).
La prevalenza di isolamento delle Salmonelle nei campioni
esaminati è stata del 44,8% (554/1237).
Con il dosaggio Wellcolex* Colour Salmonella la frequenza
di reazioni non interpretabili è stata del 4,5% (9/202)
per le colture su piastra primaria, del 6,1% (21/344) per
le sottocolture in brodo di arricchimento, del 3,6%
(11/305) per le colture pure e del 2,1% (9/436) per
brodo di selenite. Questi campioni sono stati esclusi dalle
tabelle 1 e 2.
Uno studio indipendente su isolati freschi e colture di
riferimento.
In questo studio8, il dosaggio Wellcolex* Colour Salmonella
ha correttamente identificato 267 dei 268 isolati
freschi e colture di Salmonelle di riferimento. Questi
comprendevano 10 isolati di ognuno dei 10 sierotipi di
Salmonella più comuni (S. typhimurium, S. enteritidis, S.
virchow, S. stanley, S. hadar, S. agona, S. heidelberg, S.
infantis, S. newport e S. braenderup), 10 ceppi di S. typhi
Vi+ e 10 Vi-, 10 differenti fagotipi ciascuno di S. paratyphi
A e S. paratyphi B e 75 ulteriori ceppi dei gruppi C, D, E e
G. Con i gruppi F e H non si è verificata alcuna reazione
crociata. Relativamente agli altri gruppi analizzati fino allo
O-67 incluso, si è riscontrata una debole reattività con il
lattice di gruppo D nel Reagente 1 con una coltura O-52
(S. utrecht); questa reazione non è stata osservata con
un’altra Salmonella di gruppo O-52 (S. flottbek). La S. uccle
(O-3, 54) ha reagito invece come previsto con il reagente
di gruppo E.
NOTA: per ulteriori dettagli sulle procedure analitiche
sierologiche e biochimiche per l’identificazione di
Salmonella, fare riferimento alla pubblicazione di Ewing
(1986)2.
Tabella 1
Coltura
primaria
Positivo
65
1b
66
Negativo
0
127
127
Yolken, R.H. American Society of Microbiology, Washington, D.C.
Pagine 19-32.
4
Farmer, J.J. (1995). Enterobacteriaceae: Introduction and
Identification. Manual of Clinical Microbiology, 6th Ed., Edited by
Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C. and Yolken,
R.H. American Society of Microbiology, Washington, D.C. Pagine
438-449.
5
MacFaddin, J.F. (1985). Media for Isolation – Cultivation –
Identification – Maintenance of Medical Bacteria, Volume 1,
Williams and Wilkins, Baltimore and London, Pagine 701-705.
6
Communicable Disease Reports, Weekly Editions 1-52, 1986, Public
Health Laboratory Service, Colindale, London.
7
Salmonella Surveillance Report (1984), U.S. Department of Health
and Human Services, Atlanta, Georgia.
8
Dati disponibili in archivio.
9
Margull, A., Schulz, P., et al (1993). Laboratoriumsmedizin,17:295
Evaluation of a Coloured Latex Test for Rapid Diagnosis of
Salmonella in Stool Specimens.
Sottocoltura
del brodo
Positivo
176
0
176
CONFEZIONE
Negativo
0
147
147
Positivo
191
2b,c
193
Negativo
1d
100e
101
Legenda dei simboli
433
377
810
Identificazione delle Salmonelle da colture in piastra
Risultato
del test
Wellcolex*
Risultato di routine
Colour
Positivoa Negativo Totale
Salmonella
Sottocoltura
pura
Totale
199 di gruppo B, 116 di gruppo C, 91 di gruppo D, 23 di gruppo E,
2 di gruppo G e 2 di gruppo D/Vi.
colonia non fermentante il lattosio non identificata (reazione
gruppo E/G).
c
Citrobacter freundii (reazione gruppo E/G).
d
Gruppo D che è stato correttamente identificato mediante
Wellcolex* Colour Salmonella sulla sottocoltura in brodo.
e
Comprende Escherichia coli, Proteus mirabilis, Campylobacter
jejuni, Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Klebsiella aerogenes
a
b
e coliformi non noti.
ZC50/R30858301..................................50 test
ZC52/R30858302............................... 200 test
Numero di codice
Dispositivo medico per la diagnostica in vitro
Consultare le Istruzioni per l’uso (IFU)
Limiti temperatura (Temp. conservazione)
Codice lotto (numero lotto)
Data di scadenza
Tabella 2
Identificazione delle Salmonelle su brodo di selenite
fabbricante
Metodo di coltura routinaria
Wellcolex*
Colour
Salmonella
Positivo
Negativo
Positivo
114
1
115
Bronidox® è il nome commerciale registrato di Cognis UK Ltd.
Negativo
7b
305d
312
*marchio registrato.
Totale
121
306
427
a
c
Totale
57 di gruppo B, 27 di gruppo C, 19 di gruppo D, 8 di gruppo E, 1 di
gruppo G, 1 di gruppo D/Vi e 1 mista C/E da cui sono state isolate
entrambe.
b
1 di gruppo B, 2 di gruppo C e 4 di gruppo D, tutti identificati
mediante Wellcolex* Colour Salmonella dopo ulteriore
sottocoltura.
c
Citrobacter freundii (reazione gruppo E/G); stessa reazione
osservata in coltura su piastra.
d
Comprende Proteus spp., Citrobacter freundii, Escherichia coli,
Klebsiella aerogenes, Enterobacter spp., Shigella sonnei e coliformi
non noti.
a
IFU X7828 revisione agosto 2012
BIBLIOGRAFIA
1
2
3
Advisory Committee on Dangerous Pathogens. (1984).
Categorisation of Pathogens According to Hazard and Categories
of Containment, H.M.S.O., London.
Ewing, W.H. (1986). Edwards and Ewing’s Identification of
Enterobacteriaceae, 4th Ed., Elsevier Science Publishing Co., Inc.
New York.
Miller, J.M. and Holmes, H.T. (1995). Specimen Collection,
Transport and Storage. Manual of Clinical Microbiology, 6th Ed.,
Edited by Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C. and
Remel Europe Ltd.
Clipper Boulevard West, Crossways
Dartford, Kent, DA2 6PT
UK
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