Relationship between fertilization rate and early

Relationship between fertilization rate and early apoptosis in sperm population
of infertile individuals
Andrologia 2014;46:36-41; DOI: 10.1111/and.12038
M. TAVALAEE (1), M.R. DEEMEH (1,2), M. ARBABIAN (1), A. KIYANI (1) & M.H. NASR-ESFAHANI (1,2,3)
(1) Department of Reproduction and Development, Reproductive Biomedicine Research Center, Royan
Institute for Biotechnology, ACECR, Isfahan, Iran; (2) Isfahan Fertility and Infertility Center, Isfahan, Iran; (3)
Department of Embryology, Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Reproductive
Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran
Correspondence to: M.H. Nasr-Esfahani, Department of Reproduction and Development, Reproductive
Biomedicine Research Center, Royan Institute for Biotechnology, ACECR, Isfahan, Iran; and Department of
Embryology, Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine,
A C E C R , Te h ra n , I ra n . Te l . : + 9 8 3 1 1 9 5 1 5 6 9 6 ; Fa x : + 9 8 3 1 1 9 5 1 5 6 9 9 ; E - m a i l : m h . n a s [email protected]
Integrity of the sperm membrane, of which phosphatidyl serine (PS) plays a central role, is essential for
fertilization. The externalisation of PS (EPS) occurs during capacitation and the acrosome reaction. EPS, from
the inner to the outer membrane, is considered as a sign of early apoptosis. Therefore, EPS may have a dual
function in sperm. This study has evaluated the relationship between EPS and fertilization, embryo quality
and pregnancy outcomes in couples who were candidates for ICSI. Semen samples were collected from 43
ICSI candidates and assessed according to World Health Organization guidelines for semen parameters. EPS
was assessed by Annexin V and propidium iodide (PI) staining. Protamine deficiency was assessed by
chromomycin A3 (CMA3) staining. A significant positive correlation was observed between the percentages of
fertilization and annexin-positive PI-negative (An+PI-) sperm. There was a significant negative correlation
between the percentages of protamine-deficient sperm with the percentage of fertilization. In addition, the
percentage of An+PI- sperm in individuals with fertilization rates higher and lower than 50% significantly
differed. The percentage of annexin-positive PI-positive (An+PI+) sperm in semen of the partners of pregnant
women significantly differed from the partners of nonpregnant women. In conclusion, if An+PI- is a sign of
capacitation and An+PI+ is a sign of apoptosis, the results suggest that semen samples with a higher ability
to undergo capacitation have a higher chance to result in successful fertilization post-ICSI. The presence of a
high percentage of apoptotic sperm in the insemination sample before capacitation may reduce the chances
of pregnancy.
La correlazione tra la frequenza di fertilizzazione e l’apoptosi precoce nella popolazione degli
spermatozoi di individui infertili
L’integrità della membrana degli spermatozoi, in cui la fosfaditil serina (PS) gioca un ruolo centrale, è
essenziale per la fertilizzazione. L’esternalizzazione della PS (EPS) avviene durante la capacitazione e la
reazione acrosomiale. L’EPS, dall’interno all’esterno della membrana, è considerato un segno di apoptosi
precoce. Pertanto l’EPS può avere una doppia funzione negli spermatozoi. Questo studio ha valutato la
correlazione tra l’EPS e la fertilizzazione, la qualità dell’embrione e l’esito della gravidanza nelle coppie che si
candidarono all’ICSI. Furono raccolti i campioni del seme di 43 candidati all’ICSI e furono analizzati secondo
le linee guida del World Health Organisation per i parametri seminali. L’EPS fu determinata tramite la
colorazione per l’Annessina V e lo ioduro propidio (PI). La carenza di protamina fu determinata tramite la
colorazione con cromomicina A3 (CMA3). Fu osservata una significativa correlazione tra la percentuale di
fertilizzazione e gli spermatozoi annessina-positivi e PI-negativi (An+PI-). Ci fu una correlazione
significativamente negativa tra la percentuale di spermatozoi carenti di protamina e la percentuale di
fertilizzazione. Inoltre, la percentuale degli spermatozoi An+PI- negli individui con rapporto di fertilizzazione
maggiore o minore del 50% era significativamente differente. La percentuale degli spermatozoi annessinapositivi e PI-positivi (An+PI+) nel seme dei compagni delle donne gravide differì significativamente da quello
dei compagni delle donne non gravide. In conclusione, se la An+PI- è un segno di capacitazione e se la An+P+
è un segno di apoptosi, i risultati suggeriscono che i campioni di sperma con una maggiore capacità di
andare a capacitazione hanno una maggiore possibilità di dare luogo al successo della fertilizzazione dopo
l’ICSI. La presenza di un’alta percentuale di spermatozoi apoptotici nei campioni per l’inseminazione prima
della capacitazione può ridurre le possibilità della gravidanza.
Il commento - Il limite fondamentale dello studio è il suo svolgimento solo su soggetti disfertili per ragioni
presumibilmente diverse che non vengono descritte e che sono dovuti ricorrere al centro ICSI, sebbene con
quadri spermatici anche molto diversi tra loro per concentrazione, mobilità e integrità morfologica degli
spermatozoi. Il riferimento ai criteri di definizione del quadro spermatico WHO 2010 lascia aperti diversi
interrogativi per i bassi limiti che esso prevede per la normozoospermia e in assenza di dati non possiamo
verificare come si stratifichino i campioni rispetto ai tre citati parametri fondamentali e infatti il campione ha
una ampissima oscillazione per la concentrazione (media: 63±48 mil/ml) e la motilità ( media: 53±18 %) ma
una bassissima normalità morfologica (94±4 %) che è in realtà l’unico dato che accomuna il campione e
giustifica l’accesso alla ICSI. Ne consegue che lo studio non può estendere, ma probabilmente non se lo sono
prefisso gli Autori, i dati a condizioni differenti di integrità per quanto compatibili con la presenza di disfertilità
più o meno importante e alla condizione di reale normofertilità. In ogni caso lo studio dimostra aspetti
importanti per la scelta di ricorso alla ICSI una volta accertato un quadro di grave alterazione morfologica
degli spermatozoi, o meglio per la previsione di successo della ICSI in tali condizioni. Infatti uno dei grandi
problemi per le coppie che ricorrono alla ICSI e il rischio di insuccesso che è tanto maggiore quanto maggiori
e importanti sono le alterazioni non solo morfologiche dello spermatozoo e molte di queste non sono
neanche selezionabili ai grandissimi ingrandimenti (analisi peraltro costosa e difficile) che taluni centri
impiegano. Poter testare in via preliminare la qualità biochimica degli spermatozoi è un atto importante che
può evitare ICSI che non abbiano praticamente possibilità di successo. I tre dati importanti che emergono
dallo studio sono la buona possibilità di capacitazione (la condizione che mette lo spermatozoo di reagire con
l’ovocito), determinata dalla EPS e valutata con la colorazione per l’assessina V (maggiore la colorazione,
maggiore la capacità), la bassa propensione alla apoptosi o autodistruzione, determinata con la colorazione
per l’IP (minore la colorazione, minore la propensione), l’integrità della struttura del DNA valutata con la
colorazione per l’assenza di protamina con la CMA3 (maggiore la colorazione, minore la protamina e quindi
maggiore il danno al DNA). Da essi emerge la alta correlazione tra la propensione alla costituzione e
progressione della gravidanza e, come attendibile, il minore danno degli spermatozoi determinato dalla
presenza di EPS (capacitazione), assenza di apoptosi, integrità del DNA (presenza della protamina)... certo
non basta, soprattutto l’ultimo dato in cui la protamina può essere adeguatamente presente ma può esistere
uno squilibrio di metilazione o di DNA frammentato o mutato con esiti negativi per il successo della
gravidanza e possibili problemi per il “nuovo uomo”. In ogni caso queste determinazioni sono un metodo
relativamente semplice di cui è bene che i Centri di fecondazione assistita siano dotati per una migliore
selezione della candidature delle coppie alla alle diverse tecniche o per la loro completa esclusione.