(Microsoft PowerPoint - ICSI.ppt [modalit\340 compatibilit\340])

TECNICA
ICSI
Laboratorio di Biologia della
Riproduzione
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ICSI – Intra Cytoplasmatic Sperm Injection
Recente procedura risalente agli inizi degli anni ‘90
che permette di iniettare con una micropipetta in vetro
un singolo spermatozoo direttamente nel citoplasma
ovocitario
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ICSI – Intra Cytoplasmatic Sperm Injection
Alterazione ovocitaria
Iniezione
Aspirazione citoplasma
PVP
Alterazione spermatica
PVP
Aspirazione
Fuoriuscita del citoplasma
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ICSI – Intra Cytoplasmatic Sperm Injection
Preparazione campione seminale
Decumulazione degli ovociti da pickup
Preparazione piastra ICSI
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ICSI – Tecnica
Pulizia degli ovociti
0,5 mL
Terreno tamponato
Azione chimica
Azione
meccanica
0,05 mL
yase 80 UI
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ICSI – Sistema di micromanipolazione
Microscopio invertito
A 4x, 10x, 20x, 40x magnificatio
Modulazione a contrasto di Hoffman
Piastra termostatata
Assicura un controllo della temperatura a 37°C
Color video
Permette ai visitatori di vedere la procedura di
micromanipolazione
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ICSI – Sistema di micromanipolazione
Due manipolatori (uno per la holding, uno per la
injection), per muovere le pipette nello spazio, sugli assi
X,Y,Z; lo scopo è di posizionare rapidamente le
micropipette prima di procedere ad una fine
manipolazione. Il sistema di manipolazione può essere
elettrico o idraulico
2. I micromanipolatori permettono di trasformare grandi
movimenti in spostamenti fini per l’iniezione della
cellula. La micromanipolazione lungo gli assi X,Y è
permessa muovendo il joystick in direzione orizzontale
(destra o sinistra); lungo l’asse Z (direzione verticale)
muovendo l’estremità del joystick
1.
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ICSI – Sistema di micromanipolazione
Aspirazione e Iniezione
La pipetta holding e la injection sono fissate all’estremità
dell’holder, connessa con i microiniettori riempiti di
olio.
Evitare la formazione di bolle
I microaghi: in vetro; il diametro interno e quello
esterno sono molto importanti per ridurre il danno
ovocitario durante l’iniezione
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ICSI – Sistema di micromanipolazione
Microaghi
Injection: 5 – 7 µm di diametro con o senza spike
Holding: 60 – 80 µm di diametro esterno e 10 – 20 µm di
diametro interno
Entrambi gli aghi sono inclinati di 30° - 45° per
permettere un angolo di iniezione parallelo al piano di
lavoro
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ICSI – Tecnica
ICSI disco Petri
Le gocce sono coperte
con olio minerale
Microgocce di
terreno
tamponato
PVP
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ICSI – Tecnica
PVP: facilita la manipolazione dello spermatozoo e
permette un buon controllo dello stesso nella pipetta
da injection
Terreno tamponato: medium che riduce le variazioni
di pH
Olio minerale: previene l’evaporazione del medium
mantenendo una corretta osmolarità
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ICSI – Tecnica
Immediatamente prima di eseguire l’ICSI diluire 1 µL
di sospensione spermatica nel PVP
L’ovocita è trasferito in una goccia di terreno
tamponato
Selezionare al microscopio un singolo spermatozoo
con morfologia apparentemente normale
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ICSI – Tecnica
Immobilizzazione
Per eseguire l’immobilizzazione, lo spermatozoo viene messo
trasversalmente alla pipetta, quindi viene bloccato schiacciandolo sul
fondo della piastra e attivato con dei movimenti lungo l’asse
L’immobilizzazione dello spermatozoo è una
tecnica importante nella procedura ICSI perché
induce la permeabilizzazione della membrana
spermatica, permettendo la successiva
decondensazione nucleare necessaria alla
fertilizzazione dell’ovocita
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ICSI – Tecnica
Aspirazion
e
Lo spermatozoo immobilizzato viene
aspirato dalla coda nella pipetta injection
che viene spostata nella goccia contenente
l’ovocita
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ICSI – Tecnica
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Microiniezione intracitoplasmatica
dello spermatozoo (ICSI)
Quando viene consigliata?
Infertilità maschile di grado severo
Azoospermia ostruttiva e secretiva (spermatozoi
testicolari o epididimali)
Mancata o ridotta fertilizzazione in precedenti cicli di
fertilizzazione in vitro (FIV)
Ovociti scongelati
Ridotto numero di ovociti
Seme crioconservato in relazione alla qualità seminale
successiva allo scongelamento
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