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ITTIOPATOLOGIA, 2009, 6: 5-16
MONOGRAFIE
Sperimentazione nelle specie ittiche:
indicazioni procedurali e prospettive
Animal testing on ichthyic species:
procedures and perspectives
Fabio Marino1*, Annamaria Passantino1, Battesimo Macrì1,
Giuseppe Bovo2, Amedeo Manfrin2
1
Centro di Ittiopatologia Sperimentale della Sicilia, Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria,
Polo Universitario dell’Annunziata - 98168 Messina; 2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale
delle Venezie, Viale dell’Università, 10 - 35020 Legnaro (PD).
______________________________
RIASSUNTO – Gli autori analizzano lo stato dell’arte nell’ambito della sperimentazione su specie ittiche, alla
luce della normativa vigente e delle recenti acquisizioni in ambito di benessere animale.
Vengono fornite alcune indicazioni procedurali per l’espletamento di attività sperimentali su pesci e
considerazioni sull’argomento, frutto di esperienze di campo. Infine, viene sottolineata l’opportunità di ricorrere,
ove possibile, nel prossimo futuro, ai così detti metodi alternativi per una graduale sostituzione dei modelli
animali.
SUMMARY – Authors give a picture of the state of the art in the field of animal testing on ichthyic species in the
light of law in force and recent acquisitions in the field of animal welfare.
Some procedure suggestions are provided to help in performing experimental activities on fish, as well as some
considerations on this topic as a result of field experience. Finally the need to use the so called alternative
methods, where possible, in the next future, is underlined to substitute gradually the animal models.
Key words: Animal testing; Fish; Law; Welfare; Protection.
________________________________
* Corresponding Author: c/o Centro di Ittiopatologia Sperimentale della Sicilia, Dipartimento di Sanità Pubblica
Veterinaria, Polo Universitario dell’Annunziata - 98168 Messina. Tel.: 090-3503711; Fax: 090-3503951; E-mail:
[email protected].
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INTRODUZIONE
L’uso degli animali nelle procedure scientifiche, rimane a tutt’oggi di fondamentale
importanza per garantire il progresso della scienza, al fine di permettere un miglioramento
della salute e del benessere umano e animale1, 2, nonché di tutelare maggiormente il
patrimonio ambientale.
A tal riguardo l’art. 3 del D.L.vo 116/92, stabilisce che “l’utilizzazione degli animali negli
esperimenti” è consentita solo per:
a) lo sviluppo, la produzione e la prova di qualità, di efficacia e di innocuità dei
preparati farmaceutici, degli alimenti e di quelle altre sostanze o prodotti che
servono
1) per la profilassi, la diagnosi o la cura di malattie, di cattivi stati di
salute o di altre anomalie o dei loro effetti sull’uomo, sugli animali o
sulle piante;
2) per la valutazione, la rilevazione, il controllo o le modificazioni
delle condizioni fisiologiche nell’uomo, negli animali o nelle piante;
b) la protezione dell’ambiente naturale nell’interesse della salute e del
benessere dell’uomo e degli animali.
Vi sono validi motivi che giustificano la scelta di differenziare l’uso degli animali a
seconda della specie di appartenenza, soprattutto in virtù della loro prossimità genetica con
l’essere umano. Benché tale prossimità faccia di alcune specie di primati non umani le
uniche adatte a determinati tipi di esperimenti, è pur vero che per altri modelli sperimentali
possono essere utilizzati anche i pesci (Kane et al., 1996; Li et al., 2005; Baldessari &
Mione, 2008; Mione et al., 2008; Nourizadeh-Lillabadi et al., 2009). A dimostrazione di ciò,
in Italia nell’ultimo decennio il numero delle specie ittiche utilizzate nella ricerca è
notevolmente aumentato (Grafico 1).
Numero di pesci
2006
2005
2004
Numero di pesci
2003
2002
2001
0
5000
10000
15000
20000
Grafico 1 - Numero di pesci utilizzati nella sperimentazione negli anni compresi tra il 2001-2006.
Graphic 1 – Number of fish using for the experimentation between 2001-2006.
1
Parere del comitato scientifico di tossicologia, ecotossicologia e ambiente (CSTEE) sulla relazione BUAVECEAE “The way forward – Action to end animal toxicity testing”, adottato l’8 gennaio 2004 (http://ec.europa.
eu/health/ ph_risk/committees/sct/documents/out217_en.pdf).
2
Parere del comitato scientifico dei rischi sanitari e ambientali sulla relazione “Endocrine Disrupting Chemicals:
a Non-animal Testing Approach”, adottato il 25 novembre 2005 (http://ec.europa.eu/health/ph_risk/committees/
04_scher/ docs/scher_o_015.pdf).
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Sulla base di tali considerazioni, il benessere dei pesci utilizzati a fini sperimentali
dovrebbe ricevere una maggiore attenzione stante che, tra l’altro, alcune procedure
sperimentali messe in atto potrebbero essere invasive e, pertanto, causare danni tessutali
comportando quello che, per gli esseri umani, è definito dolore. È ampiamente riconosciuta,
infatti, la capacità del pesce di provare sensazioni assimilabili a quelle del dolore nei
mammiferi (Mattioli et al., 1995; 1997; Topál & Csányi, 1999; Rose, 2002; Jackson, 2003;
Sneddon, 2003; Braithwaite & Huntingford, 2004; Chandroo et al., 2004; Braithwaite &
Boulcott, 2007); sono, inoltre, disponibili nuove conoscenze scientifiche sui fattori che
influenzano il benessere dei pesci.
Per tale motivo è necessario migliorare il loro benessere qualora fossero impiegati nelle
procedure scientifiche, rafforzando le norme minime di tutela in linea con le più recenti
scoperte.
In linea di massima a livello europeo le linee-guida e le disposizioni legislative, laddove
esistono, sono molto più tolleranti verso l’uso di pesci rispetto ai mammiferi (come ad es. i
test sulla DL50) (Braunbeck et al., 2005).
Scopo del presente contributo è quello, attraverso un esame della disciplina vigente, di
evidenziare come la legislazione, a nostro parere, vada integrata sia dal punto di vista della
conduzione che da quello del mantenimento degli animali e della predisposizione di
strutture, tecnologie e condizioni ambientali adeguate agli organismi acquatici.
SPECIE ITTICHE UTILIZZATE A FINI SPERIMENTALI
Numerose specie di teleostei trovano da tempo l’interesse dei ricercatori, in quanto
consolidati modelli animali per lo studio di differenti tematiche.
Lo zebrafish (Danio rerio) rappresenta uno dei modelli animali più importanti per la
ricerca biomedica dopo i primati ed i roditori e sta, altresì, assumendo un ruolo sempre più
predominante in ambito scientifico, non solo nello studio delle tematiche connesse alla
biologia dello sviluppo, ma anche nello studio di malattie cardiovascolari (Stainier et al.,
1996; Xu et al., 2002), visive (Goldsmith & Harris, 2003), renali (Drummond, 2005),
neoplastiche (Goessling et al., 2007), così come nella ricerca farmaceutica (Goldsmith,
2004) e, recentemente, nella ricerca sulle patologie neurologiche, neurodegenerative e
neuromuscolari, come il morbo di Alzheimer (Best & Alderton, 2008) ed il morbo di
Parkinson (Bretaud et al., 2007), la distrofia muscolare di Duchenne (Basset & Currie, 2003)
e sui meccanismi genetici causa di patologie umane congenite. I fenotipi di questa specie,
ottenuti mediante mutagenesi diretta, simulano diverse anomalie che si manifestano durante
lo sviluppo umano (Dooley & Zon, 2000).
Il pesce rosso (Carassius auratus) è ampiamente utilizzato per studi sulla rigenerazione dei
tessuti e sull’ipossia; inoltre, rappresenta il migliore modello animale per lo studio dei tumori
delle guaine dei nervi periferici (PNSTs) (Marino et al., 2007).
Gli ibridi di platy (Xiphophorus maculatus) e xifoforo (X. helleri) sviluppano melanosi in
F1 e melanomi in F2.
La tilapia (Oreochromis niloticus) trova applicazione in molti studi che necessitano del
ricorso a specie termofile, in quanto vivono a temperature prossime a quelle dei vertebrati
superiori.
I killifish, infine, per via della loro vita molto breve, si prestano molto bene per studi sulla
senescenza.
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PROCEDURE SPERIMENTALI SOTTOPOSTE AD AUTORIZZAZIONE IN DEROGA
Come già accennato, le sperimentazioni soggette alla normativa e che necessitano di
autorizzazione del Ministero sono tutte quelle che possono comportare sofferenza, dolore o
stress eccessivo all’animale utilizzato. Rientrano ad esempio tra queste attività sperimentali
l’induzione di malattia, gli studi sul cancro, i test di farmaci e di rimedi profilattici, le prove
di tossicità, la produzione di animali transgenici, le amputazioni.
Non vanno, quindi, intese come sperimentazioni tutte quelle pratiche attuate
quotidianamente negli impianti o nelle “fish facilities” sperimentali o che, comunque, non
comportino dolore e sofferenza quali l’anestesia, i prelievi di sangue, l’eutanasia, le prove di
ingrasso con mangimi commerciali licenziati, la stabulazione di pesci, la detenzione di
transgenici, le terapie e gli studi di farmacodinamica.
VALUTAZIONE DEL BENESSERE DEI TELEOSTEI NELLA SCIENZA DEGLI
ANIMALI DA LABORATORIO
Van Zutphen et al. (1996) sostengono che la scienza degli animali da laboratorio
comprende lo studio della loro biologia, delle loro necessità di allevamento ed ambientali, la
standardizzazione delle procedure genetiche, la prevenzione ed il trattamento delle malattie,
ovvero l'ottimizzazione delle tecniche sperimentali e il miglioramento dell'anestesia,
analgesia ed eutanasia.
Per contribuire alla qualità di una sperimentazione e al benessere degli animali utilizzati, è
necessario selezionare modelli sempre più idonei e in grado di riprodurre le patologie umane,
studiandone la genesi e mettendo a punto terapie innovative.
Sulla base della Raccomandazione della Commissione del 18 giugno 2007, relativa alle
linee guida per la sistemazione e la tutela degli animali impiegati ai fini sperimentali o ad
altri fini scientifici, sono state delineate misure specifiche per alcune specie di pesci, quali
trota iridea (Oncorhynchus mykiss), salmone Atlantico (Salmo salar), tilapia (Oreochromis
niloticus), zebrafish (Danio rerio), branzino (Dicentrarchus labrax), ippoglosso
dell’Atlantico (Hippoglossus hippoglossus), merluzzo bianco (Gadus morhua), rombo
(Scophthalmus maximus) e pesce gatto africano (Clarias gariepinus).
Al fine di una corretta stabulazione di questi animali e affinché, al momento del loro
arrivo, possano essere predisposte strutture e procedure di manutenzione più adatte, i
ricercatori o gli addetti ai lavori dovrebbero essere ben formati e preparati sulle loro
caratteristiche biologiche, fisiologiche e comportamentali.
Lo stato di salute dei pesci è legato alle condizioni ambientali e di manutenzione e gran
parte delle malattie sono associate allo stress (Iwama et al., 2006). Pertanto, nei teleostei
l’ambiente gioca un ruolo molto importante.
È necessario disporre continuamente di acqua di buona qualità (Casebolt et al., 1998), per
ridurre lo stress ed il rischio di malattie e in quantità sufficiente in modo tale da consentire ai
pesci di disporre di spazio adeguato alle necessità di movimento (Huntingford et al., 2006).
E’ necessario dotare lo Stabilimento Utilizzatore di un sistema per il trattamento delle acque
reflue ed eventualmente, ove possibile, il riutilizzo delle stesse, dopo opportuna depurazione,
per limitare la diffusione di patogeni o residui pericolosi nell’ambiente.
I parametri relativi alla qualità dell’acqua che giocano un ruolo di fondamentale
importanza nel mantenimento dei teleostei stabulati, sono rappresentati da:
Temperatura: va mantenuta entro l’intervallo ottimale per ciascuna specie interessata e
le eventuali modifiche, per esigenze di sperimentazione, devono essere introdotte
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gradualmente. I pesci sono animali eterotermi, per cui non dovrebbero essere soggetti a
bruschi cambiamenti della temperatura, in particolare verso valori elevati. Come è noto,
tutte le funzioni vitali sono influenzate dalla temperatura corporea ed il grado di queste
varia con la temperatura dell’acqua. È necessario, quindi, conoscere anche le richieste
specie specifiche dei pesci ospitati per garantire un range di temperatura ottimale per le
funzioni normali e per la salute.
Ossigeno: la sua concentrazione dovrebbe essere compatibile con le specie interessate
ed il contesto nel quale vivono. Essa varierà in funzione della temperatura, della
concentrazione di anidride carbonica, della salinità, dei livelli di nutrimento e della
necessità di maneggiare gli animali. Particolare attenzione va posta per evitare l’ipossia
ambientale, in considerazione anche delle differenze interspecifiche nella suscettibilità
ai bassi livelli di ossigeno disciolto.
Composti azotati: l’ammoniaca è il principale prodotto di escrezione dei pesci. Il
mangime e le feci sono convertiti in composti inorganici come ammoniaca e fosfati;
l’ammoniaca viene ulteriormente convertita in nitriti (estremamente tossici) e nitrati.
Anidride carbonica (CO2): i pesci producono anidride carbonica durante la
respirazione; questa si dissolve in acqua e forma acido carbonico che tende a ridurre il
pH.
pH: il mantenimento di livelli adeguati del pH dipende da molti fattori connessi alla
qualità dell’acqua, tra cui il tenore di anidride carbonica, di calcio e la salinità. Il pH
deve mantenersi il più possibile stabile. In generale può essere più basso nelle acque
dolci rispetto a quelle salate. Va ricordato che le variazioni del pH possono avere
influenze sulla tossicità di alcuni metalli pesanti (ad esempio l’alluminio).
Salinità: varia in funzione del fatto che i pesci siano di acqua dolce, salata o salmastra.
Alcune specie possono tollerare gradi di salinità molto diversi, ma comunque vanno
sempre evitati gli shock osmotici.
Dovranno essere altresì presi in considerazione l’illuminazione (molte specie ittiche hanno
bisogno di luce per nutrirsi e per altre attività comportamentali e, quindi, occorre prevedere
un fotoperiodo adeguato) e il rumore. Considerato che i pesci possono essere estremamente
sensibili ai suoni, anche se molto bassi, nelle strutture adibite agli esperimenti il livello del
rumore deve essere mantenuto al minimo.
Altro fattore che può influire sul comportamento dei pesci è la stabulazione in acquari di
dimensioni non adeguate, in quanto è fortemente influenzato dalla densità di popolazione.
Occorre tener presente il comportamento territoriale e la gerarchia presente all’interno del
branco. La densità di popolazione deve essere determinata in base alle esigenze complessive
dei pesci rispetto alle condizioni ambientali e delle specifiche specie in studio. Occorre
evitare o ridurre al minimo episodi di aggressività tra animali della stessa specie, per non
compromettere il benessere degli stessi (Chandroo et al., 2004). I gruppi dovrebbero essere
preferibilmente costituiti da individui di uguale dimensione per ridurre al minimo il rischio
di lesioni o di episodi di cannibalismo.
Altro fattore che può causare stress nel mantenimento dei teleostei utilizzati per fini
sperimentali è la manipolazione, che va limitata il più possibile. In genere i pesci dovrebbero
essere anestetizzati in un contenitore più piccolo prima di essere manipolati solo per il tempo
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necessario alla prova e dovrebbero essere successivamente collocati in acqua pulita e aerata
nelle fasi di risveglio.
Di seguito, viene fornito un esempio di protocollo da seguire nell’utilizzo di pesci per fini
sperimentali.
Checklist (da Brattelid & Smith, 2000)
- Selezione del pesce
- Scelta della specie, stock, tipo di allevamento, mutamenti genetici, stadio di
sviluppo, età, sesso (se possibile);
- Taglia;
- Stato di salute (preferibile un periodo di quarantena)
- Lunghezza del periodo di osservazione;
- Tipo di monitoraggio.
- Ambiente
- Parametri da monitorare e metodologia usata;
- Determinazioni, fluttuazioni e durata.
- Holding facilities
- Procedure di manipolazione
- Patogeni
- Profilassi;
- Lista di patogeni da monitorare includendo la scelta del metodo:
Lista di patogeni da evitare
Lista di patologie da evitare
Decorso acuto o cronico della malattia
Numero di pesci necessari per necroscopia
- Malattie non infettive
- Lista delle malattie da monitorare includendo la scelta del metodo
Valutazione dello stato di nutrizione
Numero di pesci necessari per necroscopia
- Benessere
- Comportamento;
- Densità.
STATO DELL’ARTE
Attualmente il Decreto Legislativo n. 116 del 27 gennaio 1992, che recepisce la Direttiva
n. 86/609/CEE in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri
fini scientifici, costituisce il principale punto di riferimento legislativo sull’argomento
(Passantino et al., 2005).
Dalla sua adozione ad oggi sono stati compiuti considerevoli progressi nelle tecniche
sperimentali e sono emersi nuovi dati scientifici sulla capacità degli animali di provare
dolore e sofferenza. Inoltre, molte delle norme ivi contenute sono aperte a libera
interpretazione3 e pertanto, propongono orientamenti invece di tendere all’armonizzazione.
3
Vedasi, ad esempio, il campo di applicazione troppo generico. Sarebbe, invece, auspicabile inserire la locuzione
“pesci definiti come vertebrati acquatici inferiori”.
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Ad esempio, la “vetusta” direttiva, nonché il D.L.vo, non fanno esplicito riferimento, né
garantiscono la piena applicazione del principio “delle tre R” ("Replacement, Reduction and
Refinement" - sostituzione, riduzione e perfezionamento), benché esso sia ora accettato come
il principio cardine in questo settore 4. Infatti, è stato possibile ridurre il numero degli animali
usati nella sperimentazione utilizzando metodi alternativi e riducendo il livello di sofferenza
degli animali impiegati (Passantino, 2008).
Dal 1986 ad oggi, la Direttiva non ha subito sostanziali modifiche; solo recentemente il
Parlamento Europeo ha invitato la Commissione a presentare una proposta di revisione della
direttiva con misure più rigorose e trasparenti nel settore della sperimentazione animale. Tale
proposta è volta ad assicurare, in tutta l’Unione Europea, condizioni di parità per le imprese
ed i ricercatori, rafforzando nello stesso tempo la protezione degli animali ancora usati nelle
procedure scientifiche in conformità al protocollo sul benessere degli animali del trattato
CE5, nonché migliorare il benessere di tutti gli animali che, ogni anno, vengono utilizzati
nella Comunità.
A tutt’oggi gli esperimenti possono aver luogo soltanto negli stabilimenti utilizzatori
autorizzati. Chiunque intende porre in esercizio uno stabilimento utilizzatore deve ottenere la
preventiva autorizzazione del Ministero della Salute (oggi Ministero del Lavoro, della Salute
e delle Politiche Sociali). L'autorizzazione è concessa se gli stabilimenti utilizzatori sono
dotati di impianti e attrezzature adeguate alle specie animali utilizzate e agli esperimenti che
vi sono effettuati, previo nulla-osta igienico sanitario da parte dell’AUSL competente per
territorio.
Gli esperimenti devono essere eseguiti, direttamente o sotto la loro diretta responsabilità,
da laureati in medicina e chirurgia, medicina veterinaria, biologia, scienze naturali o da
persone munite di altro titolo riconosciuto idoneo ed equivalente (art. 4, comma 5)
(Passantino et al., 2005).
Le persone che effettuano esperimenti o quelle persone che si occupano direttamente o con
compiti di controllo di animali utilizzati in esperimenti, devono avere un'istruzione e una
formazione adeguata.
La persona che esegue l'esperimento o ne ha la supervisione deve, inoltre, avere una
formazione scientifica attinente alle attività sperimentali di sua competenza ed essere in
grado di manipolare e curare gli animali da laboratorio, ivi compresi i pesci. Infatti, spesso
procedure routinarie di manipolazione effettuate da personale non adeguatamente preparato
possono essere causa di mortalità; inoltre, dovrebbero essere manipolati in modo tale da
minimizzare i danni alla barriera muco-cutanea (ad esempio miopatie nei salmonidi) e le
stimolazioni visive, ossia i pesci dovrebbero essere protetti da luce diretta (Hubbs et al.,
1988); non dovrebbero essere esposti fuori dall’acqua per più di 30 secondi (Ferguson &
Tufts, 1992) anche se, alcune specie, come il pesce gatto e le anguille, possono tollerare
periodi più lunghi fuori dall’acqua.
Chiunque utilizza animali da esperimento deve provvedere a che:
a) - gli animali siano tenuti in un ambiente che consente una certa libertà di
movimento e fruiscano di alimentazione e cure adeguate alla loro salute e al loro
benessere: per quanto riguarda la densità della popolazione, essa va determinata
correttamente specie per specie, in quanto può variare anche notevolmente ed è
difficile indicare dei valori soglia validi per tutti;
4
L’importanza attribuita al benessere degli animali si sta trasformando in preoccupazione etica per divenire un
“atteggiamento culturale” della società europea, come riconosciuto dal protocollo sulla protezione ed il benessere
degli animali del trattato CE, che considera gli animali esseri senzienti. Esso richiede alla Comunità e agli Stati
membri di tenere pienamente conto del benessere animale, ma le disposizioni della direttiva ormai non rispettano
più questo obbligo.
5
Vedere G.U. C 340 del 10.11.1997, pag. 110.
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b) - sia ridotta al minimo qualsiasi limitazione alla possibilità di soddisfare ai bisogni
fisiologici e comportamentali dell'animale;
c) - siano effettuati controlli quotidiani per verificare le condizioni fisiche in cui gli
animali sono tenuti, allevati o utilizzati;
d) - un medico veterinario controlli il benessere e le condizioni di salute degli
animali, allo scopo di evitare danni durevoli, dolore, inutili sofferenze o angoscia;
e) - siano adottate le misure dirette a correggere tempestivamente difetti o sofferenze
eventualmente constatati.
Gli esperimenti devono essere effettuati in modo da evitare angoscia e sofferenza o dolore
inutili agli animali. Un medico veterinario deve controllare la corretta esecuzione delle
procedure di esperimento e al termine decidere se l'animale debba essere mantenuto in vita o
soppresso.
Chiunque intende effettuare esperimenti deve darne comunicazione al Ministero, indicando
la sede dello stabilimento utilizzatore e producendo a corredo la documentazione atta a
dimostrare che l’esperimento è necessario per effettuare un progetto di ricerca mirato ad uno
dei fini di cui sopra, che siano assicurate le condizioni previste e ne invia copia anche alla
Regione, alla Prefettura, al Comune e alla AUSL competenti per il territorio. Per le
Università ricorre l’obbligo di inviare copia anche al Responsabile del Servizio Veterinario
Centralizzato per la protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali.
I progetti di ricerca, che non siano relativi a ordinarie prove di qualità, efficacia e
innocuità, hanno durata massima di tre anni; ove si preveda che tale termine non sia
sufficiente, l'interessato un anno prima della scadenza chiede al Ministero l'autorizzazione
alla prosecuzione dell'esperimento.
Ogni sperimentazione va annotata in un apposito registro, vidimato dal Ministero o
dall’UVAC e custodito dal Responsabile dello Stabilimento Utilizzatore.
Le prove diagnostiche e medico veterinarie, che prevedono impiego di animali, devono
essere eseguite conformemente alle disposizioni del presente decreto, previa comunicazione
alla AUSL competente per territorio.
CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE
La presente nota vuole richiamare l’attenzione degli operatori del settore, fornendo loro
una guida comportamentale e procedurale per effettuare ricerche sperimentali ai sensi della
normativa vigente, aggiungendo alcuni elementi utili, frutto di esperienze personali.
Quasi sempre i pesci utilizzati devono, per ragioni pratiche, essere tenuti sotto un certo
controllo fisico, in vasche che variano per tipologia e dimensione, in uno stabulario
riconosciuto.
È fondamentale che i pesci dispongano di spazio sufficiente e quindi che le vasche
contengano una biomassa proporzionata.
Nel regolare la temperatura dei locali si dovrebbe tener conto delle eventuali modifiche
della termoregolazione degli animali, dovute a particolari condizioni fisiologiche e agli
effetti degli esperimenti. Ogni specie ittica ha un suo specifico range di temperatura ottimale
che va assolutamente rispettato.
Nei locali sprovvisti di finestre, occorre fornire un'illuminazione artificiale controllata, sia
per rispettare le esigenze biologiche degli animali, sia per fornire un soddisfacente ambiente
di lavoro. È parimenti necessario controllare l'intensità luminosa e il ciclo luce/buio. Per gli
animali albini si dovrà tener conto della loro particolare sensibilità alla luce.
Si raccomanda l’adozione di un impianto di allarme nelle vasche dei pesci in caso di
interruzione del rifornimento d'acqua, di un gruppo elettrogeno che si azioni in caso di
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black-out o di gruppi di continuità (UPS). I pesci, gli anfibi e i rettili presentano una
tolleranza molto varia da specie a specie, nei confronti dell'acidità, del cloro e di altri
prodotti chimici. Per tali ragioni occorre adottare disposizioni per rifornire gli acquari con
una quantità di acqua proporzionata al fabbisogno e alla soglia di tolleranza delle singole
specie.
Infine, va comunque sottolineato che nella programmazione e pianificazione dei piani di
ricerca scientifica applicata alla sanità umana e animale e alla salubrità dell'ambiente,
saranno preferiti, ove possibile:
a) - quelli che non si avvalgono di sperimentazione animale;
b) - quelli che si avvalgono di metodi alternativi;
c) - quelli che utilizzano un minor numero di animali e comportino procedimenti
meno dolorosi;
d) - le ricerche su protocolli per il minore impiego di specie e di numero di animali;
e) - le ricerche intese allo studio di metodi alternativi.
In base alle normative nazionali e internazionali in materia di sperimentazione animale, si
intendono come alternativi: i metodi che sostituiscono l’impiego di animali nella
sperimentazione (Replacement), le procedure che riducono il numero di animali utilizzati
nella sperimentazione (Reduction) o quelle che, pur utilizzando animali, ricorrono a tecniche
meno invasive (Refinement). Esistono numerosi metodi alternativi, ma il completo
abbandono dell’utilizzo di animali nella sperimentazione è ancora molto lontano, sebbene
detti metodi alternativi stiano già sostituendo le sperimentazioni cruente in alcuni settori.
Da tempo non si utilizzano più animali in: crash test di automobili, test di gravidanza, test
per verificare la contaminazione batterica di farmaci, numerose verifiche igienico-sanitarie
su alimenti, esercitazioni per scopo didattico, test di tossicità su sostanze chimiche, la
mutagenesi e la genotossicità, la fototossicità, l’embriotossicità. Il 70% della ricerca
biomedica, ovvero della biologia della medicina, non fa più uso di animali.
È quindi auspicabile, a breve termine, una sperimentazione che segua alla lettera la
normativa attualmente esistente (soprattutto in relazione all’autorizzazione necessaria del
Ministero), che faccia maggior uso di specie ittiche a ridotto sviluppo neurologico rispetto ai
vertebrati superiori e che, per lo stesso motivo, adoperi anche molluschi e crostacei (è
imminente un nuovo Regolamento Comunitario che considererà animali utilizzati a fini
sperimentali, e quindi soggetti alla normativa, anche questi invertebrati, unitamente alle
forme larvali ed embrionali), fino alla graduale sostituzione dei modelli animali con i metodi
alternativi.
BIBLIOGRAFIA
Baldessari D. & Mione M. (2008). How to create the vascular tree? (Latest) help from the zebrafish.
Pharmacol. & Therapeutics, 118: 206-230.
Bassett D.I. & Currie P.D. (2003). The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital
myopathy. Hum. Mol. Genet., 12, Spec. 2: R265-R270.
Best J.D. & Alderton W.K. (2008). Zebrafish: an in vivo model for the study of neurological diseases.
Neuropsychiatr. Dis. Treat., 4, 3: 567-576.
Braithwaite V.A. & Boulcott P. (2007). Pain perception, aversion and fear in fish. Dis. Aquat. Org.,
75: 131-138.
Braithwaite V.A. & Huntingford F.A. (2004). Fish and welfare: do fish have the capacity for pain
perception and suffering? Anim. Welf., 13: 587-592.
13
ITTIOPATOLOGIA, 2009, 6: 5-16
Brattelid T. & Smith A.J. (2000). Guidelines for reporting the results of fish experiments. Lab.
Animals, 34: 131-135.
Braunbeck T., Boettcher M., Hollert H., Kosmehl T., Lammer E., Leist E., Rudolf M. & Seitz N.
(2005). Towards an alternative for the acute fish LC50 test in chemical assessment: the fish embryo
toxicity test goes multi-species – an update. Altex, 22, 2: 87-102.
Bretaud S., Allen C., Ingham P.W. & Bandmann O. (2007). p53-dependent neuronal cell death in a
DJ-1-deficient zebrafish model of Parkinson's disease. J. Neurochem., 100, 6: 1626-1635.
Casebolt D.B., Speare D.J. & Horney B.S. (1998). Care and use of fish as laboratory animals: current
state of knowledge. Lab. Animal Science, 48: 124-136.
Chandroo K.P., Duncan I.J.H. & Moccia R.D. (2004). Can fish suffer?: perspectives on sentience,
pain, fear and stress. Appl. Animal Behav. Scien., 86: 225-250.
Decreto Legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 (1992). Attuazione della Direttiva 86/609/CEE in materia
di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici. Pubblicata sulla G.U.
del 18 febbraio 1992, n. 40.
Direttiva del Consiglio del 24/11/1986 (1996), concernente il ravvicinamento delle disposizioni
legislative, regolamentari e amministrative degli Stati Membri relative alla protezione degli animali
utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici. Pubblicata su G.U.C.E. del 18/12/1986, n. L 358.
Documento di accompagnamento della Proposta di Direttiva del Parlamento Europeo e del Consiglio
(2008) relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici - Sintesi della valutazione
dell’impatto. Bruxelles, 5.11.2008.
Dooley K. & Zon L.I. (2000). Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin.
Genet. Dev., 10, 3: 252-256.
Drummond I.A. (2005). Kidney development and disease in the zebrafish. J. Am. Soc. Nephrol., 16, 2:
299-304.
Ferguson R.A. & Tufts B.L. (1992). Physiological effects of brief air exposure in exhaustively
exercised rainbow trout Oncorhynchus mykiss: implications for "catch and release" fisheries. Canad.
J. Fish. Aquat. Scien., 49, 6: 1157-1162.
Goessling W., North T.E. & Zon L.I. (2007). New waves of discovery: modeling cancer in zebrafish.
J. Clin. Oncol., 25, 17: 2473-2479.
Goldsmith P. (2004). Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Curr. Opin.
Pharmacol., 4, 5: 504-512.
Goldsmith P. & Harris W.A. (2003). The zebrafish as a tool for understanding the biology of visual
disorders. Semin. Cell. Dev. Biol., 14: 11-18.
Hubbs C., Nickum J.G. & Hunter J.R. (1988). Guidelines for the use of fish in research. Fisheries, 13,
2: 16-22.
Huntingford F.A., Adams C., Braithwaite V.A., Kadri S., Pottinger T.G., Sandøe P. & Turnbull J.F.
(2006). Current issues in fish welfare. J. Fish Biol., 68: 332-372.
14
ITTIOPATOLOGIA, 2009, 6: 5-16
Iwama G.K., Afonso L.O.B. & Vijayana M.M. (2006). Stress in fish. In: The physiology of fishes,
Third Edition. Edited by D.H. Evans and J.B. Claiborne. CRC Press, Boca Raton, Florida: 319-342.
Jackson C. (2003). Laboratory fish: impacts of pain and stress on well-being. Contemp. Top Lab.
Anim. Sci., 42: 62-73.
Kane A.S., Gonzalez J.F. & Reimschuessel R. (1996). Fish and amphibian models used in laboratory
research. Lab. Animal, 25: 33-38.
Li J., Mack J.A., Souren M., Yaksi E., Higashijima S., Mione M., Fetcho J.R. & Friedrich R.W.
(2005). Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. J. Neuroscience,
25: 5784-5795.
Marino F., Germanà A., Bambir S., Helgason S., De Vico G. & Macrì B. (2007). Calretinin and S-100
expression in goldfish, Carassius auratus ( L.), schwannoma. J. Fish Dis., 30: 251-253.
Mattioli R., Aguilar C. & Vasconcelos L. (1995). Reinforcing properties of the neuropeptide
substance P in Carassius auratus: evidence of dopaminergic system involvement. Pharmacol.
Biochem. Behav., 50: 77-81.
Mattioli R., Santangelo E.M., Costa A.C.C. & Vasconcelos L. (1997). Substance P facilitates memory
in goldfish in an appetitively motivated learning task. Behav. Brain Res., 85: 117-120.
Mione M., Baldessari D., Deflorian G., Nappo G. & Santoriello C. (2008). How neuronal migration
contributes to the morphogenesis of the CNS: insights from the zebrafish. Develop. Neuroscience, 30:
65-81.
Nourizadeh-Lillabadi R., Lyche J.L., Almaas C., Stavik B., Moe S.J., Aleksandersen M., Berg V.,
Jakobsen K.S., Stenseth N.C., Skåre J.U., Alestrøm P. & Ropstad E. (2009). Transcriptional
regulation in liver and testis associated with developmental and reproductive effects in male zebrafish
exposed to natural mixtures of persistent organic pollutants (POP). J. Toxicol. Environ. Health, Part
A, 72, 3: 112-130.
Passantino A. (2008). Application of the 3Rs principles for animals used for experiments at the
beginning of the 21st century. Annual Rev. Biomed. Scien., 10: T27-T32.
Passantino M., Di Pietro C. & Passantino A. (2005). Il decreto legislativo 116/92: attualità e
prospettive. Rassegna di Diritto e Legislazione e Medicina Legale Veterinaria, 4, 3: 17-23.
Rose J.D. (2002). The neurobehavioural nature of fishes and the question of awareness and pain. Rev.
Fish Sci., 10: 1-38.
Sneddon L.U. (2003). The evidence for pain in fish: the use of morphine as an analgesic. Appl. Anim.
Behav. Scien., 83: 153-162.
Stainier D.Y., Fouquet B., Chen J.N., Warren K.S., Weinstein B.M., Meiler S.E., Mohideen M.A.,
Neuhauss S.C., Solnica-Krezel L., Schier A.F., Zwartkruis F., Stemple D.L., Malicki J., Driever W. &
Fishman M.C. (1996). Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in
the zebrafish embryo. Development, 123: 285-292.
Topál J. & Csányi V. (1999). Interactive learning in the paradise fish (Macropodus opercularis): an
ethological interpretation of the second-order conditioning paradigm. Anim. Cognit., 2: 197-206.
van Zutphen L.F.M., Baumans V. & Beyen A.C. (1996). Principi di scienza dell'animale da
laboratorio. Edizioni La Goliardica Pavese, Pavia: 1-19.
15
ITTIOPATOLOGIA, 2009, 6: 5-16
Xu X., Meiler S.E., Zhong T.P., Mohideen M., Crossley D.A., Burggren W.W. & Fishman M.C.
(2002). Cardiomyopathy in zebrafish due to mutation in an alternatively spliced exon of titin.
Nat. Genet., 30, 2: 205-209.
16