UNIVERSITA` DEGLI STUDI DI PERUGIA FACOLTA` DI

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PERUGIA
FACOLTA’ DI MEDICINA VETERINARIA
Corso di laurea in
IGIENE E QUALITA’ DELLE PRODUZIONI ANIMALI
DIPARTIMENTO DI
SCIENZE BIOPATOLOGICHE ED IGIENE DELLE PRODUZIONI
ANIMALI E ALIMENTARI
VET04
CARATTERIZZAZIONE SIEROLOGICA E GENOTIPICA DI
SALMONELLA SPP.: APPLICAZIONI NELL’AMBITO DELLE
TOSSINFEZIONI ALIMENTARI
SIEROLOGIC AND GENOTIPIC CHARACTERIZATION OF
SALMONELLA SPP.: APPLICATION IN THE FOODBORNE
DISEASE FIELD
Laureanda:
Roberta Ortenzi
Relatore:
Dott.ssa Raffaella Branciari
Correlatore:
Dott.ssa Stefania Scuota
Anno Accademico 2006/2007
Ringraziamenti
Desidero ringraziare il Dott. Guido Petracca, Direttore dell’Istituto
Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche; ringrazio
il personale dell’Istituto che mi ha assistito e supportato nello
svolgimento del presente lavoro.
In particolare, il Dott. Telemaco Cenci, Responsabile dell’Area
Sicurezza Alimentare, la Dott.ssa Stefania Scuota, la Sig. Alessia
Zicavo e tutti i colleghi del Laboratorio Contaminanti Biologici.
INDICE
Abstract…………………………………………………………………1
Riassunto ………………………………………………………………2
Introduzione…………………………………………………………….3
Classificazione………………………………………………………….7
Serbatoi animali………………………………………………………12
Salmonella negli alimenti…………………………………………….14
La rete ENTER-NET………………………………………………….17
Protocollo ricerca di Salmonella da alimenti……………………….19
Tipizzazione sierologia……………………………………………….20
Multiplex PCR…………………………………………………………26
Tipizzazione fagica…………………………………………………...28
Tipizzazione biomolecolare mediante PFGE
(Pulsed-Field Gel Electrophoresis)…………………………………30
Episodio di tossinfezione alimentare……………………………….35
Risultati e discussione……………………………………………….38
Conclusioni……………………………………………………………41
Bibliografia…………………………………………………………….43
ABSTRACT
This thesis describes the main Salmonella identification and
isolation techniques. Furthermore, through a case of foodborne
disease, the functioning of the ENTER-NET surveillance system is
described. It is made up of a network of microbiology laboratories
coordinated by Regional Reference Centres represented by
hospital laboratories, by Istituti Zooprofilattici Sperimentali (IZS)
and by ARPA.
1
RIASSUNTO
Nella presente tesi vengono descritte le principali tecniche
di isolamento ed identificazione di Salmonella. Inoltre viene
illustrato, attraverso la descrizione di un caso di tossinfezione
alimentare, il funzionamento della rete ENTER-NET. La rete
ENTER-NET è un sistema di sorveglianza costituito da una rete di
laboratori di Microbiologia coordinati da Centri di Riferimento
Regionali rappresentati da laboratori ospedalieri, da Istituti
Zooprofilattici Sperimentali (IZS) e da ARPA.
2
INTRODUZIONE
Già dagli anni settanta il concetto di qualità e sicurezza
sanitaria degli alimenti è stato associato al concetto di sicurezza
microbiologica dell’alimento (Bauman, 1974; WHO, 1995).
Nel 2000, con l’emanazione da parte della Comunità
Europea del “Libro Bianco sulla Sicurezza Alimentare”, sono state
identificate nuove linee strategiche basate sul principio del
controllo dell’intera filiera (from the farm to the fork); alla luce di
questi nuovi indirizzi comunitari, derivanti dal libro Bianco e in
seguito da una serie di Regolamenti comunitari entrati in vigore il
1° gennaio 2006, noti con la denominazione di “Pacchetto Igiene”,
si è accentrata l’attenzione sull’argomento da parte dei singoli
Stati Membri che hanno predisposto interventi finalizzati a
garantire la Sicurezza Alimentare (Libro Bianco, 1999).
Nonostante i progressi soddisfacenti realizzati nel campo
della prevenzione di alcune malattie infettive, le forme morbose
legate all’assunzione di alimenti rappresentano ancora un
problema
di
Sanità
Pubblica,
enfatizzato,
tra
l’altro,
dall’emergenza di “nuovi” patogeni e accentuato dall’uso di
3
tecniche di produzione, manipolazione e distribuzione su larga
scala di prodotti alimentari.
La
prima
relazione
sintetica
comunitaria
dell’EFSA
(Europaen Food Safety Authority) sull’andamento e sulle fonti
delle zoonosi, è stata pubblicata nel dicembre 2005. Le zoonosi,
ossia le malattie degli animali trasmissibili all’uomo, hanno
interessato oltre 380.000 cittadini dell’UE nel 2004.
La forma umana della malattia viene spesso contratta
attraverso alimenti contaminati. Stando alla relazione, le due
malattie zoonotiche osservate con maggiore frequenza negli
esseri umani sono infezioni da Salmonella e Campylobacter, che
sono comunemente diffusi negli animali e, conseguentemente,
negli alimenti.
In Italia, le malattie a trasmissione alimentare vengono
segnalate nel sistema di notifica obbligatoria delle malattie infettive
coordinato a livello nazionale dal Ministero della Salute. Inoltre, la
sorveglianza di laboratorio di alcune infezioni a prevalente
trasmissione alimentare fa capo al sistema ENTER-NET, inserito
in un network cui partecipano numerosi paesi europei ed extraeuropei. Nel nostro paese tale sistema è costituito da una rete di
4
laboratori di Microbiologia coordinati da Centri di Riferimento
Regionali rappresentati da laboratori ospedalieri, da Istituti
Zooprofilattici Sperimentali (IZS) e da ARPA. Tutta l’attività è
coordinata dall’Istituto Superiore di Sanità.
Le infezioni da Salmonella rappresentano in Italia la
principale causa di epidemie. Infatti, si registrano circa 15.000
casi/anno, che rappresentano un importante problema di sanità
pubblica sia per l’elevata morbosità, sia per il peso economico che
comportano (www.simi.iss.it).
Negli ultimi anni il numero delle Salmonellosi notificate è
andato via via diminuendo; tale diminuzione può essere ascritta
alle migliorate condizioni igieniche di produzione degli alimenti e
alle relative misure di controllo implementate, conseguenti a
recepimenti di Normative Europee nell’ambito dell’Autocontrollo e,
più in generale, del controllo di filiera.
Dopo un’analisi dei dati del sistema ENTER-NET e di quelli
disponibili del Piano triennale alimenti della Regione Umbria, vista
la frequenza degli isolamenti di Salmonella dagli alimenti e dai
pazienti con sintomatologia gastro-enterica e l’incidenza di
Salmonella nelle tossinfezioni alimentari rispetto agli altri patogeni,
5
è stato individuata la possibilità di intervenire, nell’ambito del
Centro di Riferimento regionale per Enterobatteri patogeni, per
collegare le varie fasi dell’indagine epidemiologica procedendo a
rilievi molecolari sui ceppi isolati di origine ambientale, umana ed
alimentare, mediante l’utilizzo della tecnica dell’elettroforesi in
campo pulsato (PFGE).
Scopo del presente lavoro è stato quello di descrivere le
principali tecniche di isolamento ed identificazione di Salmonella e
il funzionamento della rete ENTER-NET, esponendo un caso di
tossinfezione alimentare verificatosi in Umbria.
6
CLASSIFICAZIONE
All’interno del genere Salmonella esiste un gran numero di
sierotipi, distinti sulla base della diversa combinazione degli
antigeni somatici e flagellari e talvolta anche in base ad alcuni
caratteri biochimici (Ewing,1986).
Dai primi isolamenti ad oggi la classificazione del genere
Salmonella è stata più volte rivista. Inizialmente i ceppi di
Salmonella, isolati da diverse forme cliniche o da altre fonti,
venivano considerati come specie distinte. In seguito lo studio
degli antigeni somatici (O) e flagellari (H) iniziato da White e
portato avanti da Kauffmann, portò alla descrizione di un enorme
numero di sierotipi che sostituirono le specie precedentemente
identificate (Editorial, 1992).
Esistono diverse classificazioni fenotipiche del genere
Salmonella; tra queste quelle più conosciute e utilizzate sono
quella di Le Minor per quanto riguarda la suddivisione in
sottospecie e quella di Kauffmann-White, per quanto riguarda la
tipizzazione sierologia.
7
Il genere Salmonella comprende due sole specie: S.
enterica e S. bongori. La specie enterica è a sua volta suddivisa in
sei
sottospecie:
enterica,
salamae,
arizonae,
diarizonae,
houtenae, indica.
Oggi si conoscono più di 2400 sierotipi della specie
enterica, e il sierotipo non è più considerato come identificativo di
specie; pertanto la nomenclatura non lo riporta più in corsivo;
peraltro i nomi sono mantenuti solamente per i sierotipi
appartenenti a S. enterica subsp. enterica (es S. Typhimurium),
mentre quelli ascrivibili alle altre sottospecie vengono identificati
attraverso le relative formule antigeniche.
L’attuale classificazione che deriva, come già detto, da
quelle di Kauffmann-White e di Le Minor riflette la presente
tassonomia delle Salmonelle ed è soggetta ad aggiornamenti
annuali curati dal WHO Collaborating Centre for Reference and
Research on Salmonella, con cui collaborano vari laboratori di
riferimento internazionali.
8
CLASSIFICAZIONE SECONDO KAUFFMANN-WHITE
Kauffmann nel 1931 presentò lo schema di classificazione
delle Salmonelle, in uso fino ai nostri giorni e universalmente
accettato. In realtà egli riscrisse, ampliandolo, uno schema
precedente elaborato da Schultze, White e Scott. Lo schema si
basa sul fatto che:
– il genere è rappresentato da bastoncelli gram-negativi,
aerobi, non sporigeni, per lo più mobili, che crescono bene sui
comuni terreni colturali, fermentano il glucosio e riducono i nitrati e
non l’indolo, non idrolizzano l’urea, il VP, l’adonite, e non
fermentano il saccarosio; con alcune eccezioni, non fermentano il
lattosio;
– esistono 4 sotto-generi (denominati I, II, III, IV)
differenziabili in base a poche prove biochimiche (Tabella 1);
– i ceppi con la medesima formula antigenica, anche se con
differenze biochimiche (ad esempio, fermentare o meno un certo
zucchero oppure produrre e non produrre H2S) appartengono allo
stesso sierotipo (Kauffmann, 1967).
9
Tabella 1. Test biochimici per la suddivisione del genere Salmonella in
quattro sotto-generi
Test
I
II
III
IV
Fermentazione dulcite
+
+
-
-
Fermentazione lattosio
-
-
+
-
Fermentazione salicina
-
-
-
+
Fermentazione malonato
-
+
+
-
Crescita in terreno KCN
-
-
-
+
CLASSIFICAZIONE SECONDO LE MINOR
Le sei sottospecie di S. enterica sono distinguibili in base a
prove biochimiche (Tabella 3) che consentono anche di
differenziare S. enterica da S. bongori. I sierotipi di S. enterica
subsp. enterica sono spesso indicati con un nome che usualmente
è correlato al luogo geografico nel quale il sierotipo è stato per la
prima volta isolato. Il nome viene scritto in lettere romane e la
prima lettera è maiuscola. I sierotipi appartenenti alle altre
sottospecie sono designati dalle loro formule antigeniche, seguite
dal nome della sottospecie (Tabella 2) (Le Minor, 1987).
10
Tabella 2. Classificazione delle Salmonelle
Specie
Sottospecie
Numero sottospecie
S. enterica
enterica
I
salamae
II
arizonae
IIIa
diarizonae
IIIb
houtenae
IV
indica
VI
S. bongori
V
Tabella 3. Prove biochimiche
Test
S. enterica
S. bongori
I
II
IIIa
IIIb
IV
VI
V
Fermentazione dulcite
+
+
-
-
-
+/-
+
Fermentazione lattosio
-
-
-
+
-
+/-
-
Fermentazione salicina
-
-
-
-
+
-
-
Fermentazione sorbitolo
+
+
+
+
+
-
-
Fermentazione malonato
-
+
+
+
-
-
-
Fermentazione d(+)tartrato
+
-
-
-
-
-
-
Crescita in terreno KCN
-
-
-
-
+
-
+
ONPG
-
-
-
+
-
+/-
+
11
SERBATOI ANIMALI
Gli animali fungono da principali serbatoi di mantenimento
della Salmonella. Ogni sierotipo predilige una o più specie animali;
alcuni sono considerati addirittura specifici per una specie animale
(ad es. S. Gallinarum nei polli), altri sono definiti ospite-adattati in
quanto prediligono un ospite, ma possono infettarne anche altri (S.
Dublin per bovini, S. Hadar nei volatili, S. Enteritidis nelle galline
ovaiole); infine alcuni sierotipi, come S. Typhimurium, sono
ubiquitari (Brackelsberg, 1997).
Il ruolo di serbatoio viene svolto da numerose specie
animali da reddito e da compagnia. I bovini sono spesso
colonizzati da S. Dublin e S. Typhimurium, con infezioni di durata
variabile e forme cliniche di vario tipo. S. Dublin può persistere
nell’ospite molto a lungo, in alcuni casi anche tutta la vita,
inducendo per lo più forme gravi di malattia (Allerberger, 2002).
Nelle specie aviarie sono presenti sierotipi specie-specifici,
come S. Gallinarum nel pollo, sierotipi ospite-adattati e ubiquitari.
In Italia i principali sierotipi ospite-adattati nel pollo sono S. Hadar
e S. Enteritidis, mentre nel tacchino si ritrova principalmente S.
12
Blockley. I suini rappresentano un importante serbatoio di S.
Typhimurium e S. Derby (Wilcock, 1992).
13
SALMONELLA NEGLI ALIMENTI
L’ubiquitarietà e la capacità di crescita delle Salmonelle a
temperature comprese fra 7°C e 46°C fa sì che qualsiasi alimento
manipolato o conservato in modo non corretto possa essere
contaminato e quindi rappresentare un’eventuale fonte di
infezione.
Molti episodi di malattia alimentare sono causati dal tempo
prolungato intercorso fra la preparazione o la cottura dell’alimento
e il consumo. Questo rende possibile la moltiplicazione dei batteri
presenti
nell’alimento,
con
raggiungimento
di
elevate
concentazioni e quindi con maggiore probabilità di causare
malattia (De Felip, 2001).
Il ruolo degli operatori della catena alimentare può essere
rilevante, in quanto è stato dimostrato che una non corretta
manipolazione di materie prime contaminate (carni, uova) può
causare un’estesa contaminazione ambientale che può essere
causa di cross-contaminazione anche di alimenti pronti per essere
consumati (Synnott, 1998).
14
Per quanto riguarda la catena di macellazione, la presenza
di
Salmonella
sulle
carcasse
è
generalmente
dovuta
a
contaminazione fecale, ed è direttamente proporzionale all’entità
dell’infezione nell’animale e alle carenze igieniche in fase di
macellazione. La contaminazione profonda a livello delle masse
muscolari è infrequente, ma i processi di produzione di carni
macinate o insaccati freschi fanno sì che la contaminazione
superficiale venga estesa a tutto il prodotto. Per questo motivo tali
prodotti, se cotti o stagionati in modo non sufficiente, possono
divenire fonti di infezione (Castellani, 1993).
Nelle carni avicole, la contaminazione da Salmonella
dipende principalmente dalle modalità di allevamento del pollame.
Ogni allevamento può contenere migliaia di capi in spazi limitati, e
questa concentrazione di potenziali ospiti fornisce alle Salmonelle
l’opportunità di diffondersi in modo estremamente rapido tra gli
animali. La stessa condizione si può verificare durante il trasporto
dall’allevamento al macello, se questo avviene in condizione di
sovraffollamento. Una contaminazione superficiale delle carcasse
si può riscontrare nel corso della macellazione per contaminazione
crociata che si verifica durante le diverse fasi.
15
Le uova e i prodotti derivati rappresentano un importante
veicolo
di
Salmonella,
soprattutto
di
S.
Enteritidis.
La
contaminazione dell’uovo può avvenire nell’ovaio per trasmissione
verticale, o nella cloaca al momento della deposizione; inoltre non
infrequente è la contaminazione delle uova durante il trasporto su
nastro imbrattato da feci. La maggior parte dei casi di
tossinfezione alimentare da S. Enteritidis sono correlati non tanto
alle uova, quanto al consumo di prodotti a base di uova, quali
maionese
e
dolci
preparati
con
uova
crude,
in
cui
la
moltiplicazione dei microrganismi presenti avviene in seguito al
mantenimento dei prodotti a temperatura ambiente anche per
tempi brevi.
16
PARTE SPERIMENTALE
La rete ENTER-NET
In Europa, è attiva dal 1994 una rete di sorveglianza
internazionale chiamata ENTER-NET, che coinvolge centri di
referenza dei Paesi dell’Unione Europea nonché il Canada, il
Giappone, il Sud Africa, la Svizzera e la Norvegia. La rete ENTERNET raccoglie informazioni sui sierotipi di Salmonella e di E. coli
VTEC associate alle infezioni umane, sulla resistenza agli
antibiotici dei ceppi implicati e contribuisce all’identificazione e allo
studio di episodi epidemici a carattere internazionale.
L’Istituto Superiore di Sanità partecipa alla sorveglianza
Europea e coordina un sistema di sorveglianza nazionale,
ENTER-NET Italia, che coinvolge numerosi laboratori del Servizio
Sanitario Nazionale (SSN), dai quali riceve regolarmente le
segnalazioni degli isolamenti e provvede a diffondere i dati e le
informazioni di ritorno ai laboratori partecipanti.
Nel 2002 è stata attivata a livello nazionale una struttura
parallela al sistema ENTER-NET, che riguarda la raccolta di dati
sugli isolamenti di Salmonella spp. da campioni di origine
17
veterinaria, e che prende il nome di ENTER-VET. Le strutture che
vi partecipano sono gli Istituti Zooprofilattici Sperimentali coordinati
dal Centro Nazionale di Referenza per le Salmonellosi istituito
presso l’Istituto Zooprofilattico delle Venezie.
ENTER-NET raccoglie mediamente ogni anno informazioni
microbiologiche ed epidemiologiche su oltre 12.000 isolati di
Salmonella, di cui circa la metà di origine umana (Rapporti
ISTISAN 05/27).
In italia le infezioni umane da Salmonella e gli episodi
epidemici dovuti a tossinfezione alimentare sono soggetti a
notifica obbligatoria al SSN, ma spesso i casi di Salmonellosi sono
sottostimati, la trasmissione delle informazioni spesso è poco
tempestiva ed è difficile associare episodi epidemici al consumo di
un particolare alimento contaminato (www.ministerosalute.it).
Il Centro di Riferimento Regionale per gli Enterobatteri dell’Istituto
Zooprofolattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche partecipa
alla rete di sorveglianza raccogliendo dati e ceppi batterici che
vengono inviati dai laboratori periferici delle AASSLL territoriali, da
laboratori privati e dall’ARPA. I ceppi batterici di Salmonella
vengono sottoposti ad una serie di analisi: test biochimici,
18
tipizzazione sierologica, tipizzazione biomolecolare e valutazione
dell’antibiotico resistenza. Il saggio di sensibilità agli antimicrobici
viene effettuato con la tecnica della diffusione in agar (KirbyBauer, 1966) secondo le linee guida NCCLS.
Protocollo Ricerca di Salmonella da alimenti
La ricerca di Salmonelle negli alimenti è una procedura
prevista dalla normativa per la sicurezza degli alimenti e viene
effettuata seguendo procedure operative standard (POS) che si
basano su metodi validati dall’International Standard Organization
(ISO).
Il metodo ufficiale adottato dall’IZS è quello VIDAS
Salmonella, metodo alternativo validato in base alla norma ISO
16140 sul metodo UNI EN ISO 6579:2004. Tale test è di tipo
qualitativo e permette la rilevazione di Salmonella nei prodotti
alimentari con un test immunoenzimatico: ELFA (Enzyme Linked
Fluorescent Assay).
Il test utilizza un cocktail di anticorpi monoclonali di cattura
ad alta specificità, diretti contro degli antigeni O ed H e permette
19
l’individuazione dei ceppi mobili ed immobili di Salmonella con una
leggera reattività crociata con le altre Enterobatteriacee.
Qualora il risultato del test VIDAS Salmonella dia esito
positivo per la presenza del germe nell’alimento analizzato, questo
risultato deve essere confermato da un successivo isolamento
dalla stessa matrice mediante il metodo descritto nella ISO
6579:2004
(International
Organization
for
Standardization:
Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method
for the detection of Salmonella spp.).
Tipizzazione Sierologica
La tipizzazione sierologica viene effettuata mediante
agglutinazione, con metodica rapida su vetrino o lenta in provetta.
Entrambe le metodiche si applicano per l’identificazione degli
antigeni somatici O e degli antigeni flagellari H, nonché
dell’antigene di virulenza Vi. La scelta del metodo dipende dalle
esigenze del laboratorio: il metodo dell’agglutinazione rapida è
veloce e apparentemente più semplice, ma richiede una certa
abilità
ed
esperienza
dell’operatore,
mentre,
il
metodo
dell’agglutinazione lenta è più complesso e dispendioso ed è
20
consigliabile se il laboratorio tratta costantemente un numero
programmabile di tipizzazioni.
La tipizzazione prevede operativamente le seguenti fasi:
1. Agglutinazione volta ad evidenziare l’antigene somatico (O)
2. Agglutinazione volta ad evidenziare gli antigeni flagellari H.
Vista la numerosità di sierotipi presenti nello schema di
Kauffmann-White è importante fare alcune considerazioni: se ci
riferiamo ad isolati da campioni umani basterebbe utilizzare gli
antisieri specifici per i sierotipi più frequentemente implicati nella
patologia umana che, rispetto alla grande quantità esistente, sono
in numero limitato. In generale i principali sierotipi isolati sono
quelli appartenenti ai gruppi O4, O7, O8, O9, O3,10, O1,3,19 e
con fase ciliare b, d, i, E, G, k, y, L, r, z10, z29 e 1; inoltre se
abbiamo ad esempio isolati appartenenti al gruppo O4 e O9, si
può ipotizzare che i sierotipi siano S. Typhimurium e S. Enteritidis,
rispettivamente.
Accorgimenti per ottenere un miglior risultato sono l’utilizzo
di colture fresche per ottenere una migliore agglutinazione e il
passaggio su una piastra di agar nutriente semisolido in quanto le
colture vecchie possono perdere la mobilità; dopo incubazione a
21
+37°C, con la piastra posizionata in modo da avere il coperchio
rivolto verso l’alto, si preleva per il test la patina batterica dalla
parte periferica della piastra stessa.
La tecnica di agglutinazione rapida su vetrino prevede l’uso
di batteri trapiantati da terreni nutritivi come il Tryptycase Soy Agar
(TSA - OXOID). Operativamente si pone una goccia di antisiero su
un vetrino e poi con l’ansa, si procede a trasportare la patina
batterica direttamente sulla goccia di siero e si mescola con
movimento circolare, in modo da disperdere i batteri. La patina
microbica viene stemperata dalla periferia della goccia verso il
centro fino ad inglobare tutto il siero. La miscelazione viene
completata con movimenti di oscillazione del vetrino. Dopo
qualche secondo si osserva la reazione ad occhio nudo e, nel
caso di reazione positiva, si osserveranno piccoli granuli bianchi,
omogeneamente dispersi nell’intera goccia di siero, divenuta
trasparente attorno alle granulazioni. In caso di reazione negativa i
batteri rimangono in sospensione con un aspetto lattiginoso e
opaco (Zavanella, 2001).
Lo schema di identificazione più comunemente applicato
(WHO, 1980; Popoff, 1997) prevede l’uso iniziale di sieri
22
polivalenti
che
forniscono
delle
indicazioni
generali
e,
successivamente, di sieri monovalenti specifici nei confronti sia
degli antigeni somatici O sia degli antigeni flagellari H.
Operativamente le fasi sono:
1. saggio delle colonie con antisiero polivalente somatico O (A-S);
2. saggio delle colonie con antisiero monovalente somatico O;
3. saggio delle colonie con antisiero polivalente flagellare H (poli H
fasi 1 e 2);
4. saggio delle colonie con antisiero monovalente flagellare.
Una completa definizione del sierotipo prevede, se si tratta
di Salmonella bifasica, il riconoscimento di entrambe le fasi ciliari 1
e 2 che non possono essere evidenziate contemporaneamente
durante la prima agglutinazione, per cui si procederà ad effettuare
la cosiddetta “inversione di fase”. I metodi più conosciuti sono
quello di Swen Gard e il metodo di Craigie.
Il primo consiste nel seminare il ceppo al centro di una
piastra contenente un terreno nutritivo agarizzato semisolido
(Swen-Gard - Estratto di carne 5g/l, Estratto di lievito 1g/l,
Glucosio 2.5 g/l, Peptone di caseina 17g/l, Peptone di soia 3 g/l
Potassio fosfato bibasico 2.5 g/l, Sodio cloruro 5 g/l, Agar noble 5
23
g/l), addizionato con una piccola quantità di siero anti-Salmonella
corrispondente alla fase H espressa (e quindi da inibire). Dopo
incubazione a 37°C per 18-24 ore, la Salmonella, essendo mobile,
si svilupperà formando una patina batterica di forma circolare, alla
cui periferia saranno presenti cellule batteriche dotate della fase H
differente da quella iniziale, che è stata inibita dall’antisiero posto
nel terreno (inversione di fase).
Il metodo di Craigie segue lo stesso principio del
precedente, ma viene effettuato in provetta.
Dopo
aver
ottenuto
l’inversione
di
fase
si
ripete
l’agglutinazione con gli antisieri H.
Nel metodo dell’agglutinazione lenta per la ricerca degli
antigeni H, ogni ceppo viene seminato in due provette, contenenti
rispettivamente 3 mL di Trypticase Soy Broth (TSB) per la ricerca
della fase “H”, e 4 mL del medesimo terreno per la ricerca della
fase “O”. La provetta contenente 3 mL viene incubata a 37°C per
18-24 ore, e successivamente addizionata con un ugual volume di
soluzione fisiologica formolata all’1%. La provetta contenente 4
mL viene incubata a 37°C per 3 ore, e successivamente
sottoposta ad in attivazione mediante bollitura. Si procede quindi
24
al test di agglutinazione lenta su piastra, utilizzando per ogni siero
la diluizione d’uso precedentemente stabilita testando ceppi di
riferimento con diluizioni scalari dei diversi sieri. Per tale prova
esistono dei pool di sieri introdotti da Spicer-Edwards che
consentono, mediante varie combinazioni, di risalire a 35 fattori
antigenici (Zavanella, 2001) (Tabella 4).
Tabella 4. Composizione dei pool di Spider-Edwards
Antigeni H
a
b
c
d
e,h
G Complex
j
k
r
y
z
z4 Complex
z10
z29
Antigene H
Pool 1
+
+
+
+
+
+
+
-
e, n,x ; e, n, z15
Pool 2
+
+
+
+
+
+
+
Nome del pool
Pool 3
Pool 4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Numero del pool
EN complex
5
l, v ; l, w ; l, z13 ; l, z28
L complex
6
1,2 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; z6
1 complex
7
Nota:
G complex comprende gli antigeni f, g; f, g, s; f, g, t; g, m; g, m, q; g, m, s; g, m,
t; g, p; g, p, s; g, p, u; g, q; g, s, t; g, t; m, p, t, u; m, t
z4 complex comprende gli antigeni z4, z23; z4, z24; z4, z32
25
Multiplex PCR
Alcuni ceppi possono risultare monofasici da un punto di
vista sierologico, mentre in realtà sono in possesso del gene
codificante la seconda fase ciliare, ma hanno ridotto o perso la
capacità di esprimerlo.
Per confermare la mancanza della seconda fase viene
utilizzata una tecnica di caratterizzazione molecolare dei geni
responsabili dell’espressione di specifici antigeni flagellari.
L’analisi si basa sull’amplificazione mediante PCR di
specifici frammenti del gene fljB codificante il complesso
antigenico H1, resa possibile dall’utilizzo di una serie di coppie di
primers scelta opportunamente sulle sequenze specifiche degli
alleli H1,2, H1,5, H1,6 e H1,7 che costituiscono il complesso
stesso. In particolare la metodica prevede l’utilizzo di un primer
“senso” comune a tutte le varianti alleliche e quattro primers
antisenso di cui uno comune a tre specifici, rispettivamente per gli
alleli H1,5, H1,6 e H1,7. In seguito a reazione multiplex si ottiene
l’amplificazione di tre ampliconi specifici di differente peso
molecolare relativi alle suddette varianti alleliche con l’assunzione
26
che l’amplificazione dell’intero frammento corrisponde a positività
per allele H1,2.
Per l’estrazione del DNA batterico 4-5 colonie da una
coltura in TSA vengono stemperate in 300TL di acqua distillata e
fatte bollire per 15 minuti; successivamente vengono centrifugate
a 14000 rpm per 5 minuti e il surnatante viene trasferito in una
provetta eppendorf.
Le condizioni della miscela di reazione (Tabella 5) e le
sequenze dei primers (Tabella 6) sono riportate di seguito
(Echeita, 1998).
Tabella 5. Mix di reazione
Reagenti
Concentrazione
iniziale
Concentrazione
finale
Buffer Taq Gold
MgCl2
dNTPs
Primer Fly B sense F1
antisense R6
antisense R5
antisense R7
antisense R1
Taq
H2O
10X
25mM
10mM
5 TM
5 TM
5 TM
5 TM
5 TM
5U/ TL
1X
1,5mM
200 TM
0.26 TM
0.26 TM
0.3 TM
0.34 TM
0.28 TM
2.5U
27
Quantità in 50 8L
di volume di
reazione per
campione
5 TL
3 TL
1 TL
2.6 TL
2.6 TL
3 TL
3.4 TL
2.8 TL
0.5 TL
21.1 TL
Tabella 6. Sequenze dei primers
Primer Fly B sense F1
Primer Fly B antisense R6
Primer Fly B antisense R5
Primer Fly B antisense R7
Primer Fly B antisense R1
5’ –CGCAAAGATACAGCAGTAACAACGA- 3’
5’ –CTCCTGTACTTCTGTTTTGGTTGTA- 3’
5’ –CCGGTTACAGCAGCCGTACCAG- 3’
5’ –TAATCGCCATTTTTGTCGAG- 3’
5’ –CATTTTGACCAATCTCGCGACAT- 3’
Tipizzazione Fagica
La tipizzazione fagica viene effettuata se si ha l’esigenza di
confrontare ceppi appartenenti allo stesso sierotipo e/o di
effettuare indagini epidemiologiche. La fagotipizzazione permette
infatti di differenziare i vari sierotipi in sottotipi (fagotipi) in base
alla diversa sensibilità nei confronti di un pannello di batteriofagi.
Questa tecnica sfrutta la caratteristica che hanno alcuni batteri di
possedere recettori specifici per determinati fagi sierotipo specifici
che, quindi, possono penetrare, replicarsi nella cellula e indurne la
lisi. La modalità di esecuzione e di interpretazione della tecnica
può basarsi su diversi schemi, ma quelli più comunemente
utilizzati sono quelli indicati dal Public Health Laboratory Service,
Colindale, Londra. È sicuramente una metodica molto utile, ma ha
come svantaggio quello di dipendere molto dalla capacità
interpretativa dell’operatore ed è quindi anche di difficile
28
standardizzazione. Inoltre, i reagenti non sono in commercio, e
solo presso i laboratori di riferimento nazionali è possibile
effettuare la fagotipizzazione.
Operativamente l’isolato viene seminato su piastre di
Triptycase Soy Agar (TSA) e incubato a 37°C per 18-24 ore.
Successivamente si trasferisce con un ansa la patina batterica in 4
mL di Nutrient Broth Double Strenght (DIFCO) e si incuba per 2
ore a 37°C. Contemporaneamente si trasferiscono i fagi
opportunamente diluiti in micropiastre. Le brodocolture vengono
seminate su piastre di Nutrient Agar (DIFCO), a cui vengono
aggiunti i fagi in modo da formare delle gocce ben delimitate. Le
piastre di Nutrient Agar inoculate vengono incubate a 37°C per 1824 ore. Alla fine dell’incubazione si effettua la lettura. La presenza
di lisi in corrispondenza del fago viene evidenziata mediante la
formazione di una placca circolare in cui manca la patina batterica,
o dalla presenza di placche di numero e dimensioni variabili in
caso di lisi incompleta (Anderson, 1977).
29
Tipizzazione Biomolecolare Mediante PFGE (PulsedField Gel Electrophoresis)
L’utilizzo della PFGE consente, mediante il confronto
dell’impronta del DNA (DNA fingerprinting), di capire se isolati di
Salmonella possono derivare dallo stesso clone cellulare. Questa
tecnica fornisce informazioni importanti ai fini epidemiologici.
A tal proposito, il DNA viene frammentato in frazioni di
diversa lunghezza grazie ad endonucleasi di restrizione e
successivamente viene fatto correre su un gel d’agarosio per
separare i frammenti originati e misurarne così il numero e il peso
molecolare (espresso in paia di basi: bp). Quello che si ottiene è
un profilo di restrizione unico per ciascun clone, costituito da
bande evidenziate mediante fluorescenza dalla colorazione con
bromuro
di
etido.
Tale
profilo
di
restrizione
permette
l’individuazione del ceppo esaminato e il confronto con profili
ottenuti da altri ceppi della stessa specie. Il più comune metodo di
separazione di molecole di DNA di grandezza compresa in un
range tra 0,1 Kb e 30 Kb è il gel-elettroforesi orizzontale. Quando
la misura del DNA è al di sopra delle 30 Kb, si utilizza
l’elettroforesi su
gel in
campo
30
pulsato (Pulsed-Field
Gel
Electrophoresis o PFGE). Tale tecnica ideata da Schwartz e
Cantor nel 1983 utilizza due campi elettrici con differenti
angolazioni, applicati alternativamente al gel di agarosio per
periodi di tempo definiti, dell’ordine di secondi. L’azione del primo
campo causa uno stiramento lungo il piano orizzontale delle
molecole di DNA e il loro movimento nel gel. L’interruzione di
questo campo e l’azione del secondo fa sì che le molecole si
muovano nella nuova direzione. Tenendo presente che per una
molecola a catena lunga lineare esiste una relazione tra il
cambiamento conformazionale indotto da un campo elettrico e la
lunghezza della molecola stessa, le molecole più piccole si
riallineranno più velocemente nel nuovo campo elettrico e quindi
continueranno a muoversi attraverso il gel. Molecole più grandi al
contrario impiegheranno più tempo per allinearsi. Variando
continuamente la direzione del campo elettrico sarà quindi
possibile separare le molecole quelle più piccole da quelle più
grandi. La PFGE permette di separare frammenti di DNA fino a 10
Mb.
La tecnica, secondo il protocollo PULS-NET previsto dal
circuito europeo ENTER-NET, prevede l’utilizzo di terreno in
31
piastra di TSA (Tryptone Soya Agar) su cui vengono fatti crescere
gli isolati; le cellule batteriche vengono raccolte direttamente dalle
piastre. Successivamente vengono risospese in CSB (Cell
Suspension Buffer: 100mM Tris, 100mM EDTA, pH 8) sino ad
ottenere una densità di 0,50-0,55 O.D. (unità di densità ottica) a
600 nm. Poiché il DNA cromosomico può danneggiarsi facilmente,
le cellule batteriche vengono inglobate in una matrice d’agarosio a
forma di blocchetti. Si prepara un gel d’agarosio al 2% in TE
(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8) e si lascia scendere la
temperatura del gel fino a 55°C. Contemporaneamente si
prelevano
500TL
della
sospensione
cellulare
ai
quali
si
aggiungono 20 TL di Proteinasi K (pari a 8 unità) e si unisce con
l’agarosio in modo da ottenere un rapporto 1:1; si cola in uno
stampo e si lascia solidificare per 10 minuti a 4°C. Ogni blocchetto
d’agarosio che contiene le cellule batteriche viene lasciato per 2
ore in una soluzione di lisi, ClysisB (50mM Tris, 50mM EDTA, 1%
Sarkosyl, 0,1 mg/mL Proteinasi K, pH8), in agitazione in un
bagnetto a 55°C. Il blocchetto d’agarosio con le cellule incluse
viene quindi lavato due volte utilizzando acqua distillata sterile alla
temperatura di 50°C; successivamente vengono effettuati tre
32
lavaggi in TE alla stessa temperatura. I blocchetti così ottenuti
possono essere conservati per molti mesi a 4°C per successive
analisi.
Al momento dell’analisi del DNA, uno dei tasselli conservati,
dello spessore di 3 mm, viene posto a contatto con 100 TL di una
soluzione contenente 84 TL di acqua nuclease-free, 10 TL di
Buffer di reazione, 1 TL di Bovin Serum Albumine (BSA) e 5 TL
dell’enzima XbaI. Si lascia ad incubare a 37°C over-night (in
alternativa è prevista anche un’incubazione di 4 ore a 37°C).
Si prepara un gel d’agarosio all’1% in 150 mL di TBE 0,5X,
si cola nel supporto e si lascia solidificare. Si caricano i campioni
nei pozzetti e si sigilla con l’agarosio con cui sono stati fatti i
blocchetti diluito in TE fino all’1%.
L’ apparato utilizzato per la corsa elettroforetica è del tipo
Contour-clamped Homogeneous Electric Field (CHEF) in cui gli
elettrodi sono disposti ad esagono nella vasca in modo da
generare un campo elettrico con angolo di 120° in tutte le parti del
gel. Con questa tecnica si ottengono bande molto nette e piste di
migrazione ben dritte poiché in tutte le direzioni del gel il DNA è
33
sottoposto alle stesse condizioni (6V/cm (200V), switch time 2-64
s, tempo di corsa 22 ore alla temperatura di 14°C).
Per visualizzare le bande il gel viene colorato con bromuro
d’etidio e osservato al transilluminatore UV. L’immagine del gel,
che sarà utilizzata per l’analisi e l’interpretazione dei profili, viene
fotografata, salvata in formato TIFF e analizzata con un software
(BIONUMERICS) in grado di confrontare le diverse bande ottenute
ed effettuare eventuali correlazioni tra i diversi ceppi, in modo da
capire se vi è una discendenza clonale.
34
Episodio di Tossinfezione Alimentare
Durante l’ultimo decennio, la diffusione di ceppi di
Salmonella enterica serovar 1,4,[5],12:i:-, ha subito un costante
incremento, soprattutto negli isolati di origine umana.
In Italia, nonostante il basso numero di isolamenti, questo
sierotipo risulta essere il terzo più frequentemente isolato da
campioni umani. Anche in ambito veterinario, tale sierotipo, che
risulta per lo più correlato al suino e ai prodotti derivati, risulta in
costante crescita (Echeita, 1999).
Nel maggio del 2005, in provincia di Perugia, si è verificato
un episodio tossinfettivo causato da Salmonella enterica sierotipo
4, [5], 12; i; -, legato al consumo di una porchetta contaminata,
che è stata servita in occasione di un rinfresco aziendale.
L’episodio ha coinvolto un numero piuttosto alto di persone.
Il ceppo è stato isolato da un residuo del pasto, conferito al
Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti dell’IZS (Istituto
Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche). Nei
giorni successivi, dai laboratori ospedalieri afferenti al Centro di
Riferimento Regionale Enteropatogeni dell’IZS di Perugia sono
stati inviati numerosi ceppi isolati da casi clinici, che sono risultati
35
appartenere allo stesso sierotipo. Nelle schede di notifica, solo in
due casi era citata l’associazione tra infezione e consumo di
porchetta.
L'identificazione del germe dalla matrice alimentare è stato
effettuato mediante metodo ELFA sopra descritto (VIDAS
Salmonella); successivamente si è proceduto all’isolamento
mediante il metodo descritto nella ISO 6579:2004 e alla
caratterizzazione biochimica del germe mediante sistema in
micrometodo (Rapid 20 E - Biomérieux).
Sugli stipiti di origine umana inviati all’IZS dalle varie
strutture
Ospedaliere
sieroagglutinazione
della
rapida
Regione
su
vetrino
è
stata
eseguita
utilizzando
sieri
la
del
commercio (Statens Serum Institut - DK). Sul DNA estratto dagli
isolati umani si è proceduto all’identificazione biomolecolare
mediante PCR multiplex e PFGE.
Su colonie di Salmonella isolate dalla porchetta si è
proceduto ad isolare il DNA e alla sua analisi mediante PCR
multiplex e PFGE.
Per l’interpretazione dei dati sono state seguite le linee
guida proposte da Tenover riportate in tabella 7 (Tenover, 1995).
36
Tabella 7. Criteri per l’interpretazione dei profili secondo Tenover
Categoria
Indistinguibili
Numero di
frammenti differenti
0
Strettamente correlati
2-3
Possibilmente correlati
4-6
Non correlati
Y7
37
Interpretazione
epidemiologica
Gli isolati appartengono allo
stesso caso di tossinfezione
alimentare
Gli isolati probabilmente
appartengono allo stesso caso
di tossinfezione alimentare
Gli isolati possibilmente
appartengono allo stesso caso
di tossinfezione alimentare
Gli isolati non appartengono
allo stesso caso di
tossinfezione alimentare
Risultati e Discussione
La ricerca di Salmonella effettuata sul campione di
porchetta mediante metodo ELFA sopra descritto (VIDAS
Salmonella) ha messo in evidenza la presenza di antigeni di
Salmonella
spp.,
confermata
successivamente
mediante
isolamento e test biochimici.
I risultati della PCR multiplex su DNA estratto da
Salmonella isolata da campioni umani e porchetta sono mostrati in
Figura 1.
Figura 1. Risultati Multiplex PCR
1,21: 50 pb DNA ladder (Fermentas Life Sciences); 20: controllo negative di
amplificazione; 2: S. Typhimurium (H2: 1,2 – 394pb); 3: S. Infantis (H2: 1,5 –
103pb); 4: S. Anatum (H2: 1,6 – 291pb); 5: S. Bredeney (H2: 1,7 – 195pb); 619: ceppi isolati da casi clinici correlati
38
La PCR multiplex ha messo in evidenza l’assenza in
entrambi i casi dei determinanti genetici che codificano per gli
antigeni flagellari 1.2 (394bp), 1.5 (103bp), 1.6 (291bp), 1.7 (195
bp). I 14 ceppi esaminati sono pertanto ascrivibili al sierotipo
4,[5],12:i:-.
Figura 2. Risultati della PFGE
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
2:ceppo isolato da porchetta; 3-6, 8-12, 14-17: ceppi isolati da casi clinici
correlati; 19-20: ceppi isolati da casi clinici non correlati; 1, 7, 13, 20: controllo
S. Braenderup; 18: controllo S. Senftenberg.
La PFGE del DNA isolato dal campione di porchetta ha
messo in evidenza un profilo strettamente correlato a quello del
39
DNA dei ceppi umani. Per confermare tale risultato il profilo del
DNA dei campioni esaminati è stato confrontato con il profilo di
altri ceppi appartenenti allo stesso sierotipo, isolati da casi clinici in
periodi precedenti. I risultati mostrano in questo caso un profilo
elettroforetico sostanzialmente diverso (Figura 2 ).
40
CONCLUSIONI
Alla luce delle nuove normative sull’igiene degli alimenti,
l’analisi del rischio come fondamento su cui basare la politica di
sicurezza degli alimenti rende sempre più importante una sicura
identificazione dei rischi microbiologici legati al consumo degli
alimenti. Pertanto lo sviluppo di strumenti operativi sempre più
efficienti è alla base delle strategie di controllo sulla diffusione
delle malattie alimentari.
L’incidenza totale delle malattie trasmesse dagli alimenti è
difficile da stimare, innanzitutto perché si tratta di forme morbose
nella maggior parte dei casi autolimitanti, che quindi sfuggono ai
normali canali di notifica.
In molti episodi di tossinfezione alimentare, le indagini
epidemiologiche spesso non consentono di identificare l’agente
eziologico che li ha prodotti; questo perché sono tanti gli “attori”
preposti alla gestione dell’episodio tossinfettivo (Operatori del
Pronto Soccorso, Medici di base, Veterinari, Laboratoristi,
Epidemiologi,…) e spesso non si interfacciano tra loro. Di
conseguenza
risulta
spesso
impossibile
tossinfezione all’alimento che l’ha causata.
41
correlare
una
Pertanto il sistema di sorveglianza per le Salmonelle
adottato dalla rete ENTER-NET sembra essere oggi un sistema
efficace di congiunzione tra i diversi operatori, oltre a risultare un
ottimo strumento di informazione e controllo epidemiologico.
Inoltre, lo studio genomico dei ceppi batterici isolati da casi
di tossinfezione mediante la tecnica della elettroforesi in campo
pulsato (PFGE), proposto dallo stesso circuito europeo, è
riconosciuto a livello internazionale come il metodo di eccellenza
per la subtipizzazione dei ceppi di Salmonella e di altri
enteropatogeni.
L’analisi
genetica
mediante
PFGE
è
particolarmente discriminante, consentendo la suddivisione degli
isolati batterici in clusters definiti, riconducibili ad una determinata
situazione epidemica, laddove i metodi classici di tipizzazione
(sierologica e fagotipica) non lo consentono.
Tale metodica consente di rilevare i pulsotipi circolanti in
ambito
umano,
animale,
alimentare
e
ambientale
in
un
determinato distretto e di valutare le eventuali correlazioni tra gli
stipiti circolanti, fornendo dati per impostare studi di carattere
epidemiologico.
42
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