hGH-EASIA

Transcript

hGH-EASIA

hGH-EASIA
KAP1081
DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue de l'Industrie, 8 - B-1400 Nivelles - Belgium
: 090504/1
en
Read entire protocol before use.
hGH-EASIA
I.
INTENDED USE
Immunoenzymetric assay for the in vitro quantitative measurement of human Growth Hormone (hGH)
in serum and plasma.
II.
GENERAL INFORMATION
A.
Proprietary name :
DIAsource hGH-EASIA Kit
B.
Catalogue number :
KAP1081 : 96 tests
C.
Manufactured by :
DIAsource ImmunoAssays S.A.
Rue de l'Industrie, 8, B-1400 Nivelles, Belgium.
For technical assistance or ordering information contact :
Tel : +32 (0)67 88.99.99
Fax : +32 (0)67 88.99.96
III. CLINICAL BACKGROUND
A.
Biological activities
hGH is a polypeptide hormone (molecular weight 21,500 Da) produced by the acidophil cells of the anterior
pituitary under the control of two main substances from the median eminence : Growth-hormone Releasing
Factor (GRF) and an inhibitory agent, somatostatin. Dopaminergic, adrenergic and serotoninergic
neuroendocrine pathways also play an important role in the control of hGH secretion. Excitatory stimuli of
hGH secretion include hypoglycemia, exercise, fasting, meals with a high protein content, deep sleep, stress,
glucagon, L Dopa, amino acids, etc. Inhibitory stimuli include glucose, cortisol, hGH and free fatty acids.
Because of its short plasma half life (±25 minutes) and of the frequent excitatory or inhibitory stimuli, hGH
displays frequent and large variations of concentration in serum.
One of the main physiological functions of hGH is to act on the liver and other tissues to produce
somatomedins, which in turn induce growth by direct action on target tissues. In contrast to hGH, the
concentration of somatomedins in serum is kept stable by virtue of being largely bound to circulating plasma
proteins.
B.
·
Clinical application
Growth retardation
hGH hyposecretion is one of the various causes of small stature in children. Serum hGH measurement with
a highly sensitive assay, especially following a provocative stimulus (absence of response), is an important
way to establish this diagnosis because this group of patients can be treated by administration of hGH.
Hypopituitarism
Serum hGH measurement is also an index of pituitary function when hypopituitarism (either idiopathic or
due to tumour and surgery) is suspected.
Gigantism and acromegaly
Serum hGH measurement, especially following a provocative inhibitory test (absence of response), is an
important way to establish the diagnosis of hGH hypersecretion due to acidophilic pituitary tumour. This
results in gigantism in children and acromegaly in adults. Both of these disorders may be treated by surgery
or radiation.
·
·
IV.
PRINCIPLES OF THE METHOD
The DIAsource HGH-EASIA is a solid phase Enzyme Amplified Sensitivity
Immunoassay performed on a microtiterplate.
Calibrators and samples react
with the capture monoclonal antibody (MAb 1) coated on microtiter well and with
a monoclonal antibody (MAb 2) labelled with horseradish peroxidase (HRP).
After an incubation period allowing the formation of a sandwich: coated MAb 1 –
hGH – MAb 2 – HRP, the microtiterplate is washed to remove unbound enzyme
labelled antibody.
Bound enzyme-labelled antibody is measured through a
chromogenic reaction. The Chromogenic Solution (TMB – H2O2) is added and
incubated. The reaction is stopped with the addition of Stop Solution and the
microtiterplate is then read at the appropriate wavelength.
The amount of
substrate turnover is determined colourimetrically by measuring the absorbance,
which is proportional to the hGH concentration.
A calibration curve is plotted and hGH concentration in samples is determined by
interpolation from the calibration curve.
V.
6.
Microtiterplate reader capable of reading at 450 nm and 650 nm
(bichromatic reading)
VII.
REAGENT PREPARATION
A.
B.
C.
D.
Calibrators : Reconstitute the zero calibrator with 2.0 ml distilled water
and the other calibrators with 0.5 ml distilled water.
Controls : Reconstitute the controls with 0.5 ml distilled water.
Working anti-hGH-HRP conjugate: Prepare an adequate volume of
conjugate solution by adding 25 µl of the concentrated anti-hGH-HRP
conjugate to 1 ml of conjugate buffer. Use a vortex to homogenize.
Extemporaneous preparation is recommended.
Working Wash Solution : Prepare an adequate volume of Working Wash
Solution by adding 199 volumes of distilled water to 1 volume of Wash
Solution (200x). Use a magnetic stirrer to homogenize. Discard unused
Working Wash Solution at the end of the day.
REAGENTS PROVIDED
Reagents
Breakable microtiterplate
with 96 anti hGH
(monoclonal antibodies)
coated wells
Ab
HRP
CONC
96 tests
Kit
Color
Code
96 wells
blue
Reconstitution
§
Ready to use
BUF
1 vial
0,2 ml
yellow
Dilute 40X with
conjugate buffer
0
1 vial
red
Ready to use
N
1 vial
lyophilized
yellow
5 vials
lyophilized
yellow
1 vial
10 ml
brown
Add 2.0 ml distilled
water
water
Calibrator N = 1 to 5
(see exact values on vial labels) in
sheep serum and thymol
WASH
SOLN
CONC
Wash Solution (Tris-HCl)
CONTROL
N
Dilute 200 x with
distilled water (use a
magnetic stirrer).
2 vials
lyophilized
silver
water
1 vial
12 ml
brown
Ready to use
1 vial
12 ml
white
Ready to use
Controls - N = 1 or 2
in human serum with thymol
CHROM
TMB
Chromogen TMB Solution
(Tetramethylbenzydine)
STOP
SOLN
Stop Solution: HCl 1N
Note: 1. Use the zero calibrator for sample dilutions.
2. 1 µIU of the calibrator preparation is equivalent to 1 µIU of the 2nd IS
98/574.
VI.
§
6 ml
Zero calibrator in sheep serum
and thymol
CAL
§
§
§
Conjugate buffer: TRIS-HCl
buffer with bovine serum albumin
and thymol
CAL
§
§
Conjugate: HRP labelled anti-hGH
(monoclonal antibodies) in
stabilizing buffer
CONJ
VIII. STORAGE AND EXPIRATION DATING OF REAGENTS
SUPPLIES NOT PROVIDED
The following material is required but not provided in the kit:
1.
High quality distilled water
2.
Pipettes for delivery of: 50 μl, 200 µl, 500 µl and 2 ml (the use of accurate
pipettes with disposable plastic tips is recommended)
3.
Vortex mixer
4.
Magnetic stirrer
5.
Washer for microtiterplates
Before opening or reconstitution, all kits components are stable until the
expiry date, indicated on the vial label, if kept at 2 to 8°C.
Unused wells must be stored, at 2-8°C, in a sealed bag containing a
desiccant until expiration date.
After reconstitution, calibrators and controls are stable for 1 week at 2 to
8°C. For longer storage periods, aliquots should be made and kept at
-20°C. Avoid successive freeze thaw cycles.
The concentrated Wash Solution is stable at room temperature until
expiration date.
Freshly prepared Working Wash Solution should be used on the same day.
After its first use, the conjugate is stable until expiry date, if kept in the
original well-closed vial at 2 to 8°C.
Alterations in physical appearance of kit reagents may indicate instability
or deterioration.
IX.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
§
§
§
Serum and plasma must be kept at 2 - 8°C.
If the test is not run within 24 hours, storage in aliquots at -20°C is
recommended. Avoid subsequent freeze thaw cycles.
Prior to use, all samples should be at room temperature. It is
recommended to vortex the samples before use.
Serum, heparinized plasma or EDTA plasma provide similar results.
Y(serum) = 0.89 x (EDTA plasma) + 0.14 µIU/ml
r=0.98 n=46
Y(serum) = 1.02 x (Heparin plasma) + 0.01 µIU/ml
r=0.98 n=46
Do not use haemolysed samples.
X.
PROCEDURE
A.
Handling notes
Do not use the kit or components beyond expiry date.
Do not mix materials from different kit lots.
Bring all the reagents to room temperature prior to use.
Thoroughly mix all reagents and samples by gentle agitation or swirling.
Perform calibrators, controls and samples in duplicate. Vertical alignment
is recommended.
Use a clean plastic container to prepare the Wash Solution.
In order to avoid cross-contamination, use a clean disposable pipette tip
for the addition of each reagent and sample.
For the dispensing of the Chromogenic Solution and the Stop Solution
avoid pipettes with metal parts.
High precision pipettes or automated pipetting equipment will improve the
precision.
Respect the incubation times.
To avoid drift, the time between pipetting of the first calibrator and the last
sample must be limited to the time mentioned in section XIII paragraph E
(Time delay).
Prepare a calibration curve for each run, do not use data from previous
runs.
Dispense the Chromogenic Solution within 15 minutes following the
washing of the microtiterplate.
During incubation with Chromogenic Solution, avoid direct sunlight on
the microtiterplate.
§
§
B.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Procedure
Select the required number of wells for the run. The unused wells should
be resealed in the bag with a desiccant and stored at 2-8°C.
Secure the wells into the holding frame.
Pipette 50 µl of each Calibrator, Control and Sample into the appropriate
wells.
Pipette 50 µl of working anti-hGH-HRP conjugate into all the wells.
Incubate for 30 minutes at room temperature – It is mandatory to respect
the 30 minute-duration of this incubation
Aspirate the liquid from each well.
Wash the plate 3 times by:
§ Dispensing 0.4 ml of Wash Solution into each well
§ Aspirating the content of each well
Pipette 100 µl of the Chromogenic Solution into each well within 15
minutes following the washing step.
Incubate the microtiterplate for 30 minutes at room temperature, avoid
direct sunlight.
Pipette 100 µl of Stop Solution into each well.
Read the absorbencies at 450 nm (reference filter 630 nm or 650 nm)
within 1 hour and calculate the results as described in section XI.
XI.
CALCULATION OF RESULTS
1.
Read the plate at 450 nm against a reference filter set at 650 nm (or 630
nm).
Calculate the mean of duplicate determinations.
On semi-logarithmic or linear graph paper plot the OD values (ordinate)
for each calibrator against the corresponding concentration of hGH
(abscissa) and draw a calibration curve through the calibrator points by
connecting the plotted points with straight lines.
Read the concentration for each control and sample by interpolation on the
calibration curve.
Computer assisted data reduction will simplify these calculations. If
automatic result processing is used, a 4-parameter logistic function curve
fitting is recommended.
2.
3.
4.
5.
XII.
C.
Precision
INTRA ASSAY
Serum
N
<X> ± SD
(μIU/ml)
CV
(%)
Serum
N
<X> ± SD
(μIU/ml)
CV
(%)
A
B
20
20
6.90 ± 0.34
16.61 ± 0.90
4.9
5.4
A
B
8
8
11..4 ± 0.9
23.5 ± 1.2
8.1
5.1
SD : Standard Deviation; CV: Coefficient of variation
D.
Accuracy
RECOVERY TEST
Sample
Serum
Plasma
Calibrator
0.030
0.062
0.226
0.501
1.429
2.330
hGH C1
hGH C2
µIU/ml
µIU/ml
-
1.9
13.5
hCG 100000 mIU/ml
2.0
14.3
hPL 10000 ng/ml
1.4
13.0
PRL 12500 ng/ml
1.8
12.6
4.3
13.5
26.8
52.1
4.6
13.2
25.3
53.0
106
98
94
102
48.8
24.4
12.2
6.1
3.1
97.7
57.0
27.7
13.6
6.4
3.0
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
10.6
5.3
2.7
1.3
0.7
21.2
9.3
4.6
2.2
1.1
0.6
Serum 2
Theoretical Concent.
(μIU/ml)
Measured Concent.
(μIU/ml)
Samples were diluted with zero calibrator.
Conversion factor :
1µIU hGH-EASIA Calibrator = 0.33 ng
Time delay between last calibrator and sample dispensing
As shown hereafter, assay results remain accurate even when a sample is
dispensed 60 minutes after the calibrators have been added to the coated
wells.
TIME DELAY
S1
S2
F.
added Hormone
95
95
105
113
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
Detection Limit
Twenty zero calibrators were assayed along with a set of other calibrators.
The detection limit, defined as the apparent concentration two standard
deviations above the average OD at zero binding, was 0.17 μIU/ml.
Cross-reactive hormones were added to a low and to a high hGH value
Control sample. The apparent hGH response was measured.
4.1
12.8
28.1
58.9
Serum 1
XIII. PERFORMANCE AND LIMITATIONS
Specificity
4.3
13.5
26.8
52.1
Dilution
E.
B.
Recovery
(%)
Sample
OD units
0.00 μIU/ml
0.45 μIU/ml
5.40 μIU/ml
12.90 μIU/ml
43.50 μIU/ml
98.00 μIU/ml
Recovered hGH
(μIU/ml)
DILUTION TEST
The following data are for illustration only and should never be used instead of
the real time calibration curve.
A.
Added hGH
(μIU/ml)
TYPICAL DATA
hGH-EASIA
INTER ASSAY
0 min
10 min
20 min
30 min
45 min
60 min
4.0
13.5
3.6
15.0
3.3
13.8
3.3
13.0
3.0
12.6
3.8
13.0
Hook effect
A sample spiked with hGH up to 4000 μIU/ml gives higher OD’s than the
last calibrator point.
XIV. INTERNAL QUALITY CONTROL
§
§
If the results obtained for Control 1 and/or Control 2 are not within the
range specified on the vial label, the results cannot be used unless a
satisfactory explanation for the discrepancy has been given.
If desirable, each laboratory can make its own pools of control samples,
which should be kept frozen in aliquots. Controls that contain azide will
interfere with the enzymatic reaction and cannot be used.
Acceptance criteria for the difference between the duplicate results of the
samples should rely on Good Laboratory Practises
It is recommended that Controls be routinely assayed as unknown samples
to measure assay variability. The performance of the assay should be
monitored with quality control charts of the controls.
It is good practise to check visually the curve fit selected by the computer.
XV.
REFERENCE INTERVALS
§
§
§
These values are given only for guidance; each laboratory should establish its
own normal range of values.
In normal subjects, growth hormone (hGH) secretion is pulsatile. During daytime, hGH concentrations range from <0.2-10 μIU/ml. During sleep, hGH
concentrations increase consistently (± 30 μIU/ml).
hGH secretion is greatly stimulated by exercise and stress (venous puncture,
hypoglycemia, ...), but is decreased by hyperglycemia.
In normal subjects (n=34), two hours after oral glucose load (75 g in adults), hGH
levels were lower than 10 μIU/ml and the hGH response to stimulation tests
(insulin, arginine, glucagon administration) exceeded 20 μIU/ml.
hGH levels were elevated (even after glucose load) in acromegaly (> 10 μIU/ml).
In hGH deficiency, the response to stimulation test is absent or blunted (short
stature by hGH deficiency; hypopituitarism from various origins).
3.
DROBNY E.C., AMBURN K., BAUMANN G. (1983)
Circadian variation of basal plasma growth hormone in man.
J. Clin. Endo. and Metab., 57:524-528.
4.
HASHIDA S., NAKAWAGA K., ISHIKAWA E., OHTAKI S. (1985)
Basal level of human growth hormone (hGH) in normal serum.
Clin. Chim. Acta, 151:185-186.
5.
LEWIS V.J. et al. (1980)
Human growth hormone : A complex of proteins.
Rec. Progr. Horm. Res., 36:488.
6.
LI C.H. (1974)
Human growth hormone : perspective on its chemistry and
physiology.
In : "Advances in human growth hormone research", S. Raiti ed. U.S.
Department of Health, Education and Welfare Publ. DMEW publ. no.
(NJH) 74-612, p. 321.
7.
REUTENS AT. (1995)
Evaluation and application of a highly sensitive assay for serum
growth hormone (GH) in the study of adult GH deficiency.
J. Clin. Endocrinol. Metab., 80(2): 480-485
8.
CROWLEY S. et al. (1995)
Growth and the growth hormone axis in prepubertal children with
asthma.
J. Pediatr. 126(2): 297-303.
9.
KELLY JT. et al. (1993)
Effect of different oral oestrogen formulations on insulin-like growth
factor I, growth hormone and growth hormone binding protein in
post-menopausal women.
Clin. Endocrinol. 39(5) : 561-567
XVI. PRECAUTIONS AND WARNINGS
Safety
For in vitro diagnostic use only.
The human blood components included in this kit have been tested by European
approved and/or FDA approved methods and found negative for HBsAg, antiHCV, anti-HIV-1 and 2. No known method can offer complete assurance that
human blood derivatives will not transmit hepatitis, AIDS or other infections.
Therefore, handling of reagents, serum or plasma specimens should be in
accordance with local safety procedures.
All animal products and derivatives have been collected from healthy animals.
Bovine components originate from countries where BSE has not been reported.
Nevertheless, components containing animal substances should be treated as
potentially infectious.
Avoid any skin contact with all reagents. In case of contact, wash thoroughly with
water.
Do not smoke, drink, eat or apply cosmetics in the working area. Do not pipette
by mouth. Use protective clothing and disposable gloves.
XVIII.
SUMMARY OF THE PROTOCOL
CALIBRATORS
(µl)
SAMPLE(S)
CONTROLS
(µl)
50
50
50
50
Calibrators (0-5)
Controls, Samples
Working Anti-hGH-HRP
conjugate
Incubate for 30 minutes at room temperature
Aspirate the contents of each well.
Wash 3 times with 400 µl of Wash Solution and aspirate.
Chromogenic Solution
100
100
XVII. BIBLIOGRAPHY
1.
2.
CAMANNI F., MASSARA F., BELFORTE L., ROSATELLO A.,
MOLENATTI G.M. (1977)
Effect of dopamine on plasma growth hormone and prolactin levels in
normal and acromegalic subjects.
J. Clin. Endo. and Metab., 44:465.
DAUGHADAY W.H. (1981)
The adenohypophysis
In : "Textbook of Endocrinology", R.H. Williams ed., W.B. Saunders,
Philadelphia, p;73.
Incubate for 30 minutes at room temperature
Stop Solution
100
100
Read on a microtiterplate reader and record the absorbance of each well at 450 nm
(versus 630 or 650 nm).
DIAsource Catalogue Nr :
KAP1081
P.I. Number :
1700573/en
Revision nr :
090504/1
Revision date : 2009-05-04
fr
Lire entièrement le protocole avant utilisation.
hGH-EASIA
I.
BUT DU DOSAGE
Trousse de dosage immunoenzymatique pour la mesure quantitative in vitro de l’hormone de
croissance (hGH) dans le sérum et le plasma humain.
II.
INFORMATIONS GENERALES
A.
Nom du produit :
B.
Numéro de catalogue : KAP1081 : 96 tests
C.
Fabriqué par :
DIAsource hGH-EASIA kit
Rue de l'Industrie, 8 B-1400 Nivelles Belgium.
Pour une assistance technique ou une information sur une commande :
Tel : +32 (0)67 88.99.99
Fax : +32 (0)67 88.99.96
III. CONTEXTE CLINIQUE
A.
Activités biologiques
La hGH est une hormone polypeptide (poids moléculaire 21,500 Da) produites par les cellules acidophiles
de l’hypophyse antérieure sous contrôle de deux substances principales : le facteur de libération de
l’hormone de croissance (GRF) et un agent inhibiteur, la somatostatine. Les voies neuro-endocrines
dopaminergiques, adrénergiques et sérotoninergiques jouent également un rôle important dans le contrôle de
la sécrétion de la hGH. Les stimulus excitateurs de la sécrétion en hGH sont provoqués par l’hypoglycémie,
le sport, le jeûne, des repas hautement protéiques, le sommeil profond, le stress, glucagon, L Dopa, les
acides aminés, etc. Les stimulus inhibiteurs sont provoqués par le glucose, le cortisol, la hGH et les acides
gras libres. Du fait de sa courte demi-vie (±25 minutes) et de la fréquence des stimulus excitateurs ou
inhibiteurs, la concentration de la hGH varie fréquemment de façon irrégulière dans le sérum.
Une des principales fonctions physiologiques de la hGH est d’agir sur le foie et d’autres tissus pour produire
la Somatomédine, qui induit alors la croissance par action directe sur les tissus cibles. En contraste avec la
hGH, la concentration de somatomédine dans le sérum reste stable car la grande partie est liée aux protéines
de plasma de circulation.
B.
·
Application clinique
Retard de croissance
L’hyposécrétion en hGH est une des causes différentes de la petite taille chez les enfants. Le dosage de la
hGH sérique avec un test hautement sensible, particulièrement après un stimulus provocateur (absence de
réponse), est important pour établir ce diagnostic car ce groupe de patients peut être traité par administration
de hGH.
Hypopituitarisme
Le dosage en hGH sérique est également un index de la fonction pituitaire lorsque l’hypopituitarisme est
suspecté (soit idiopathique ou dû à une tumeur ou chirurgie).
Gigantisme et acromégalie
Le dosage en hGH sérique, particulièrement après un test provocateur inhibiteur (absence de réponse), est
important pour établir le diagnostic de l’hypersécrétion en hGH due à une tumeur pituitaire acidophilique.
Ceci résulte en un gigantisme chez les enfants et une acromégalie chez les adultes. Les deux
disfonctionnements peuvent être traités par chirurgie ou radiation.
·
·
IV.
PRINCIPES DU DOSAGE
VII.
La DIAsource hGH-EASIA est une « Enzyme Amplified Sensitivity
Immunoassay » en phase solide effectuée sur des micro-plaques. Les calibrateurs
et les échantillons réagissent avec l’anticorps de capture monoclonal (MAb 1)
recouvrant les puits et avec un anticorps monoclonal (MAb 2) marqué avec la
peroxydase (HRP). Après une période d’incubation permettant la formation d’un
sandwich: MAb 1 recouvert – hGH – MAb 2 – HRP, la micro-plaque est lavée
afin d’enlever l’anticorps libre marqué enzymatiquement. L’anticorps lié marqué
enzymatiquement est mesuré avec une réaction chromogénique. Une solution
chromogénique (TMB – H2O2) est ajoutée et incubée. La réaction est arrêtée avec
l’addition de Solution d’arrêt et la micro-plaque est alors lue à la longueur d’onde
appropriée. La quantité de remplacement de substrat est déterminée
colorimétriquement par la mesure de l’absorbance, qui est proportionnelle à la
concentration en hGH.
Une courbe de calibration est dessinée et la concentration en hGH dans les
échantillons est déterminée par interpolation de la courbe de calibration.
A.
B.
C.
D.
PREPARATION DES REACTIFS
Calibrateurs : Reconstituer le calibrateur zéro avec 2,0 ml d’eau distillée et
les autres calibrateurs avec 0,5 ml d’eau distillée..
Contrôles : Reconstituer les contrôles avec 0,5 ml d’eau distillée.
Conjugué anti-hGH-HRP de travail: Préparer un volume adéquat de
conjugué anti-hGH-HRP de travail en ajoutant 25 µl du conjugué anti-hGHHRP concentré (40x) à 1 ml de tampon du conjugué. Utiliser un agitateur
magnétique pour homogénéiser. Il est recommandé de faire une dilution
extemporanée.
Solution de Lavage : Préparer un volume adéquat de Solution de Lavage en
ajoutant 199 volumes d’eau distillée à 1 volume de Solution de Lavage
(200x). Utiliser un agitateur magnétique pour homogénéiser. Eliminer la
Solution de Lavage non utilisée à la fin de la journée.
VIII. STOCKAGE ET DATE D’EXPIRATION DES REACTIFS
V.
REACTIFS FOURNIS
Reactifs
Micro-plaque de titration
sécable avec 96 puits
recouvert d’anti hGH
(anticorps monoclonal)
Ab
HRP
CONC
§
96 tests
Kit
Code
Couleur
Reconstitution
96 puits
bleu
Prêt à l’emploi
1 flacon
0,2 ml
Jaune
Diluer 40 x avec le
tampon du conjugué
1 flacon
6 ml
Rouge
§
Conjugué: anti-hGH marqué avec de
l’HRP (anticorps monoclonal) dans
un tampon stabilisant
§
§
§
§
§
CONJ
BUF
Prêt à l’emploi
Tampon du conjugué: un tampon
TRIS-HCl avec de l'albumine bovine
et du thymol
CAL
IX.
1 flacon
lyophilisé
0
Jaune
Ajouter 2,0 ml d’eau
distillée
Calibrateur zéro dans du sérum de
brebis et du thymol
CAL
§
§
5 flacons
lyophilisés
N
Jaune
distillée
Calibrateur N = 1 à 5
(cfr. Valeurs exactes sur chaque
flacon) dans du sérum de brebis et du
thymol
WASH
SOLN
CONC
N
§
§
1 flacon
10 ml
Brun
Solution de Lavage
(Tris-HCl)
CONTROL
§
§
Diluer 200 x avec de
l’eau distillée (utiliser
un agitateur
magnétique).
2 flacons
lyophilisés
Gris
distillée
1 vial
12 ml
Brun
Prêt à l’emploi
1 vial
12 ml
Blanc
Prêt à l’emploi
TMB
SOLN
A.
Notes de manipulation
Ne pas utiliser la trousse ou ses composants après avoir dépassé la date
d’expiration.
Ne pas mélanger du matériel provenant de trousses de lots différents.
Mettre tous les réactifs à température ambiante avant utilisation.
Mélangez tous les réactifs et les échantillons sous agitation douce.
Réaliser les calibrateurs, les contrôles et les échantillons en double. Un
alignement vertical est recommandé.
Utiliser un récipient en plastic propre pour préparer la Solution de Lavage.
Pour éviter toute contamination croisée, utiliser une nouvelle pointe de
pipette pour l’addition de chaque réactif et échantillon.
Pour la distribution de la solution du chromogène et de la solution d’arrêt,
éviter des pipettes avec des parties en métal.
Des pipettes de haute précision ou un équipement de pipetage automatique
permettent d’augmenter la précision.
Respecter les temps d’incubation.
Afin d’éviter des anomalies, le délai entre le pipetage du premier
calibrateur et celui du dernier échantillon doit être limité au délai indiqué à
la section XIII paragraphe E (Délai).
Préparer une courbe d’étalonnage pour chaque nouvelle série
d’expériences, ne pas utiliser les données d’expériences précédentes.
Distribuer la solution du chromogène dans les 15 minutes après le lavage
de la micro-plaque de titration.
Eviter exposition à la lumière du soleil lors de l’incubation avec la solution
du chromogène.
B.
1.
Mode opératoire
Sélectionner le nombre de barrettes nécessaires pour le test. Les barrettes
inutilisées doivent être cachetées de nouveau dans le sachet avec un
desiccant et gardées à 2-8°C.
Solution d’arrêt: HCl 1N
Note: 1.
2.
VI.
Utiliser le calibrateur zéro pour la dilution des échantillons.
1 μIU de la préparation du calibrateur est équivalent à 1 μIU de 2nd
IS 98/574.
MATERIELS NON FOURNIS
Le matériel mentionné ci-dessous est requis mais non fourni avec la trousse:
1.
Eau distillée d’une haute qualité
2.
Pipettes pour distribuer: 50 μl, 200 µl, 500 μl et 2 ml (l’utilisation de
pipettes précises et de pointes en plastique est recommandée)
3.
Agitateur vortex
4.
Agitateur magnétique
5.
Laveur de micro-plaques
6.
Lecteur de micro-plaques capable de lire à 450 nm et 650 nm (lecture
bichromatique)
Les échantillons de sérum ou de plasma doivent être gardés entre 2 et 8°C.
Si le test n’est pas réalisé dans les 24 heures, un stockage en aliquots à
-20°C est recommandé.
Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs.
Avant l’utilisation des échantillons, ceux-ci doivent être à température
ambiante. On recommande de vortexer les échantillons avant de les utiliser.
Le sérum ou le plasma (héparnés ou EDTA) donne des résultats similaires.
Y(sérum) = 0,89 x (plasma EDTA) + 0,14 r=0.98
n=46
Y(sérum) = 1,02 x (plasma hép.) + 0.01
r=0.98
n=46
Ne pas utiliser d’échantillons hémolysés
MODE OPERATOIRE
Solution Chromogène TMB
(Tetramethylbenzydine)
STOP
PREPARATION ET STABILITE DE L’ECHANTILLON
X.
Contrôles - N = 1 ou 2 dans du sérum
humain et du thymol
CHROM
Avant l’ouverture ou la reconstitution, tous les composants de la trousse
sont stables jusqu’à la date d’expiration, indiquée sur l’étiquette, si la
trousse est conservée entre 2 et 8°C.
Des barrettes inutilisées doivent être gardées, à 2-8°C, dans un sachet
cacheté contenant un desiccant jusqu’à la date d’expiration.
Après reconstitution, les calibrateurs et les contrôles sont stables pendant 7
jours entre 2 et 8°C. Pour de plus longues périodes de stockage, des aliquots
devront être réalisés et ceux-ci seront gardés à –20°C pendant 3 mois.
Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs.
La Solution de Lavage concentrée est stable à température ambiante jusqu’à
la date d’expiration.
La Solution de Lavage préparée doit être utilisée le jour même.
Après la première utilisation, le conjugué est stable jusqu’à la date
d’expiration, si celui-ci est conservé entre 2 et 8°C dans le flacon d’origine
correctement fermé.
Des altérations dans l’apparence physique des réactifs de la trousse peuvent
indiquer une instabilité ou une détérioration.
2.
3.
Placer les barrettes dans le support.
Pipeter 50 µl de chaque Calibrateur, Contrôle et Echantillon dans les puits
appropriés.
Pipeter 50 µl du conjugué anti-hGH-HRP de travail dans tous les puits.
Incuber pendant 30 minutes à température ambiante Il est obligatoire de
respecter la durée de trente minutes pour cette incubation.
Aspirer le liquide de chaque puits.
Laver la plaque 3 fois en:
§
distribuant 0,4 ml de la Solution de Lavage dans chaque puits
§
aspirant le contenu de chaque puits
Pipeter 100 µl de la solution chromogène dans chaque puits dans les 15
minutes après la phase de lavage.
Incuber la micro-plaque pendant 30 minutes à température ambiante,
éviter exposition à la lumière du soleil.
Pipeter 100 µl de la Solution d’arrêt dans chaque puits.
Lire les absorbances à 450 nm (filtre de référence 630 nm ou 650 nm)
endéans l’heure et calculer les résultats comme décrits dans la section XI.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
D. Exactitude
TEST DE RECUPERATION
Echantillon
hGH ajoutée
(μIU/ml)
hGH récupérée
(μIU/ml)
Récupération
(%)
Sérum
4,3
13,5
26,8
52,1
4,1
12,8
28,1
58,9
95
95
105
113
Plasma
4,3
13,5
26,8
52,1
4,6
13,2
25,3
53,0
106
98
94
102
TEST DE DILUTION
XI.
CALCUL DES RESULTATS
1.
Lire la plaque à 450 nm contre un filtre de référence mis à 650 nm (ou 630
nm).
Calculer la moyenne de chaque détermination réalisée en double.
Dessiner sur un graphique linéaire ou semi-logarithmique les cpm
(ordonnées) pour chaque calibrateur contre la concentration
correspondante en hGH (abscisses) et dessiner une courbe de calibration à
l’aide des points de calibration, en connectant les points avec des lignes
droites.
Lire la concentration pour chaque contrôle et échantillon par interpolation
sur la courbe de calibration.
L’analyse informatique des données simplifiera les calculs. Si un système
d’analyse de traitement informatique des données est utilisé, il est
recommandé d’ utiliser la fonction « 4 paramètres » du lissage de courbes.
2.
3.
4.
5.
Echantillon
Dilution
Concent. théorique
(μIU/ml)
Concent. Mesurée
(μIU/ml)
Sérum 1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
48,8
24,4
12,2
6,1
3,1
97,7
57,0
27,7
13,6
6,4
3,0
Sérum 2
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
10,6
5,3
2,7
1,3
0,7
21,2
9,3
4,6
2,2
1,1
0,6
Les échantillons ont été dlilué avec le calibrateur zéro.
XII.
DONNEES TYPES
Les données représentées ci-dessous sont fournies pour information et ne peuvent
jamais être utilisées à la place d’une courbe d’étalonnage.
hGH-EASIA
Calibrateur
Unités OD
0 μIU/ml
0,45 μIU/ml
5,4 μIU/ml
12,9 μIU/ml
43,5 μIU/ml
98,0 μIU/ml
Facteur de conversion:
1µIU de la préparation du calibrateur hGH-EASIA = 0,33 ng
E.
Délai entre la distribution du dernier calibrateur et celle de
l’échantillon
Comme montré ci-dessous, les résultats d’un essai restent précis même quand un
échantillon est distribué 60 minutes après que le calibrateur a été ajouté aux tubes
avec l’anticorps.
0,030
0,062
0,226
0,501
1,429
2,330
DELAI
S1
S2
0 min
10 min
20 min
30 min
45 min
60 min
4,0
13,5
3,6
15,0
3,3
13,8
3,3
13,0
3,0
12,6
3,8
13,0
XIII. PERFORMANCE ET LIMITES
A.
Sensibilité
Vingt calibrateurs zéro ont été testés en parallèle avec un assortiment d’autres
calibrateurs. La limite de détection, définie comme la concentration apparente
située 2 déviations standards au-dessus de la moyenne DO déterminée à la
fixation zéro, était de 0,17 μIU/ml.
B.
Spécificité
Des hormones cross-réactives ont été ajoutées à un control de valeur haute en
hGH et à un control de valeur basse. La réponse hGH apparente a été mesurée.
hGH C1
hGH C2
Hormone ajoutée
µIU/ml
µIU/ml
-
1,9
13,5
hCG 100000 mIU/ml
2,0
14,3
hPL 10000 ng/ml
1,4
13,0
PRL 12500 ng/ml
1,8
12,6
C.
F.
XIV. CÔNTROLE DE QUALITE INTERNE
§
§
§
§
§
Précision
INTRA-ESSAI
Effet crochet
Un échantillon dopé avec de l’hGH jusqu’à 4000 μIU/ml donne des DO
supérieurs au dernier point de calibration.
Si les résultats obtenus pour le(s) contrôle(s) 1 et/ou 2 ne sont pas dans
l’intervalle spécifié sur l’étiquette du flacon, les résultats ne peuvent pas être
utilisés à moins que l'on ait donné une explication satisfaisante de la nonconformité.
Chaque laboratoire est libre de faire ses propres stocks d’échantillons
contrôles, lesquels doivent être congelés aliquotés. Des contrôles qui
contiennent de l’azide influenceront la réaction enzymatique et ne peuvent
pas être utilisés.
Les critères d’acceptation pour les écarts des valeurs in duplo des
échantillons doivent être basés sur les pratiques de laboratoire courantes.
On recommande que les contrôles soient testés de façon routinière comme
des échantillons inconnus pour mesurer la variabilité du test. La réalisation
du test doit être suivie avec des fichiers de contrôle de qualité des contrôles.
On recommande de vérifier visuellement la courbe sélectionnée par
l’ordinateur.
INTER-ESSAI
Serum
N
<X> ± SD
(μIU/ml)
CV
(%)
Serum
N
<X> ± SD
(μIU/ml)
CV
(%)
A
B
20
20
6,90 ± 0,34
16,61 ± 0,90
4,9
5,4
A
B
8
8
11,4 ± 0,9
23,5 ± 1,2
8,1
5,1
SD : Déviation Standard; CV: Coéfficient de variation
XV.
VALEURS ATTENDUES
Les valeurs sont donnés à titre d’ information; chaque laboratoire doit établir ses
propres écarts de valeurs.
Chez les sujets normaux, la sécrétion de l’hormone de croissance (hGH) est
pulsatile. Durant la journée, le domaine des concentrations en hGH est <0,2-10
μIU/ml. Pendant le sommeil, les concentrations en hGH augmentent constamment
(± 30 μIU/ml).
La sécrétion en hGH est fortement stimulée par le sport et le stress (ponction
veineuse, hypoglycémie, ...), mais décroît en hyperglycémie.
Chez les sujets normaux (n=34), deux heures après une prise orale de glucose (75
g pour les adultes), les taux en hGH étaient inférieurs à 10 μIU/ml et la réponse
hGH aux tests de stimulation (administration d’insuline, arginine, glucagon)
excédait 20 μIU/ml.
Les taux en hGH étaient élevés (même après prise de glucose) en acromégalie
(> 10 µIU/ml).
En déficience de hGH, la réponse aux tests de stimulation est absente ou faible
(petite taille par déficience en hGH; hypopituitarisme de différentes origines).
XVI. PRECAUTIONS ET AVERTISSEMENTS
Sécurité
Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement.
Les composants de sang humain inclus dans ce kit ont été évalués par des
méthodes approuvées par l’Europe et/ou la FDA et trouvés négatifs pour HBsAg,
l’anti-HCV, l’anti-HIV-1 et 2. Aucune méthode connue ne peut offrir l'assurance
complète que des dérivés de sang humain ne transmettront pas d’hépatite, le sida
ou toute autre infection. Donc, le traitement des réactifs, du sérum ou des
échantillons de plasma devront être conformes aux procédures locales de sécurité.
Tous les produits animaux et leurs dérivés ont été collectés d'animaux sains. Les
composants bovins proviennent de pays où l’ESB n'a pas été détectée.
Néanmoins, les composants contenant des substances animales devront être traités
comme potentiellement infectieux.
Eviter le contact de la peau avec tous les réactifs. En cas de contact, laver avec
beaucoup d’eau.
Ne pas fumer, ni boire, ni manger ni appliquer de produits cosmétiques dans les
laboratoires. Ne pas pipeter avec la bouche. Utiliser des vêtements protecteurs et
des gants à usage unique.
XVIII. RESUME DU PROTOCOLE
Calibrateurs (0-5)
Echantillons , Contrôles
Conjugué anti-hGH-HRP
de travail
CALIBRATEURS
(µl)
ECHANTILLON(S)
CONTROLES
(µl)
50
50
50
50
Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Aspirer le contenu de chaque puits.
Laver 3 fois avec 400 µl de la Solution de Lavage et aspirer.
Solution du chromogène
100
100
Incuber pendant 30 min à température ambiante.
Solution d’arrêt
100
100
Lire sur un lecteur de micro-plaques et enregistrer l’absorbance de chaque puits à 450
nm (contre 630 ou 650 nm) et 490 nm (contre 630 ou 650 nm)
DIAsource Catalogue Nr :
KAP1081
P.I. Number :
1700573/fr
Revision nr :
090504/1
Date de révision : 2009-05-04
XVII. BIBLIOGRAPHIE
1.
2.
The adenohypophysis
Philadelphia, p;73.
3.
4.
5.
6.
LI C.H. (1974)
physiology.
(NJH) 74-612, p. 321.
7.
REUTENS AT. (1995)
8.
asthma.
J. Pediatr. 126(2): 297-303.
9.
de
Vor Gebrauch des Kits lesen Sie bitte diese Packungsbeilage.
hGH-EASIA
I.
VERWENDUNGSZWECK
Ein immunenzymetrisches Assay für die quantitative in vitro Bestimmung von humanem
Wachstumshormon (hGH) in Serum und Plasma.
II.
ALLGEMEINE INFORMATION
A.
Handelsbezeichnung :
B.
Katalognummer :
KAP1081 : 96 Tests
C.
Hergestellt von:
Rue de l'Industrie, 8, B-1400 Nivelles, Belgien.
Für technische Unterstützung oder Bestellungen wenden Sie sich bitte an:
Tel : +32 (0)67 88.99.99 Fax : +32 (0)67 88.99.96
Für Deutschland : Kostenfreie Rufnummer : 0800 1 00 85 74 - Kostenfreie Faxnummer : 0800 1 00 85 75
E-mail Ordering : [email protected]
III. KLINISCHER HINTERGRUND
A.
Biologische Aktivität
hGH ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 21.500 Da. Synthetisiert in den azidophilen Zellen
des Hypophysenvorderlappens (HVL) erfolgt die Ausschüttung unter der Kontrolle von SomatotropinReleasing-Faktor (GRF) und Somatostatin als inhibierendem Agens. Neurotransmitter wie Dopamin,
Adrenalin und Serotonin spielen ebenfalls eine wichtige Rolle in der hGH-Sekretion. Stimulierend auf die
hGH-Ausschüttung wirken Hypoglykämie, Sport, Fasten, Nahrung mit hohem Proteingehalt, Schlaf, Stress,
Glucagon, L-Dopa, Aminosäuren, usw. Glucose, Cortisol, hGH und freie Fettsäuren hingegen hemmen die
Freisetzung von hGH. Neben der kurzen Halbwertszeit von hGH (± 25 Minuten) ist die Vielzahl der die
Ausschüttung beeinflussenden Faktoren für die häufige und große Variationsbreite der hGH-Spiegel im
Serum verantwortlich.
Eine der Hauptwirkungen von hGH ist die Induktion der Somatomedin-Produktion in Leber und anderen
Geweben. Somatomedine beeinflussen das Wachstum durch direkte Wirkung auf die entsprechenden
Zielorgane. Im Gegensatz zu hGH bleibt die Somatomedin-Konzentration im Serum durch die weit gehende
Bindung an zirkulierende Plasmaproteine stabil.
B.
·
Klinische Anwendung
Minderwuchs
Zu geringe hGH-Ausschüttung ist eine der möglichen Ursachen für Minderwuchs bei Kindern. Die
Bestimmung von hGH im Serum nach einem Provokationstest (ausbleibende Reaktion) mittels eines sehr
sensitiven Tests ist eine wichtige Methode zur Identifizierung solcher Patientengruppen, da diese Patienten
durch Gabe von hGH sehr gut therapiert werden können.
Hypopituitarismus
Die Bestimmung von hGH im Serum gibt auch einen Hinweis auf die Hypophysenfunktion, falls eine
Hypophysenunterfunktion (entweder idiopathisch oder bedingt durch einen Tumor oder chirurgischen
Eingriff) vermutet wird.
Gigantismus und Akromegalie
Die hGH-Bestimmung im Serum vor allem nach einem Inhibitionstest (ausbleibende Reaktion) ist
wesentlicher Bestandteil der Diagnose einer tumorbedingten hGH-Überproduktion. hGH-Überproduktion
führt bei Kindern zu Riesenwuchs, bei Erwachsenen zu Akromegalie. Beide Erkrankungen können durch
einen chirurgischen Eingriff oder Bestrahlung therapiert werden.
·
·
IV.
GRUNDSÄTZLICHES ZUR DURCHFÜHRUNG
VII.
Der DIAsource hGH-EASIA ist ein solid phase-Enzyme Amplified Sensitive
Immunoassay (EASIA) im Mikrotiterplattenformat. Kalibratoren und Proben
reagieren mit dem primären monoklonalen Antikörper (MAk 1), mit dem die
Wells der Mikrotiterplatte beschichtet sind, und mit einem monoklonalen
Antikörper (MAk 2), der mit Meerrettich-Peroxidase (MRP) markiert ist. Nach
einer Inkubationsphase bildet sich ein Sandwich-Komplex: MAk 1 - hGH - MAk
2 - MRP; nicht gebundene enzymbeschriftete Antikörper werden durch Waschen
der Mikrotiterplatte entfernt. Gebundene enzymbeschriftete Antikörper werden
durch eine Farbreaktion gemessen. Chromogene Lösung (TMB – H2O2) wird
hinzugefügt und inkubiert. Die Reaktion wird durch Hinzufügen einer
Stopplösung beendet und die Mikrotiterplatte wird bei adäquater Wellenlänge
ausgewertet. Die Menge an Substratumsatz wird kolorimetrisch durch Messung
der Absorption bestimmt, die proportional zur hGH-Konzentration ist.
Es wird eine Kalibrationskurve erstellt und die hGH-Konzentration in den Proben
wird durch Interpolation von der Kalibrationskurve bestimmt.
A.
B.
C.
D.
MITGELIEFERTE REAGENZIEN
Reagenzien
Mikrotiterplatte mit
96 Anti-hGH
beschichteten,
abbrechbaren Wells
(monoklonale
Antikörper)
Ab
HRP
CONC
96 Test
Kit
FarbCode
96 Wells
Blau
BUF
gebrauchsfertig
1 Gefäß
0,2 ml
Gelb
1 Gefäß
6 ml
Rot
40 fach mit
Konjugatpuffer
verdünnen
0
N
SOLN
CONC
1 Gefäß
lyophilisiert
Gelb
2,0 ml dest. Wasser
zugeben
5 Gefäße
lyophilisiert
Gelb
0,5 ml dest. Wasser
zugeben
N
1 Gefäß
10 ml
Braun
200 x mit dest. Wasser
verdünnen
(Magnetrührer
benutzen).
2 Gefäße
lyophilisiert
Silber
0,5 ml dest. Wasser
zugeben
1 Gefäß
12 ml
Braun
gebrauchsfertig
1 Gefäß
12 ml
weiβ
gebrauchsfertig
Kontrollen - N = 1 oder 2
Humanserum und Thymol
CHROM
TMB
Chromogenes TMB
(Tetramethylbenzydin)
STOP
SOLN
Stopplösung: HCl 1N
Bemerkung: 1. Benutzen Sie den Null-Kalibrator zur Probenverdünnung.
2. 1 μIU der Kalibratorzubereitung ist äquivalent zu 1 μIU 2nd IS
98/574.
VI.
§
§
§
§
Waschlösung (Tris-HCl)
CONTROL
§
§
§
Kalibrator - N = 1 bis 5
(genaue Werte auf GefäßEtiketten) in Schafserum und
Thymol
WASH
§
§
IX.
Null-Kalibrator in Schafserum
und Thymol
CAL
§
Vor dem Öffnen oder der Rekonstitution sind die Reagenzien des Kits bis
zum Ablaufdatum (Angaben auf Etikett) bei Lagerung bei 2°C bis 8°C
stabil.
Nicht verwendete Mikrotiterstreifen sollten bis zum Verfallsdatum dicht in
der Folie verschlossen mit Trockenmittel bei 2° bis 8°C gelagert werden.
Nach der Rekonstitution sind die Kalibratoren und Kontrollen bei 2°C bis
8°C 7 Tage stabil. Aliquots müssen bei längerer Aufbewahrung bei -20°C
eingefroren werden, dann sind Sie 3 Monate haltbar. Vermeiden Sie
wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Die konzentrierte Waschlösung ist bei Raumtemperatur bis zum
Verfallsdatum haltbar.
Frisch zubereitete Waschlösung sollte am selben Tag benutzt werden.
Nach der ersten Benutzung ist das Konjugat bei Aufbewahrung im
Originalgefäß und bei 2° bis 8° C bis zum Ablaufdatum stabil.
Veränderungen im Aussehen der Kitkomponenten können ein Anzeichen
für Instabilität oder Zerfall sein.
gebrauchsfertig
Konjugatpuffer: TRIS-HCl Puffer
mit Rinderserumalbumin und
Thymol
CAL
§
§
Konjugat: MRP beschriftete AntihGH (monoklonale Antikörper)
in Stabilisierungspuffer
CONJ
Rekonstitution
Kalibratoren: Rekonstituieren Sie den Null-Kalibrator mit 2,0 ml dest.
Wasser, die anderen Kalibratoren mit 0,5 ml dest. Wasser.
Kontrollen: Rekonstituieren Sie die Kontrollen mit 0,5 ml dest. Wasser.
Anti-hGH-HRP Konjugat Gebrauchslösung: Bereiten Sie eine geeignete
Menge Konjugatlösung zu indem Sie 25 µl des Anti-hGH-HRP Konzentrats
zu 1 ml Konjugatpuffer geben. Benutzen Sie einen Vortex zum
Homogenisieren. Es ist die spontane Zubereitung gefordert.
Waschlösung: Bereiten Sie ein angemessenes Volumen Waschlösung aus
einem Anteil Waschlösung (200x) mit 199 Anteilen dest. Wasser zu.
Verwenden Sie einen Magnetrührer zum gleichmäßigen Durchmischen.
Werfen Sie die nicht benutzte Waschlösung am Ende des Tages weg.
VIII. AUFBEWAHRUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN
§
V.
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
Folgendes Material wird benötigt, aber nicht mit dem Kit mitgeliefert:
1.
Hochwertiges destilliertes Wasser
2.
Pipetten: 50 μl, 200 µl, 500 μl und 2 ml (Verwendung von
Präzisionspipetten mit Einwegplastikspitzen wird empfohlen)
3.
Vortex Mixer
4.
Magnetrührer
5.
Waschgerät für Mikrotiterplatten
6.
Mikrotiterplatten-Lesegerät zur Auswertung bei 450 nm und 650 nm
(bichromatischer Auswertung)
PROBENSAMMLUNG UND -VORBEREITUNG
Serum- oder Plasmaproben müssen bei 2-8°C aufbewahrt werden.
Falls der Test nicht innerhalb von 24 Std. durchgeführt wird, ist die
Aufbewahrung bei -20°C erforderlich.
Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Vor Gebrauch müssen alle Proben Raumtemperatur erreichen.
Vortexmischen der Proben wird vor Gebrauch empfohlen.
Serum-, Heparinisiertes Plasma- oder EDTA-Plasmaproben liefern ähnliche
Ergebnisse.
Y(Serum) = 0,89 x (EDTA-Plasma) + 0,14 r=0,98
n=46
Y(Serum) = 1,02 x (Hep. Plasma) + 0,01
r=0,98
n=46
Keine hämolytischen Proben benutzen
X.
DURCHFÜHRUNG
A.
Bemerkungen zur Durchführung
Verwenden Sie den Kit oder dessen Komponenten nicht nach
Ablaufdatum.
Vermischen Sie Materialien von unterschiedlichen Kit-Chargen nicht.
Bringen Sie alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur.
Mischen Sie alle Reagenzien und Proben gründlich durch sanftes Schütteln
oder Rühren.
Führen Sie Kalibratoren, Kontrollen und Proben doppelt aus. Vertikale
Ausrichtung wird empfohlen.
Verwenden Sie
zur Zubereitung der
Waschlösung reinen
Kunststoffbehälter.
Verwenden Sie saubere Einwegpipettenspitzen, um Kreuzkontamination
zu vermeiden.
Verwenden Sie zur Pipettierung der chromogene Lösung und der
Stopplösung keine Pipetten mit Metallteilen.
Präzisionspipetten oder ein automatisches Pipettiersystem erhöhen die
Präzision.
Achten Sie auf die Einhaltung der Inkubationszeiten.
Zur Vermeidung von Drift muss die Zeit zwischen dem Pipettieren des
ersten Kalibrators und der letzten Probe auf die Zeit beschränkt werden,
die in Abschnitt XIII Absatz E (Zeitverzögerung) erwähnt wird.
Erstellen Sie für jeden Durchlauf eine Kalibrationskurve, verwenden Sie
nicht die Daten von früheren Durchläufen.
Pipettieren Sie die chromogene Lösung innerhalb von 15 Minuten nach
dem Waschen der Mikrotiterplatte.
Während der Inkubation mit der chromogene Lösung ist die
Mikrotiterplatte vor direktem Sonnenlicht zu schützen.
B.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Durchführung
Wählen Sie die erforderliche Anzahl der Streifen für den Lauf aus. Nicht
verwendete Mikrotiterstreifen sollten wieder dicht in der Folie
verschlossen mit Trockenmittel bei 2° bis 8°C gelagert werden.
Befestigen Sie die Streifen im Halterahmen.
Pipettieren Sie jeweils 50 µl Kalibrator, Kontrolle und Probe in die
entsprechenden Wells.
Pipettieren Sie 50 µl Anti-hGH-HRP Gebrauchslösung in alle Wells.
Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur - Es ist zwingend
notwendig, die 30 Minuten Inkubationszeit einzuhalten.
Saugen Sie die Flüssigkeit aus jedem Well ab.
Waschen Sie die Platte dreimal:
§
pipettieren Sie 0,4 ml Waschlösung in jeden Well
§
saugen Sie der Inhalt jedes Wells ab
Pipettieren Sie 100 µl der chromogene Lösung innerhalb von 15 Minuten
nach dem Waschvorgang in jeden Well.
Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte 30 Minuten bei Raumtemperatur;
vermeiden Sie direktes Sonnenlicht.
Pipettieren Sie 100 µl der Stopplösung in jeden Well.
Werten Sie die Absorptionen bei 450 nm (Referenzfilter 630 nm oder 650
nm) innerhalb 1 Stunde aus und berechnen Sie die Resultate wie in
Abschnitt XI beschrieben.
XI.
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
1.
Werten Sie die Platte bei 450 nm gegen einen Referenzfilter auf 650 nm
(oder 630 nm) aus.
Berechnen Sie den Durchschnitt aus den Doppelbestimmungen.
Tragen Sie auf semilogarithmischem oder linearem Millimeterpapier den
c.p.m. (Ordinate) für jeden Standard gegen die entsprechende
Konzentration hGH (Abszisse) und zeichnen Sie eine Kalibrationskurve
durch die Kalibrationspunkte, indem Sie die eingetragenen Punkte durch
gerade Linien verbinden.
Berechnen Sie die Konzentration für jede Kontrolle und Probe durch
Interpolation aus der Kalibrationskurve.
Computergestützte Methoden können ebenfalls zur Erstellung der
Kalibrationskurve verwendet werden. Falls die Ergebnisberechnung mit
dem Computer durchgeführt wird, empfehlen wir die Berechnung mit
einer “4 Parameter”-Kurvenfunktion.
2.
3.
4.
5.
C.
Präzision
INTRA ASSAY
Serum
N
<X> ± SD
(μIU/ml)
CV
(%)
Serum
N
<X> ± SD
(μIU/ml)
CV
(%)
A
B
20
20
6,90 ± 0,34
16,61 ± 0,90
4,9
5,4
A
B
8
8
11,4 ± 0,9
23,5 ± 1,2
8,1
5,1
SD : Standardabweichung; CV: Variationskoeffizient
D.
Genauigkeit
WIEDERFINDUNGSTEST
OD Einheiten
Kalibrator
0 μIU/ml
0,45 μIU/ml
5,4 μIU/ml
12,9 μIU/ml
43,5 μIU/ml
98,0 μIU/ml
Wiedergef. hGH
(μIU/ml)
Wiedergefunden
(%)
Probe
Zugeg. hGH
(μIU/ml)
Serum
4,3
13,5
26,8
52,1
4,1
12,8
28,1
58,9
95
95
105
113
Plasma
4,3
13,5
26,8
52,1
4,6
13,2
25,3
53,0
106
98
94
102
VERDÜNNUNGSTEST
Probe
Verdünn.
Serum 1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
48,8
24,4
12,2
6,1
3,1
97,7
57,0
27,7
13,6
6,4
3,0
Serum 2
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
10,6
5,3
2,7
1,3
0,7
21,2
9,3
4,6
2,2
1,1
0,6
XII. TYPISCHE WERTE
Die folgenden Daten dienen nur zu Demonstrationszwecken und können nicht als
Ersatz für die Echtzeitstandardkurve verwendet werden.
hGH-EASIA
INTER ASSAY
Theoret. Konzent.
(μIU/ml)
Gemess. Konzent.
(μIU/ml)
Die Proben wurden mit Null-Kalibrator verdünnt.
Umrechnungsfaktor:
1µIU der Standardzubereitung hGH-EASIA = 0,33 ng
0,030
0,062
0,226
0,501
1,429
2,330
E.
Zeitverzögerung zwischen letzter Kalibrator- und Probenzugabe
Es wird im Folgenden gezeigt, dass die Genauigkeit der Tests selbst dann
gewährleistet ist, wenn die Probe 60 Minuten nach Zugabe des Kalibrators
in die beschichteten Röhrchen zugegeben wird.
XIII. LEISTUNGSMERKMALE UND GRENZEN DER METHODIK
ZEITDIFFERENCE
A.
B.
Nachweisgrenze
Zwanzig Null-Kalibratoren wurden zusammen mit einem Satz anderer
Kalibratoren gemessen.
Die Nachweisgrenze, definiert als die scheinbare Konzentration bei zwei
Standardabweichungen über dem gemessenen Durchschnittswert bei
Nullbindung, entsprach 0,17 μIU/ml.
Spezifität
Kreuzreaktive Hormone wurden zu einem minderwertigen und zu einem
hochwertigen Kontrolle zugegeben. Das Scheinbare hGH Ergebnis wurde
gemessen.
hGH C1
hGH C2
Zugeg. Hormon
µIU/ml
µIU/ml
-
1,9
13,5
hCG 100000 mIU/ml
2,0
14,3
hPL 10000 ng/ml
1,4
13,0
PRL 12500 ng/ml
1,8
12,6
S1
S2
0 min
10 min
20 min
30 min
45 min
60 min
4,0
13,5
3,6
15,0
3,3
13,8
3,3
13,0
3,0
12,6
3,8
13,0
F.
Hook-Effekt
Eine Probe mit hGH bis zu 4000 μIU/ml liefert höhere Messwerte als der
letzte Kalibratormeßwert.
XIV
INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE
§
§
Entsprechen die Ist-Werte nicht den auf den Fläschchen angegebenen SollWerten, können die Werte, ohne treffende Erklärung der Abweichungen,
nicht weiterverarbeitet werden.
Falls zusätzliche Kontrollen erwünscht sind, kann jedes Labor seinen
eigenen Pool herstellen, der in Aliquots eingefroren werden sollte.
Kontrollen mit erhöhten Azidkonzentrationen stören die Enzymreaktion und
können nicht verwendet werden.
§
§
§
XV.
Akzeptanzkriterien für die Differenz zwischen den Resultaten der
Wiederholungstests anhand der Proben müssen auf Guter Laborpraxis
beruhen.
Es wird empfohlen, Kontrollen im Assay routinemäßig wie unbekannte
Proben zu behandeln, um die Assayvarianz zu messen. Die Leistung des
Assay muss mit den Qualitätskontrollkarten der Kontrollen überprüft
werden.
Es hat sich bewährt, die durch den Computer ausgewählte Kurvenanpassung
visuell zu überprüfen.
REFERENZ INTERVALLE
Diese Werte sind nur Richtwerte; jedes Labor muss seinen eigenen
Normalwertbereich ermitteln.
Bei gesunden Personen erfolgt die hGH-Ausschüttung pulsatil. Tagsüber variiert
die hGH-Konzentration von < 0,2 bis 10 µIE/ml. Im Schlaf steigt die hGHKonzentration kontinuierlich an (± 30 µIE/ml).
Nach sportlichen Aktivitäten oder Stress (Blutentnahme, Hypoglykämie) werden
hohe Werte, bei Hyperglykämie niedrige hGH-Spiegel gefunden.
Zwei Stunden nach Glucose-Belastung (75 g bei Erwachsenen) wurden bei
gesunden Personen (n = 34) hGH-Spiegel < 10 µIE/ml, nach einem
Stimulationstest (Insulin, Arginin, Glucagon) hGH-Spiegel > 20 µIE/ml
gefunden.
Patienten mit Akromegalie zeigten selbst nach Glucose-Gabe erhöhte hGH-Werte
(> 10 µIU/ml).
Bei hGH-Mangel kann keine oder nur verminderte Erhöhung der hGH-Spiegel
nach Stimulation detektiert werden (Minderwuchs durch hGH-Mangel;
Hypopituitarismus verschiedener Ursachen).
XIII. VORSICHTSMASSNAHMEN UND WARNUNGEN
Sicherheit
Nur für diagnostische Zwecke.
Die menschlichen Blutkomponenten in diesem Kit wurden mit europäischen und
in den USA erprobten FDA-Methoden getestet, sie waren negativ für HBsAG,
anti-HCV und anti-HIV 1 und 2. Keine bekannte Methode kann jedoch
vollkommene Sicherheit darüber liefern, dass menschliche Blutbestandteile nicht
Hepatitis, AIDS oder andere Infektionen übertragen. Deshalb sollte der Umgang
mit Reagenzien, Serum oder Plasmaproben in Übereinstimmung mit den
Sicherheitsbestimmungen erfolgen.
Alle tierischen Produkte und deren Derivate wurden von gesunden Tieren
gesammelt. Komponenten von Rindern stammen aus Ländern in denen BSE nicht
nachgewiesen wurde.
Trotzdem sollten Komponenten, die tierische Substanzen enthalten, als potenziell
infektiös betrachtet werden.
Vermeiden Sie Hautkontakt mit allen Reagenzien. Bei Kontakt gründlich mit
Wasser spülen.
Bitte rauchen, trinken, essen Sie nicht in Ihrem Arbeitsbereich, und verwenden
Sie keine Kosmetika. Pipettieren Sie nicht mit dem Mund. Verwenden Sie
Schutzkleidung und Wegwerfhandschuhe.
(NJH) 74-612, p. 321.
7.
REUTENS AT. (1995)
8.
asthma.
J. Pediatr. 126(2): 297-303.
9.
XVIII. ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLS
KALIBRATOREN
(µl)
PROBE(N)
KONTROLLEN
(µl)
50
50
50
50
Kalibratoren (0-5)
Proben, Kontrollen
Anti-hGH-HRP
Gebrauchslösung
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Inhalt jedes Wells absaugen.
Dreimal mit 400 µl Waschlösung waschen und absaugen.
chromogene Lösung
100
100
100
100
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Stopplösung
Auf einem Mikrotiterplatten-Lesegerät auswerten und Absorption jedes Wells bei 450
nm (gg. 630 oder 650 nm) vermerken.
DIAsource Katalognummer :
KAP1081
Beipackzettelnummer:
1700573/de
Nummer der
Originalausgabe:
090504/1
XVII. LITERATUR
1.
2.
The adenohypophysis
Philadelphia, p;73.
3.
4.
5.
6.
LI C.H. (1974)
physiology.
Revisionsdatum : 2009-05-04
it
Prima di utilizzare il kit leggere attentamente le istruzioni per l’uso
hGH -EASIA
I. USO DEL KIT
Kit immunoenzimetrico per la determinazione quantitativa in vitro dell’Ormone della Crescita umano
(hGH) in siero o plasma.
II. INFORMAZIONI DI CARATTERE GENERALE
A. Nome commerciale:
B. Numero di catalogo:
KAP1081:
C. Prodotto da:
Rue de l’Industrie, 8, B-1400 Nivelles, Belgio.
96 test
Per informazioni tecniche o su come ordinare il prodotto contattare:
Tel: +32 (0) 67 88.99.99
Fax: +32 (0) 67 88.99.96
III.
A.
INFORMAZIONI CLINICHE
Attività biologiche
L’hGH è un ormone polipeptidico (peso molecolare 21.500 Da) la cui produzione da parte delle celule acidofile della
ghiandola pituitaria anteriore è controllata da due importanti sostanze prodotte dall’eminenza mediana: il Fattore di
Rilascio dell’Ormone della Crescita (GRF) e la somatostatina, un agente dall’effetto inibente. Un ruolo non meno
importante nella secrezione dell’hGH è quello esercitato dalle vie dopaminergica, adrenergica e serotoninergica. La
secrezione di hGH viene stimolata anche da altri fattori quali ipoglicemia, esercizio fisico, digiuno, assunzione di pasti
ad alto contenuto proteico, sonno profondo, stress, glucagone, L-Dopa, aminoacidi e altro, mentre risulta inibita da
glucosio, cortisolo, hGH, e acidi grassi liberi. La sua breve emivita plasmatica (+/-25 minuti) e i vari stimoli eccitatori
o inibitori determinano ampie e frequenti variazioni del suo livello nel siero. L’azione dell’hGH a livello epatico e
tissutale, una delle sue principali funzioni fisiologiche, induce la produzione di somatomedina che stimola la crescita
attraverso un’azione diretta sui tessuti target. Al contrario di quanto accade per l’hGH, il livello di somatomedina nel
siero si mantiene stabile grazie al legame di questa con le proteine circolanti nel plasma.
B.
Applicazione clinica
Ritardo nella crescita
L’iposecrezione di hGH è una delle varie cause di ritardo nella crescita in età pediatrica. Il dosaggio dell’hGH nel
siero mediante un test altamente sensibile, meglio ancora se effettuato in seguito a stimolo provocativo (assenza di
risposta), rappresenta uno strumento importante per la formulazione di una corretta diagnosi per pazienti di questo
tipo che possono essere trattati con somministrazioni di hGH.
Ipopituitarismo
La determinazione dei livelli di hGH nel siero è inoltre un indice della funzionalità ipofisaria in caso di sospetto
ipopituitarismo (idiopatico o dovuto a neoplasia e intevento chirurgico).
Gigantismo e acromegalia
La determinazione dei livelli di hGH nel siero, specialmente dopo test provocativo di inibizione (assenza di
risposta) è un mezzo importante per la formulazione diagnostica di ipersecrezione di hGH indotta da adenoma
acidofilo. Le patologie che ne derivano, gigantismo nel bambino e acromegalia nell’adulto, possono essere trattate
con intervento chirurgico o radioterapia.
IV.
PRINCIPIO DEL METODO
DIAsource hGH-EASIA è un immunosaggio a sensibilità amplificata a fase solida
eseguito su piastre di microtitolazione. I calibratori e i campioni reagiscono con la
cattura dell’anticorpo monoclonale (MAb 1) che riveste il pozzetto di
microtitolazione e con un anticorpo monoclonale (MAb 2) marcato con
horseradish perossidasi (HRP). Dopo un periodo di incubazione che consenta la
formazione di un sandwich: MAb 1 di rivestimento – hGH – MAb 2 – HRP, la
piastra di microtitolazione viene lavata per rimuovere l’anticorpo marcato con
enzima non legato. L’anticorpo marcato con enzima non legato viene misurato
attraverso una reazione cromogenica. Si procede quindi con l’aggiunta della
soluzione cromogena (TMB-H2O2) e successiva incubazione. La reazione viene
interrotta con l’aggiunta di Soluzione di arresto; quindi la piastra di
microtitolazione viene letta alla lunghezza d’onda adeguata.
La quantità di
turnover del substrato viene determinata colorimetricamente misurando
l’assorbanza che è proporzionale alla concentrazione di hGH.
Viene tracciata una curva di calibrazione e la concentrazione hGH nei campioni
viene determinata per interpolazione dalla curva di calibrazione.
6.
Lettore piastra di microtitolazione con una potenza di lettura di 450 nm e
650 nm (lettura bicromatica)
VII.
PREPARAZIONE DEI REATTIVI
A.
B.
C.
D.
Calibratore: Ricostituire il calibratore zero con 2,0 ml di acqua distillata e
gli altri calibratori con 0,5 ml di acqua distillata.
Controlli: Ricostituire i controlli con 0,5 ml di acqua distillata.
Soluzione di lavoro del coniugato anti-hGH-HRP: Preparare la quantità
necessaria di soluzione del coniugato aggiungendo 25 µl del coniugato
anti-hGH-HRP a 1 ml di tampone del coniugato. Utilizzare un vortex per
omogeneizzare. Si raccomanda la preparazione estemporanea.
Soluzione di lavoro del tampone di lavaggio: Preparare la quantità
necessaria di soluzione di lavoro del tampone di lavaggio aggiungendo 199
parti di acqua distillata ad una parte di tampone di lavaggio concentrato
(200x). Usare un agitatore magnetico per rendere la soluzione omogenea. La
soluzione di lavoro va scartata al termine della giornata.
VIII. CONSERVAZIONE E SCADENZA DEI REATTIVI
V.
REATTIVI FORNITI
§
Reattivi
Kit da 96
test
Codice
colore
Volume di
ricostituzione
96 pozzetti
Blu
Pronte per l’uso
§
§
Piastra di microtitolazione
con 96 pozzetti
separabili, rivestiti anti
hGH (anticorpi
monoclonali)
Ab
HRP
CONC
Coniugato: marcato HRP anti-hGH
(Anticorpi monoclonali) in tampone
stabilizzante
CONJ
BUF
Tampone del coniugato: tampone
TRIS-HCl con albumina di siero
bovino e timolo
CAL
§
§
1 flacone
0,2 ml
1 flacone
Rosso
Diluire 40 x con
tampone del
coniugato
Pronto per l’uso
6 ml
1 flacone
0
Giallo
Giallo
Aggiungere 2,0 ml
di acqua distillata
Calibratore zero in siero di pecora e
timolo.
Calibratore 1-5 (le concentrazioni
esatte degli calibratore sono riportate
sulle etichette dei flaconi), in siero di
pecora e timolo.
WASH
SOLN
CONC
Giallo
liofiliz.
1 flacone
Controlli: N = 1 o 2, in siero umano
con timolo
CHROM
TMB
2 flaconi
Diluire 200 x con
acqua distillata
usando un agitatore
magnetico)..
Argento
Aggiungere 0,5 ml
di acqua distillata
liofiliz.
1 flacone
Aggiungere 0,5 ml
Bruno
Tampone di lavaggio (TRIS HCl)
N
§
§
Bruno
METODO DEL DOSAGGIO
A.
Avvertenze generali
Non usare il kit o suoi componenti oltre la data di scadenza.
Non mescolare reattivi di lotti diversi.
Prima dell’uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente.
Mescolare delicatamente i campioni per inversione o rotazione.
Eseguire calibratori, controlli e campioni in doppio. Si raccomanda
l’allineamento verticale.
Utilizzare un contenitore di plastica pulito per preparare la soluzione di
lavaggio.
Per evitare cross-contaminazioni, cambiare il puntale della pipetta ogni
volta che si usi un nuovo reattivo o campione.
Per la distribuzione della soluzione cromogena e la Stop Solution evitare
pipette con parti metalliche.
L’uso di pipette ben tarate e ripetibili o di sistemi di pipettamento
automatici migliora la precisione del dosaggio.
Rispettare i tempi di incubazione.
Per evitare derive, l’intervallo tra il pipettaggio del primo calibratore e
l’ultimo campione deve essere limitato ai tempi riportati nella sezione XIII,
paagrafo E (Tempo Trascorso).
Allestire una curva di calibrazione per ogni seduta analitica, in quanto non
è possibile utilizzare per un dosaggio curve di calibrazione di sedute
analitiche precedenti.
Distribuzione della soluzione cromogena entro 15 minuti dopo il lavaggio
della piastra di microtitolazione.
Durante l’incubazione con la soluzione cromogena evitare la luce diretta
del sole sulla piastra di microtitolazione.
B.
1.
Metodo del dosaggio
Selezionare il numero di strisce reagenti necessario per il test. Le strisce
reagenti inutilizzate devono essere risigillate nel contenitore con un
essiccante e conservate a 2-8°C.
Assicurare le strisce reagenti nel telaio di supporto.
Pronto per l’uso
Soluzione Cromogena TMB
(tetrametilbenzidina)
SOLN
1 flacone
bianco
Pronto per l’uso
12 ml
Soluzione di arresto: HCl 1N
Note:
VI.
Conservare i campioni di siero o plasma a 2-8°C.
Se non si desidera eseguire il dosaggio entro 24 ore dal prelievo, si
raccomanda di conservare i campioni a –20°C. Evitare ripetuti cicli di
congelamento-scongelamento dei campioni.
Prima dell’impiego, tutti i campioni devono essere a temperatura ambiente.
Si raccomanda di vortexare i campioni prima di utilizzarli.
Siero, plasma eparinato o plasma EDTA producono risultati simili.
Y(siero) = 0.89 x (plasma EDTA) + 0.14 µIU/ml
r=0.98 n=46
Y(siero) = 1.02 x (plasma eparinato) + 0.01 µIU/ml
r=0.98 n=46
Non usare campioni emolizzati.
X.
12 ml
STOP
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
di acqua distillata
10 ml
CONTROL
IX.
§
5 flaconi
N
§
§
§
liofiliz.
CAL
§
I reattivi non utilizzati sono stabili a 2-8°C fino alla data riportata su
ciascuna etichetta.
Le strisce reattive inutilizzate devono essere conservate a 2-8°C, in un
contenitore sigillato che contenga un essiccante fino alla data di scadenza.
Dopo la ricostituzione, i calibratori e i controlli sono stabili 7 giorni a 2-8°C.
Per periodi di conservazione molto lunghi, preparare e mantenere le aliquote
a –20°C. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento dei campioni.
La soluzione di lavaggio concentrata è stabile a temperatura ambiente fino
alla data di scadenza.
La soluzione di lavoro del tampone di lavaggio deve essere preparata fresca
ogni volta e usata nello stesso giorno della preparazione.
Dopo apertura del flacone, il coniugato è stabile fino alla data di scadenza
riportata sull’etichetta, se conservato a 2-8°C nel flacone originale ben
tappato.
Alterazioni dell’aspetto fisico dei reattivi possono indicare una loro
instabilità o deterioramento.
1. Usare lo standard zero per diluire i campioni.
2. 1 µUI della preparazione standard è equivalente a 1 µUI di 2nd IS
98/574.
REATTIVI NON FORNITI
Il seguente materiale è richiesto per il dosaggio ma non è fornito nel kit.
1.
Acqua distillata di qualità elevata
2.
Pipette per dispensare 50 µl, 200 µl, 500 µl e 2 ml (Si raccomanda di
utilizzare pipette accurate con puntale in plastica monouso).
3.
Agitatore tipo vortex.
4.
Agitatore magnetico.
5.
lavatrice per piastra di microtitolazione
2.
3.
Pipettare 50 µl di ogni calibratore, controllo e campione nei pozzetti
adeguati.
Pipettare 50 µl della soluzione di lavoro del coniugato anti-hGH-HRP in
tutti i pozzetti.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente - Il rispetto della durata di
30 minuti di tale incubazione è indispensabile.
Aspirare il liquido da ogni pozzetto.
Lavare la piastra 3 volte :
§
versando 0,4 ml di soluzione di lavaggio in ogni pozzetto
§
aspirando il contenuto di ogni pozzetto
Pipettare in ogni pozzetto 100 µl di Soluzione Cromogena entro 15 minuti
dal termine della fase di lavaggio.
Incubare la piastra di microtitolazione per 30 minuti a temperatura
ambiente; evitare la luce diretta del sole.
Pipettare 100 µl di soluzione di arresto in ogni pozzetto.
Leggere le assorbanze a 450 nm (filtro di riferimento a 630 nm o 650 nm)
entro un’ora e calcolare i risultati come descritto nella sezione XI.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
XI.
CALCOLO DEI RISULTATI
1.
Leggere la piastra a 450 nm rispetto a un filtro di riferimento regolato a
650 nm (o 630 nm).
Calcolare la media delle determinazioni in duplicato.
Costruire la curva di calibrazione su carta millimetrata semilogaritmica o
lineare ponendo in ordinata le medie dei colpi per minuto (cpm) dei
replicati degli standard e in ascissa le rispettive concentrazioni di hGH,
collegando i punti tracciati con linee rette.
Determinare le concentrazioni e controlli per interpolazione sulla curva di
taratura.
E’ possibile utilizzare un sistema di interpolazione dati automatizzato. Con
un sistema automatico di interpolazione dati, utilizzare la curva a 4
parametri.
2.
3.
4.
5.
XII.
D.
Accuratezza
TEST DI RECUPERO
Campione
hGH aggiunta
(µIU/ml)
Recupero
(%)
Siero
4,3
13,5
26,8
52,1
4,1
12,8
28,1
58,9
95
95
105
113
Plasma
4,3
13,5
26,8
52,1
4,6
13,2
25,3
53,0
106
98
94
102
TEST DI DILUIZIONE
CARATTERISTICHE TIPICHE
Campione
Diluizione
Siero 1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
48,8
24,4
12,2
6,1
3,1
97,7
57,0
27,7
13,6
6,4
3,0
Siero 2
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
10,6
5,3
2,7
1,3
0,7
21,2
9,3
4,6
2,2
1,1
0,6
I sotto riportati sono forniti a titolo di esempio e non devono essere utilizzati per
calcolare le concentrazioni di hGH in campioni e controlli al posto della curva
standard, che va eseguita per ogni dosaggio.
Unità OD
hGH-EASIA
Calibratore
hGH
recuperata
(µIU/ml)
0 μIU/ml
0,45 μIU/ml
5,4 μIU/ml
12,9 μIU/ml
43,5 μIU/ml
98,0 μIU/ml
Concentrazione
teorica
(µIU/ml)
Concentrazione
misurata
(µIU/ml)
I campioni sono stati diluiti con calibratore zero.
Fattore di conversione: 1µIU hGH EASIA Calibrator = 0,33ng
0,030
0,062
0,226
0,501
1,429
2,330
E.
Tempo trascorso tra l’aggiunta dell’ultimo calibratore e il campione
Come mostrato nella seguente tabella, il dosaggio si mantiene accurato anche
quando un campione viene aggiunto nelle provette sensibilizzate 60 minuti dopo
l’aggiunta del calibratore.
TEMPO TRASCORSO
XIII. CARATTERISTICHE E LIMITI DEL METODO
A. Sensibilità
Venti replicati dello standard zero sono stati dosati insieme agli altri standard.
La sensibilità, calcolata come concentrazione apparente di un campione con OD
pari alla media più 2 deviazioni standard di 20 replicati dello standard zero, è
risultata essere 0,17 μIU/ml.
B.
Specificità
Sono stati aggiunti ormoni cros-reattivi a un campione di controllo a basso livello
di hGH e a un campione di controllo a livello elevato ed è stata quindi misurata la
risposta apparente dell’hGH.
Ormoni aggiunti
D.
10 min
20 min
30 min
45 min
60 min
4,0
13,5
3,6
15,0
3,3
13,8
3,3
13,0
3,0
12,6
3,8
13,0
Effetto hook
Un campione ha cui è stata aggiunta hGH fino a 4000 µIU/ml ha OD
superiori a quello dello standard più concentrato.
hGH C1
hGH C2
XIV. CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO
µIU/ml
µIU/ml
§
-
1,9
13,.5
hCG 100000 mIU/ml
2,0
14,3
hPL 10000 ng/ml
1,4
13,0
PRL 12500 ng/ml
1,8
12,6
C.
S1
S2
0 min
Precisione
§
§
INTRA SAGGIO
§
INTER SAGGIO
Siero
N
<X> ± SD
(μIU/ml)
CV
(%)
Siero
N
<X> ± SD
(μIU/ml)
CV
(%)
A
B
20
20
6,90 ± 0,34
16,61 ± 0,90
4,9
5,4
A
B
8
8
11,4 ± 0,9
23,5 ± 1,2
8,1
5,1
SD : Deviazione Standard; CV: Coefficiente di Variazione
§
Se i risultati ottenuti dosando il Controllo 1 e il Controllo 2 non sono
all’interno dei limiti riportati sull’etichetta dei flaconi, non è opportuno
utilizzare i risultati ottenuti per i campioni, a meno che non si trovi una
giustificazione soddisfacente.
Ogni laboratorio può preparare un proprio pool di sieri da utilizzare come
controllo, da conservare congelato in aliquote. I controlli che contengono
azide interferiscono con la reazione enzimatica e quindi non possono essere
utilizzati.
I criteri di accettazione delle differenze tra i risultati in duplicato dei
campioni devono basarsi sulla buona prassi di laboratorio.
Si raccomanda di saggiare i controlli con regolarità come campioni
sconosciuti per misurare la variabilità del saggio. La resa del saggio deve
essere monitorata con tabelle di controllo qualità dei controlli.
È buona pratica verificare visivamente il modello di curva selezionato dal
computer.
XV.
INTERVALLI DI RIFERIMENTO
Questi valori vengono dati solo come guida; ogni laboratorio deve stabilire i
propri intervalli normali di valori.
In soggetti normali la secrezione dell’ormone della crescita (hGH) è pulsatile.
Durante il giorno, le concentrazioni di hGH variano da <0,2-10 µUI/ml, mentre
durante il sonno aumentano sensibilmente (+/- 30 µUI/ml)
La secrezione di hGH viene fortemente stimolata dall’esercizio fisico e dallo
stress (iniezione endovenosa, ipoglicemia…) e viene al contrario inibita
dall’iperglicemia. In soggetti normali (n=34), a due ore dal test da carico di
glucosio (75g. negli adulti), i livelli di hGH sono risultati inferiori a 10 µUI/ml, e
la risposta dell’hGH ai test di stimolazione (insulina, arginina e glucagone) ha
superato il livello di 20 µUI/ml.
Nei soggetti con acromegalia, i livelli di hGH sono risultati elevati anche dopo
carico di glucosio (>10 µUI/ml).
Nei casi di deficit di hGH, la risposta ai test di stimolazione risulta assente o
fortemente attenuata (bassa statura dovuta a deficit di hGH, ipopituitarismo di
varia origine).
XVI. PRECAUZIONI PER L’USO
Sicurezza
Il kit è solo per uso diagnostico in vitro.
I reattivi di origine umana presenti nel kit sono stati dosati con metodi approvati
da organismi di controllo europei o da FDA e si sono rivelati negativi per HBs Ag,
anti HCV, anti HIV1 e anti HIV2. Non sono disponibili metodi in grado di offrire
la certezza assoluta che derivati da sangue umano non possano provocare epatiti,
AIDS o trasmettere altre infezioni. Manipolare questi reattivi o i campioni di siero
o plasma secondo le procedure di sicurezza vigenti.
Tutti i prodotti di origine animale o loro derivati provengono da animali sani. I
componenti di origine bovina provengono da paesi dove non sono stati segnalati
casi di BSE. E’ comunque necessario considerare i prodotti di origine animale
come potenziali fonti di infezioni.
Evitare qualsiasi contatto della cute con tutti i reagenti. In caso di contatto, lavare
abbondamentemente con acqua.
Non fumare, bere, mangiare o applicare cosmetici nell’area di lavoro. Non
pipettare i reattivi con pipette a bocca. Utilizzare indumenti protettivi e guanti
monouso.
XVII. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1.
2.
The adenohypophysis
Philadelphia, p;73.
3.
4.
5.
6.
LI C.H. (1974)
Human growth hormone : perspective on its chemistry and physiology.
(NJH) 74-612, p. 321.
7.
REUTENS AT. (1995)
8.
asthma.
J. Pediatr. 126(2): 297-303.
9.
XVIII.
SCHEMA DEL DOSAGGIO
Calibratore (0 - 5)
Campioni, controlli
Soluzione di lavoro del
coniugato anti-hGH-HRP
CALIBRATORE
(µl)
CAMPIONI
CONTROLLI
(µl)
50
50
50
50
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il contenuto di ogni pozzetto.
Lavare 3 volte con 400 µl di soluzione di lavaggio e aspirare.
Soluzione chromogena
100
100
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
Soluzione di arresto
100
100
Leggere su un lettore per piastra da microtitolazione e registrare
l’assorbanza di ogni pozzetto a 450 nm (rispetto a 630 o 650 nm)
Numero di catalogo di
DIAsource:
KAP1081
P.I. numero:
1700573/it
Revisione numero:
090504/1
Data di revisione : 2009-05-04
el
Διαβάστε ολόκληρο το πρωτόκολλο πριν από τη χρήση.
hGH-EASIA
Ι.
ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ
Ανοσοενζυμομετρικός προσδιορισμός για την in vitro ποσοτική μέτρηση της ανθρώπινης αυξητικής
ορμόνης (hGH) στον ορό και το πλάσμα.
II.
ΓΕΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ
A.
Εμπορική ονομασία:
Κιτ hGH-EASIA της DIAsource
B.
Αριθμός καταλόγου:
KAP1081: 96 προσδιορισμοί
Γ.
Κατασκευάζεται από την: DIAsource ImmunoAssays S.A.
Rue de l'Industrie, 8, B-1400 Nivelles, Belgium.
Για τεχνική βοήθεια ή πληροφορίες σχετικά με παραγγελίες επικοινωνήστε στα:
Τηλ.: +32 (0)67 88.99.99
Φαξ: +32 (0)67 88.99.96
III. ΚΛΙΝΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ
A.
Βιολογική δράση της hGH
Η hGH είναι μια πολυπεπτιδική ορμόνη (μοριακό βάρος 21.500 Da) που παράγεται από τα οξεόφιλα
κύτταρα της πρόσθιας υπόφυσης υπό τον έλεγχο των δύο κυρίων ουσιών από το μέσο έπαρμα: του
παράγοντα απελευθέρωσης της αυξητικής ορμόνης (GRF) και ενός ανασταλτικού παράγοντα, της
σωματοστατίνης. Οι ντοπαμινεργικοί, αδρενεργικοί και σεροτονινεργικοί νευροενδοκρινικοί οδοί παίζουν
επίσης σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της έκκρισης της hGH. Στα ερεθίσματα που διεγείρουν την έκκριση
της hGH περιλαμβάνονται η υπογλυκαιμία, η άσκηση, η νηστεία, τα γεύματα με υψηλή περιεκτικότητα
πρωτεΐνης, ο βαθύς ύπνος, το στρες, η γλυκαγόνη, η L Dopa, τα αμινοξέα κ.λπ. Στα ανασταλτικά
ερεθίσματα περιλαμβάνονται η γλυκόζη, η κορτιζόλη, η hGH και τα ελεύθερα λιπαρά οξέα. Λόγω της
σύντομης ημιζωής της στο πλάσμα (±25 λεπτά) και των συχνών διεγερτικών ή ανασταλτικών ερεθισμάτων,
η hGH εμφανίζει συχνές και μεγάλες διακυμάνσεις ως προς τη συγκέντρωση στο πλάσμα.
Μια από τις κύριες φυσιολογικές λειτουργίες της hGH είναι να δρα στο ήπαρ και άλλους ιστούς για την
παραγωγή σωματομεδινών, οι οποίες με τη σειρά τους επιφέρουν αύξηση με άμεση δράση επί των ιστώνστόχων. Σε αντίθεση με την hGH, η συγκέντρωση της σωματομεδίνης στον ορό διατηρείται σταθερή
συνεπεία του μεγάλου βαθμού δέσμευσής της στις κυκλοφορούσες πρωτεΐνες του πλάσματος.
B.
·
Κλινική εφαρμογή του προσδιορισμού hGH-EASIA
Καθυστέρηση της ανάπτυξης
Η μειωμένη έκκριση hGH είναι μιας από τις διάφορες αιτίες για το μικρό ανάστημα στα παιδιά. Μέτρηση
της hGH στον ορό με έναν προσδιορισμό υψηλής ευαισθησίας, ειδικά μετά από ένα προκλητό ερέθισμα
(έλλειψη απόκρισης), αποτελεί σημαντικό τρόπο για να τεκμηριωθεί η διάγνωση αυτή διότι η συγκεκριμένη
ομάδα ασθενών μπορεί να αντιμετωπισθεί θεραπευτικά με τη χορήγηση hGH.
Υποϋποφυσισμός
Η μέτρηση της hGH στον ορό αποτελεί επίσης ένα δείκτη της λειτουργίας της υπόφυσης όταν υπάρχει
υποψία υποϋποφυσισμού (είτε ιδιοπαθούς είτε λόγω όγκου ή χειρουργικής επέμβασης).
Γιγαντισμός και μεγαλακρία
Η μέτρηση της hGH στον ορό, ειδικά μετά από μια προκλητή εξέταση αναστολής (απουσία απόκρισης),
αποτελεί σημαντικό τρόπο για την τεκμηρίωση της διάγνωσης υπερβολικής έκκρισης hGH λόγω οξεόφιλου
όγκου της υπόφυσης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα γιγαντισμό στα παιδιά και μεγαλακρία στους ενηλίκους.
Και οι δύο αυτές διαταραχές μπορούν να αντιμετωπισθούν με χειρουργική επέμβαση ή ακτινοβολία.
·
·
IV.
ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Ο προσδιορισμός hGH-EASIA της DIAsource είναι ένας ενζυμικός ανοσοπροσδιορισμός
ενισχυμένης ευαισθησίας, στερεής φάσης, ο οποίος εκτελείται σε πλάκες μικροτιτλοδότησης.
Οι βαθμονομητές και τα δείγματα αντιδρούν με το μονοκλωνικό αντίσωμα σύλληψης (MAb
1) που είναι επιστρωμένο στην υποδοχή της πλάκας μικροτιτλοδότησης και με ένα
μονοκλωνικό αντίσωμα (MAb 2) σημασμένο με ραφανιδική υπεροξειδάση (HRP). Μετά από
μια περίοδο επώασης που επιτρέπει το σχηματισμό ενός σάντουιτς: επιστρωμένο MAb 1 –
hGH – MAb 2 – HRP, η πλάκα μικροτιτλοδότησης υποβάλλεται σε πλύση για να
απομακρυνθεί το σημασμένο με ένζυμο αδέσμευτο αντίσωμα. Το σημασμένο με ένζυμο
δεσμευμένο αντίσωμα μετράται μέσω μιας χρωμογόνου αντίδρασης. Προστίθεται και
επωάζεται χρωμογόνο διάλυμα (ΤΜΒ – H2O2). Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη
ανασχετικού διαλύματος και στη συνέχεια γίνεται ανάγνωση της πλάκας μικροτιτλοδότησης
στο κατάλληλο μήκος κύματος. Η ποσότητα μετατροπής του υποστρώματος καθορίζεται
χρωματομετρικά μετρώντας την απορρόφηση, η οποία είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση
hGH.
Παριστάνεται γραφικά μια καμπύλη βαθμονόμησης και προσδιορίζεται η συγκέντρωση της
hGH στα δείγματα με αναγωγή από την καμπύλη βαθμονόμησης.
5.
6.
Συσκευή πλύσης για πλάκες μικροτιτλοδότησης
Συσκευή ανάγνωσης πλακών μικροτιτλοδότησης με δυνατότητα ανάγνωσης στα 450
nm και 650 nm (διχρωματική ανάγνωση)
VII.
ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΟΥ
A.
B.
C.
συζεύγματος προσθέτοντας 25 µl του συμπυκνωμένου συζεύγματος αντιhGH-HRP σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος συζεύγματος. Χρησιμοποιήστε
αναμείκτη στροβιλισμού (τύπου vortex) για να ομογενοποιήσετε.
Προτείνεται προετοιμασία τη στιγμή της χρήσης.
D.
ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ
V.
Αντιδραστήρια
Πλάκα
μικροτιτλοδότησης με 96
αποσπώμενες υποδοχές
επιστρωμένες με
Ab
HRP
CONC
Σύζευγμα: αντι- hGH
(μονοκλωνικά αντισώματα)
σημασμένα με HRP σε ρυθμιστικό
διάλυμα σταθεροποίησης
CONJ
BUF
Ρυθμιστικό διάλυμα συζεύγματος:
ρυθμιστικό διάλυμα TRIS-HCl με
βόεια ορολευκωματίνη και θυμόλη
CAL
0
Κιτ 96
προσδιορισμών
Χρωματικός
κωδικός
96 υποδοχές
μπλε
Ανασύσταση
κίτρινο
ιαλίδιο
0,2 ml
Αραιώστε 40X με
ρυθμιστικό διάλυμα
συζεύγματος
N
Βαθμονομητής N = 1 έως 5
(δείτε τις ακριβείς τιμές πάνω στις
ετικέτες των φιαλιδίων) σε ορό
προβάτου και θυμόλη
§
§
§
κόκκινο
Έτοιμο για χρήση
1 φιαλίδιο
λυοφιλοποιημένο
κίτρινο
Προσθέστε 2,0 ml
απεσταγμένου νερού
5 φιαλίδια
κίτρινο
1φ
§
IX.
§
§
§
§
§
X.
WASH
SOLN
CONC
1 φιαλίδιο
10 ml
καφέ
Διάλυμα πλύσης (Tris-HCl)
CONTROL
N
Οροί ελέγχου - N = 1 ή 2
σε ανθρώπινο ορό με θυμόλη
CHROM
TMB
Αραιώστε 200 x με
απεσταγμένο νερό
(χρησιμοποιήστε
μαγνητικό αναδευτήρα).
2 φιαλίδια
ασημί
1 φιαλίδιο
12 ml
καφέ
1 φιαλίδιο
12 ml
λευκό
Χρωμογόνος TMB
(τετραμεθυλβενζυδίνη)
STOP
SOLN
Ανασχετικό αντιδραστήριο: HCl
1N
Σημείωση:
VI.
1. Χρησιμοποιείτε το μηδενικό βαθμονομητή για αραιώσεις
δειγμάτων.
2.1 μIU του παρασκευάσματος του βαθμονομητή είναι ισοδύναμο με 1 μIU
του 2ου IS 98/574
ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ
Τα ακόλουθα υλικά απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται στο κιτ:
1.
2.
3.
4.
Πριν από το άνοιγμα ή την ανασύσταση, όλα τα συστατικά του κιτ παραμένουν
σταθερά έως την ημερομηνία λήξης, η οποία αναγράφεται στην ετικέτα του φιαλιδίου,
εφόσον διατηρούνται σε θερμοκρασία 2 έως 8° C.
Οι μη χρησιμοποιημένες ταινίες πρέπει να φυλάσσονται στους 2-8° C, σε σφραγισμένη
σακούλα που περιέχει αποξηραντικό παράγοντα, μέχρι την ημερομηνία λήξης.
Μετά την ανασύσταση, οι βαθμονομητές και οι οροί ελέγχου παραμένουν σταθεροί για
μία εβδομάδα σε θερμοκρασία 2 έως 8° C. Για μεγαλύτερες περιόδους φύλαξης,
πρέπει να σχηματίζονται κλάσματα/δόσεις μιας χρήσης και να διατηρούνται στους –
20° C. Αποφύγετε τους επανειλημμένους κύκλους απόψυξης-κατάψυξης.
Το συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι την
ημερομηνία λήξης.
Φρέσκο, παρασκευασμένο διάλυμα πλύσης εργασίας θα πρέπει να χρησιμοποιείται την
ίδια ημέρα.
Μετά την πρώτη χρήση του, το σύζευγμα παραμένει σταθερό έως την ημερομηνία
λήξης, εφόσον διατηρείται στο αρχικό, ερμητικά κλειστό φιαλίδιο σε θερμοκρασία 2
έως 8° C.
Τυχόν μεταβολές της φυσικής εμφάνισης των αντιδραστηρίων του κιτ ενδέχεται να
υποδηλώνουν αστάθεια ή αλλοίωση.
ιαλίδιο
6 ml
Μηδενικός βαθμονομητής σε ορό
προβάτου και θυμόλη
CAL
§
§
1φ
Διάλυμα πλύσης εργασίας: Προετοιμάστε επαρκή όγκο διαλύματος πλύσης εργασίας
με προσθήκη 199 όγκων απεσταγμένου νερού σε 1 όγκο διαλύματος πλύσης (200x).
Χρησιμοποιήστε μαγνητικό αναδευτήρα για την ομογενοποίηση. Απορρίψτε το μη
χρησιμοποιημένο διάλυμα πλύσης εργασίας στο τέλος της ημέρας.
VIII. ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΛΗΞΗΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ
§
Βαθμονομητές: Ανασυστήστε το μηδενικό βαθμονομητή με 2,0 ml απεσταγμένου
νερού και άλλους βαθμονομητές με 0,5 ml απεσταγμένου νερού.
Οροί ελέγχου: Ανασυστήστε τους ορούς ελέγχου με 0,5 ml απεσταγμένου νερού.
Αντι-hGH-HRP σύζευγμα εργασίας: Προετοιμάστε επαρκή όγκο διαλύματος
Απεσταγμένο νερό υψηλής ποιότητας
Πιπέτες για διανομή: 50 μl, 200 μl, 500 μl και 2 ml (συνιστάται η χρήση πιπετών
ακριβείας με αναλώσιμα πλαστικά ρύγχη)
Αναμείκτης στροβιλισμού
Μαγνητικός αναδευτήρας
A.
ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ
Τα δείγματα ορού και πλάσματος πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2-8° C.
Εάν η εξέταση δεν πραγματοποιηθεί εντός 24 ωρών, συνιστάται η φύλαξη σε
κλάσματα/δόσεις μιας χρήσης στους -20° C. Αποφεύγετε τους επακόλουθους κύκλους
κατάψυξης-απόψυξης.
Φέρετε όλα τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση. Συνιστάται η
ανάμειξη των δειγμάτων σε συσκευή στροβιλισμού πριν από τη χρήση.
Ορός, ηπαρινισμένο πλάσμα ή πλάσμα με EDTA παρέχουν παρόμοια αποτελέσματα. .
Y (ορός) = 0,89 x (πλάσμα με EDTA) + 0,14
r=0,98
n=46
Y (ορός) = 1,02 x (πλάσμα με ηπαρίνη) + 0,01
r=0,98
n=46
Μην χρησιμοποιείτε δείγματα που έχουν υποστεί αιμόλυση.
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
Σημειώσεις σχετικά με το χειρισμό
Μη χρησιμοποιείτε το κιτ ή τα συστατικά μετά την ημερομηνία λήξης.
Μην αναμειγνύετε υλικά από διαφορετικές παρτίδες κιτ.
Φέρετε όλα τα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση.
Αναμείξτε καλά όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα με απαλή ανακίνηση ή
ανάδευση.
Εκτελέστε εις διπλούν ανάληψη των βαθμονομητών, των ορών ελέγχου και των
δειγμάτων. Συνιστάται κάθετη ευθυγράμμιση.
Χρησιμοποιήστε ένα καθαρό, πλαστικό δοχείο για να ετοιμάσετε το διάλυμα
πλύσης.
Χρησιμοποιείτε ένα καθαρό αναλώσιμο ρύγχος πιπέτας για την προσθήκη κάθε
διαφορετικού αντιδραστηρίου και δείγματος προκειμένου να αποφύγετε την
επιμόλυνση.
Αποφύγετε πιπέτες με μεταλλικά μέρη για τη διανομή του Χρωμογόνου
Διαλύματος και του Ανασχετικού Διαλύματος.
Η ακρίβεια βελτιώνεται με χρήση πιπετών υψηλής ακρίβειας ή
αυτοματοποιημένου εξοπλισμού διανομής με πιπέτες.
Τηρείτε τους χρόνους επώασης.
Για να αποφύγετε τη μετατόπιση, ο χρόνος μεταξύ της διανομής με πιπέτα του
πρώτου βαθμονομητή και του τελευταίου δείγματος πρέπει να περιορίζεται στο
χρόνο που αναφέρεται στην ενότητα XIII, παράγραφο E (μεσοδιάστημα).
Προετοιμάστε μια καμπύλη βαθμονόμησης για κάθε ανάλυση και μη
χρησιμοποιείτε δεδομένα από προηγούμενες αναλύσεις.
Διανείμετε το Χρωμογόνο Διάλυμα εντός 15 λεπτών από την πλύση της πλάκας
μικροτιτλοδότησης.
Κατά τη διάρκεια επώασης με το Χρωμογόνο Διάλυμα, αποφύγετε την έκθεση
της πλάκας μικροτιτλοδότησης σε άμεσο ηλιακό φως.
Διαδικασία
Επιλέξτε τον απαιτούμενο αριθμό ταινιών για την ανάλυση. Οι μη χρησιμοποιημένες
ταινίες πρέπει να ξανασφραγιστούν μέσα στη σακούλα με τον αποξηραντικό
παράγοντα και να φυλαχτούν σε θερμοκρασία 2-8° C.
Ασφαλίστε τις ταινίες μέσα στο πλαίσιο στήριξης.
Διανείμετε με πιπέτα 50 µl από κάθε βαθμονομητή, ορό ελέγχου και δείγμα στις
κατάλληλες υποδοχές.
B.
1.
2.
3.
Γ.
Ακρίβεια
ΓΙΑ ΤΟΝ ΙΔΙΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ
Ορός
N
<X> ± Τ.Α.
(μIU/ml)
Σ.Δ.
(%)
Ορός
N
<X> ± Τ.Α.
(μIU/ml)
Σ.Δ.
(%)
A
B
20
20
6,90 ± 0,34
16,61 ± 0,90
4,9
5,4
A
B
8
8
11,4 ± 0,9
23,5 ± 1,2
8,1
5,1
Διανείμετε με πιπέτα 50 µl αντι-hGH-HRP συζεύγματος εργασίας σε όλες
τις υποδοχές.
Επωάστε επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου - Η τήρηση 30 λεπτών
ως διάρκεια για αυτήν την επώαση είναι υποχρεωτική.
4.
5.
Αναρροφήστε το υγρό από κάθε υποδοχή.
Πλύνετε την πλάκα 3 φορές:
§
διανέμοντας 0,4 ml διαλύματος πλύσης σε κάθε υποδοχή.
§
αναρροφώντας το περιεχόμενο κάθε υποδοχής.
Διανείμετε με πιπέτα 100 µl του χρωμογόνου διαλύματος σε κάθε υποδοχή, εντός 15
λεπτών από το βήμα πλύσης.
Επωάστε επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, αποφύγετε την άμεση έκθεση στην
ηλιακή ακτινοβολία.
Διανείμετε με πιπέτα 100 µl ανασχετικού διαλύματος σε κάθε υποδοχή.
Κάντε ανάγνωση των απορροφήσεων στα 450 nm (φίλτρο αναφοράς 630 nm ή 650
nm) εντός 1 ώρας και υπολογίστε τα αποτελέσματα όπως περιγράφεται στην ενότητα
XI.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
XI.
ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
1.
Κάντε ανάγνωση της πλάκας στα 450 nm έναντι ενός φίλτρου αναφοράς που
ρυθμίζεται στα 650 nm (ή τα 630 nm).
Υπολογίστε τη μέση τιμή των διπλών προσδιορισμών.
Σε ημιλογαριθμικό ή γραμμικό χαρτί γραφημάτων, παραστήστε γραφικά τις τιμές
OD (τεταγμένη) για κάθε βαθμονομητή έναντι της αντίστοιχης συγκέντρωσης της
hGH (τετμημένη) και σχεδιάστε μια καμπύλη βαθμονόμησης μέσω των σημείων του
βαθμονομητή, συνδέοντας με ευθείες γραμμές τα αποτυπωμένα σημεία.
Διαβάστε τη συγκέντρωση για κάθε ορό ελέγχου και δείγμα με αναγωγή στην
καμπύλη βαθμονόμησης.
Αναγωγή δεδομένων με τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή θα απλοποιήσει
αυτούς τους υπολογισμούς. Εάν χρησιμοποιείται αυτόματη επεξεργασία
αποτελεσμάτων, συνιστάται προσαρμογή καμπύλης λογιστικής συνάρτησης 4
παραμέτρων.
2.
3.
4.
5.
XII.
Τ.Α.: Τυπική απόκλιση, Σ.Δ.: Συντελεστής διακύμανσης
Δ.
Ορθότητα
ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΑΝΑΚΤΗΣΗΣ
Δείγμα
Προστεθείσα
hGH
(μIU/ml)
Ορός
4,3
13,5
26,8
52,1
4,1
12,8
28,1
58,9
95
95
105
113
Πλάσμα
4,3
13,5
26,8
52,1
4,6
13,2
25,3
53,0
106
98
94
102
Αραίωση
Ορός 1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
48,8
24,4
12,2
6,1
3,1
97,7
57,0
27,7
13,6
6,4
3,0
Ορός 2
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
10,6
5,3
2,7
1,3
0,7
21,2
9,3
4,6
2,2
1,1
0,6
Μονάδες OD
0 μIU/ml
0,45 μIU/ml
5,4 μIU/ml
12,9 μIU/ml
43,5 μIU/ml
98,0 μIU/ml
0,030
0,062
0,226
0,501
1,429
2,330
Μετρηθείσα
συγκέντρωση
(μIU/ml)
Συντελεστής μετατροπής:
1 µIU του βαθμονομητή ισοδύναμεί με 0,33 ng
E.
B.
Θεωρητική
συγκέντρωση
(μIU/ml)
Τα δείγματα αραιώθηκαν με μηδενικό βαθμονομητή.
XIII. ΑΠΟΔΟΣΗ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ
A.
Ανάκτηση
(%)
Δείγμα
Τα ακόλουθα δεδομένα προορίζονται μόνο ως παράδειγμα και δεν πρέπει να
χρησιμοποιούνται ποτέ αντί της καμπύλης βαθμονόμησης πραγματικού χρόνου.
Βαθμονομητής
Ανακτηθείσα
hGH
(μIU/ml)
ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΑΡΑΙΩΣΗΣ
ΤΥΠΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ
hGH-EASIA
ΜΕΤΑΞΥ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΩΝ
Όριο ανίχνευσης
Μετρήθηκαν είκοσι μηδενικοί βαθμονομητές μαζί με ένα σύνολο άλλων
βαθμονομητών. Το όριο ανίχνευσης, οριζόμενο ως η φαινομενική συγκέντρωση δύο
τυπικών αποκλίσεων πάνω από τις μέσες μετρήσεις OD σε μηδενική δέσμευση, ήταν
0,17 μIU/ml.
Μεσοδιάστημα μεταξύ της διανομής τελευταίου βαθμονομητή και δείγματος
Όπως φαίνεται στη συνέχεια, τα αποτελέσματα του προσδιορισμού παραμένουν
αξιόπιστα ακόμα και όταν διανέμεται ένα δείγμα 60 λεπτά μετά την προσθήκη των
βαθμονομητών στα επιστρωμένα σωληνάρια.
ΜΕΣΟΔΙΑΣΤΗΜΑ
Ειδικότητα
Ορμόνες διασταυρούμενης αντιδραστικότητας προστέθηκαν σε ένα δείγμα ορού
ελέγχου hGH χαμηλής και υψηλής τιμής. Μετρήθηκε η φαινομενική απόκριση της
hGH.
S1
S2
0 λεπτά
10
λεπτά
20
λεπτά
30
λεπτά
45
λεπτά
60
λεπτά
4,0
13,5
3,6
15,0
3,3
13,8
3,3
13,0
3,0
12,6
3,8
13,0
hGH C1
hGH C2
Προστεθείσα ορμόνη
µIU/ml
µIU/ml
-
1,9
13,5
hCG 100000 mIU/ml
2,0
14,3
hPL 10000 ng/ml
1,4
13,0
XIV. ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΣ ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ
PRL 12500 ng/ml
1,8
12,6
§
ΣΤ.
§
§
§
Φαινόμενο αγκίστρου (hook)
Δείγμα που εμβολιάστηκε με hGH έως 4000 μIU/ml δίνει υψηλότερες μετρήσεις
οπτικής πυκνότητας (OD) από το σημείο του τελευταίου βαθμονομητή.
Εάν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται για τον ορό ελέγχου 1 ή/και τον ορό ελέγχου 2
δε βρίσκονται εντός του πεδίου τιμών που καθορίζεται στην ετικέτα του φιαλιδίου, τα
αποτελέσματα δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν, εκτός εάν έχει δοθεί
ικανοποιητική εξήγηση για την ασυμφωνία.
Εάν είναι επιθυμητό, κάθε εργαστήριο μπορεί να δημιουργήσει τα δικά του μείγματα
δειγμάτων ελέγχου (pools), τα οποία πρέπει να διατηρούνται κατεψυγμένα σε
κλάσματα/δόσεις μιας χρήσης. Οροί ελέγχου που περιέχουν αζίδιο θα επιδράσουν στην
ενζυμική αντίδραση και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν.
Τα κριτήρια αποδοχής για τη διαφορά μεταξύ των διπλών αποτελεσμάτων των
δειγμάτων θα πρέπει να βασίζονται σε ορθές εργαστηριακές πρακτικές.
Συνιστάται οι οροί ελέγχου να υποβάλλονται σε προσδιορισμό τακτικά ως άγνωστα
δείγματα για να μετράται η μεταβλητότητα του προσδιορισμού. Η απόδοση του
§
XV.
προσδιορισμού πρέπει να παρακολουθείται με διαγράμματα ποιοτικού ελέγχου των
ορών ελέγχου.
Είναι καλό το να ελέγχετε οπτικά την προσαρμογή της καμπύλης που επιλέχθηκε από
τον υπολογιστή.
XVIII.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΟΥ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ
ΤΙΜΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ
Οι τιμές αυτές παρέχονται μόνον ως οδηγός. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθιερώσει το
δικό του πεδίο φυσιολογικών τιμών.
Σε φυσιολογικά υποκείμενα, η έκκριση της αυξητικής ορμόνης (hGH) είναι παλμικού τύπου.
Κατά τη διάρκεια της ημέρας, οι συγκεντρώσεις της hGH κυμαίνονται από <0,2-10 μIU/ml.
Κατά τη διάρκεια του ύπνου, οι συγκεντρώσεις της hGH αυξάνονται σταθερά (± 30 μIU/ml).
Η έκκριση της hGH διεγείρεται κατά πολύ από την άσκηση και το στρες (φλεβική
παρακέντηση, υπογλυκαιμία, ...), αλλά μειώνεται από την υπεργλυκαιμία.
Σε φυσιολογικά υποκείμενα (n=34), δύο ώρες μετά από του στόματος λήψη γλυκόζης (75 g
σε ενηλίκους), τα επίπεδα της hGH ήταν χαμηλότερα από 10 μIU/ml και η απόκριση της
hGH σε δοκιμασίες διέγερσης (χορήγηση ινσουλίνης, αργινίνης, γλυκαγόνης) υπερέβαινε τα
20 μIU/ml.
Τα επίπεδα της hGH ήταν αυξημένα (ακόμη και μετά τη χορήγηση γλυκόζης) στη
μεγαλακρία (> 10 μIU/ml).
Σε ανεπάρκεια hGH, η απόκριση στη δοκιμασία διέγερσης είτε δεν υπάρχει είτε έχει
αμβλυνθεί (μικρό ανάστημα λόγω ανεπάρκειας hGH, υποϋποφυσισμός προερχόμενος από
διάφορα αίτια).
Βαθμονομητές (0-5)
Δείγματα, οροί ελέγχου
Αντι-hGH-HRP σύζευγμα
εργασίας
ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΤΕΣ
(µl)
ΔΕΙΓΜΑ(ΤΑ)
ΟΡΟΙ ΕΛΕΓΧΟΥ
(µl)
50
50
50
50
Επωάστε επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου
Αναρροφήστε το περιεχόμενο κάθε υποδοχής.
Πλύνετε 3 φορές με 400 µl διαλύματος πλύσης και αναρροφήστε.
Αποκαλυπτικό διάλυμα
100
XVI. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ
Επωάστε επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου
Ασφαλείας
Μόνο για διαγνωστική χρήση in vitro.
Τα συστατικά ανθρώπινου αίματος που περιλαμβάνονται στο κιτ αυτό έχουν ελεγχθεί με
μεθόδους εγκεκριμένες στην Ευρώπη ή/και από τον FDA και έχει διαπιστωθεί ότι είναι
αρνητικά ως προς την παρουσία HBsAg, αντι-HCV, αντι-HIV-1 και 2. Καμία γνωστή
μέθοδος δεν είναι δυνατό να παρέχει πλήρη διασφάλιση ότι παράγωγα του ανθρώπινου
αίματος δε θα μεταδώσουν ηπατίτιδα, AIDS ή άλλες λοιμώξεις. Επομένως, ο χειρισμός
αντιδραστηρίων, δειγμάτων ορού ή πλάσματος θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τις τοπικές
διαδικασίες περί ασφάλειας.
Όλα τα ζωικά προϊόντα και παράγωγα έχουν συλλεχθεί από υγιή ζώα. Τα βόεια συστατικά
προέρχονται από χώρες όπου δεν έχει αναφερθεί BSE. Παρ' όλ' αυτά, συστατικά που
περιέχουν ζωικές ουσίες θα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως δυνητικώς μολυσματικά.
Αποφύγετε κάθε επαφή με το δέρμα με όλα τα αντιδραστήρια. Σε περίπτωση επαφής,
πλύνετε σχολαστικά με νερό.
Μην καπνίζετε, μην πίνετε, μην τρώτε και μη χρησιμοποιείτε καλλυντικά στο χώρο εργασίας.
Μην διανέμετε με πιπέτα χρησιμοποιώντας το στόμα σας. Χρησιμοποιείτε προστατευτικό
ρουχισμό και γάντια μιας χρήσης.
Ανασχετικό διάλυμα
100
100
100
Κάντε ανάγνωση σε συσκευή ανάγνωσης πλακών μικροτιτλοδότησης και καταγράψτε
την απορρόφηση κάθε υποδοχής στα 450 nm (έναντι 630 ή 650 nm)
Αρ. καταλόγου DIAsource:
KAP1081
Αριθμός P.I.:
1700573/el
Αρ. αναθεώρησης:
090504/1
ημερομηνία αναθεώρησης : 2009-05-04
XVII. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1.
CAMANNI F., MASSARA F., BELFORTE L., ROSATELLO A., MOLENATTI
G.M. (1977)
Effect of dopamine on plasma growth hormone and prolactin levels in normal
and acromegalic subjects.
2.
The adenohypophysis
In : "Textbook of Endocrinology", R.H. Williams ed., W.B. Saunders, Philadelphia,
p;73.
3.
4.
5.
6.
LI C.H. (1974)
Human growth hormone : perspective on its chemistry and physiology.
In : "Advances in human growth hormone research", S. Raiti ed. U.S. Department of
Health, Education and Welfare Publ. DMEW publ. no. (NJH) 74-612, p. 321.
7.
REUTENS AT. (1995)
Evaluation and application of a highly sensitive assay for serum growth
hormone (GH) in the study of adult GH deficiency.
8.
Growth and the growth hormone axis in prepubertal children with asthma.
J. Pediatr. 126(2): 297-303.
9.
Effect of different oral oestrogen formulations on insulin-like growth factor I,
growth hormone and growth hormone binding protein in post-menopausal
women.
P.I. Number : 1701000
Revision nr 070716
WASH
SOLN
CAL
0
CAL
N
CONTROL
CONC
N
Used symbols
Symboles utilisés
Consult instructions for use
Consulter les instructions d’utilisation
Storage temperature
Température de conservation
Use by
Utiliser jusque
Batch code
Numéro de lot
Catalogue number
Référence de catalogue
Control
Contrôle
In vitro diagnostic medical device
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Manufacturer
Fabricant
Contains sufficient for <n> tests
Contenu suffisant pour <n> tests
Wash solution concentrated
Solution de lavage concentrée
Zero calibrator
Calibrateur zéro
Calibrator #
Calibrateur #
Control #
Contrôle #
Ag
125I
Tracer
Traceur
Ab
125I
Tracer
Traceur
Ag
125I
CONC
Tracer concentrated
Traceur concentré
Ab
125I
CONC
Tracer concentrated
Traceur concentré
Tubes
Tubes
Incubation buffer
Tampon d'incubation
Acetonitrile
Acétonitrile
Serum
Sérum
INC
BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL
SPE
Specimen diluent
Diluant du spécimen
DIL
BUF
Dilution buffer
Tampon de dilution
ANTISERUM
Antiserum
Antisérum
IMMUNOADSORBENT
Immunoadsorbent
Immunoadsorbant
DIL
CAL
Calibrator diluent
Diluant de calibrateur
REC
SOLN
Reconstitution solution
Solution de reconstitution
Polyethylene glycol
Glycol Polyéthylène
EXTR
SOLN
Extraction solution
Solution d’extraction
ELU
SOLN
Elution solution
Solution d’elution
Bond Elut Silica cartridges
Cartouches Bond Elut Silica
Pre-treatment solution
Solution de pré-traitement
Neutralization solution
Solution de neutralisation
Tracer buffer
Tampon traceur
Microtiterplate
Microplaque de titration
HRP Conjugate
HRP Conjugué
PEG
GEL
PRE
SOLN
NEUTR
SOLN
TRACEUR
BUF
Ab
HRP
Ag
HRP
HRP Conjugate
HRP Conjugué
Ab
HRP
CONC
HRP Conjugate concentrate
HRP Conjugué concentré
Ag
HRP
CONC
HRP Conjugate concentrate
HRP Conjugué concentré
CONJ
BUF
Conjugate buffer
Tampon conjugué
Chromogenic TMB concentrate
Chromogène TMB concentré
Chromogenic TMB solution
Solution chromogène TMB
Substrate buffer
Tampon substrat
CHROM
TMB
CHROM
TMB
CONC
SUB
BUF
STOP
SOLN
Stop solution
Solution d’arrêt
INC
SER
Incubation serum
Sérum d'incubation
Buffer
Tampon
AP Conjugate
AP Conjugué
Substrate PNPP
Tampon PNPP
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
BIOT
CONJ
CONC
Biotin conjugate concentrate
Biotine conjugué concentré
AVID
HRP
CONC
Avidine HRP concentrate
Avidine HRP concentré
ASS
BUF
Assay buffer
Tampon de test
Ab
BIOT
Biotin conjugate
Biotine conjugué
Specific Antibody
Anticorps spécifique
Streptavidin HRP concentrate
Concentré streptavidine HRP
Non-specific binding
Liant non spécifique
2nd Antibody
Second anticorps
Acidification Buffer
Tampon d'acidification
Ab
SAV
HRP
NSB
2nd Ab
ACID
BUF
CONC
P.I. Number : 1701000
Revision nr 070716
WASH
SOLN
CAL
0
CAL
N
CONTROL
CONC
N
Gebruikte symbolen
Gebrauchte Symbolen
Raadpleeg de gebruiksaanwijzing
Gebrauchsanweisung beachten
Bewaartemperatuur
Lagern bei
Houdbaar tot
Verwendbar bis
Lotnummer
Chargenbezeichnung
Catalogusnummer
Bestellnummer
Controle
Kontrolle
Medisch hulpmiddel voor in-vitro diagnostiek
In Vitro Diagnostikum
Fabrikant
Hersteller
Inhoud voldoende voor <n> testen
Ausreichend für <n> Ansätze
Wasoplossing, geconcentreerd
Waschlösung-Konzentrat
Nulkalibrator
Null kalibrator
Kalibrator #
Kalibrator #
Controle #
Kontrolle #
Ag
125I
Tracer
Tracer
Ab
125I
Tracer
Tracer
Ag
125I
CONC
Tracer geconcentreerd
Tracer Konzentrat
Ab
125I
CONC
Tracer geconcentreerd
Tracer Konzentrat
Buisjes
Röhrchen
Incubatiebuffer
Inkubationspuffer
Acetonitrile
Azetonitril
Serum
Humanserum
INC
BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL
SPE
Specimen diluent
Probenverdünner
DIL
BUF
Verdunningsbuffer
Verdünnungspuffer
ANTISERUM
Antiserum
Antiserum
IMMUNOADSORBENT
Immunoadsorbent
Immunadsorbens
DIL
CAL
Kalibratorverdunner
Kalibratorverdünnung
REC
SOLN
Reconstitutieoplossing
Rekonstitutionslösung
Polyethyleen glycol
Polyethylenglykol
EXTR
SOLN
Extractieoplossing
Extraktionslösung
ELU
SOLN
Elutieoplossing
Eluierungslösung
Bond Elut Silica kolom
Bond Elut Silikakartuschen
Pre-behandelingsoplossing
Vorbehandlungslösung
Neutralisatieoplossing
Neutralisierungslösung
Tracerbuffer
Tracer-Puffer
Microtiterplaat
Mikrotiterplatte
HRP Conjugaat
HRP Konjugat
PEG
GEL
PRE
SOLN
NEUTR
SOLN
TRACEUR
BUF
Ab
HRP
Ag
HRP
HRP Conjugaat
HRP Konjugat
Ab
HRP
CONC
HRP Conjugaat geconcentreerd
HRP Konjugat Konzentrat
Ag
HRP
CONC
HRP Conjugaat geconcentreerd
HRP Konjugat Konzentrat
CONJ
BUF
Conjugaat buffer
Konjugatpuffer
Chromogene TMB geconcentreerd
Chromogenes TMB Konzentrat
Chromogene Oplossing TMB
Farblösung TMB
Substraatbuffer
Substratpuffer
CHROM
TMB
CHROM
TMB
CONC
SUB
BUF
STOP
SOLN
Stopoplossing
Stopplösung
INC
SER
Incubatieserum
Inkubationsserum
Buffer
Puffer
AP Conjugaat
AP Konjugat
Substraat PNPP
Substrat PNPP
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
BIOT
CONJ
CONC
Geconcentreerd Biotine conjugaat
Biotin-Konjugat-Konzentrat
AVID
HRP
CONC
Geconcentreerd Avidine-HRP conjugaat
Avidin-HRP-Konzentrat
ASS
BUF
Assay buffer
Assaypuffer
Ab
BIOT
Biotine conjugaat
Biotin-Konjugat
Specifiek antilichaam
Spezifischer Antikörper
Streptavidine-HRP concentraat
HRP Streptavidinkonzentrat
Aspecifieke binding
Unspezifische Bindung
2de antilichaam
Sekundärer Antikörper
Verzuringsbuffer
Ansäuerungspuffer
Ab
SAV
HRP
NSB
2nd Ab
ACID
BUF
CONC
P.I. Number : 1701000
Revision nr 070716
WASH
SOLN
CAL
0
CAL
N
CONTROL
CONC
N
Simboli utilizzati
Símbolos utilisados
Consultare le istruzioni per l’uso
Consultar las instrucciones de uso
Limitazioni di temperatura
Limitación de temperatura
Utilizzare entro
Fecha de caducidad
Numero di lotto
Codigo de lote
Numero di catalogo
Número de catálogo
Controllo
Control
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Fabbricante
Fabricante
Contenuto sufficiente per <n> saggi
Contenido suficiente para <n> ensayos
Tampone di lavaggio concentrato
Solución de lavado concentrada
Calibratore zero
Calibrador cero
Standard #
Calibrador #
Controllo #
Control #
Ag
125I
Marcato
Trazador
Ab
125I
Marcato
Trazador
Ag
125I
CONC
Marcato concentrato
Trazador concentrada
Ab
125I
CONC
Marcato concentrato
Trazador concentrada
Provette
Tubos
Tampone incubazione
Tampón de incubación
Acetonitrile
Acetonitrilo
Siero
Suero
INC
BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL
SPE
Diluente campione
Diluyente de Muestra
DIL
BUF
Tampone diluizione
Tampón de dilución
ANTISERUM
Antisiero
Antisuero
IMMUNOADSORBENT
Immunoassorbente
Inmunoadsorbente
DIL
CAL
Diluente calibratore
Diluyente de calibrador
REC
SOLN
Soluzione di ricostituzione
Solución de Reconstitución
Polietilenglicole
Glicol Polietileno
EXTR
SOLN
Soluzione di estrazione
Solución de extracción
ELU
SOLN
Soluzione di eluizione
Solución de elución
Cartucce di silice bond elut
Cartuchos Bond Elut Silica
Soluzione di pretrattamento
Solución de Pre-tratamiento
Soluzione di neutralizzazione
Solución de Neutralización
Tracer Buffer
Tampón de trazador
Piastra di microtitolazione
Placa de microvaloración
HRP Coniugato
HRP Conjugado
PEG
GEL
PRE
SOLN
NEUTR
SOLN
TRACEUR
BUF
Ab
HRP
Ag
HRP
HRP Coniugato
HRP Conjugado
Ab
HRP
CONC
HRP Coniugato concentrato
HRP Conjugado concentrada
Ag
HRP
CONC
HRP Coniugato concentrato
HRP Conjugado concentrada
CONJ
BUF
Buffer coniugato
Tampón de Conjugado
Cromogena TMB concentrato
Cromógena TMB concentrada
Soluzione cromogena TMB
Solución Cromógena TMB
Tampone substrato
Tampón de sustrato
CHROM
TMB
CHROM
TMB
CONC
SUB
BUF
STOP
SOLN
Soluzione di arresto
Solución de Parada
INC
SER
Incubazione con siero
Suero de Incubación
Buffer
Tampón
AP Coniugato
AP Conjugado
Substrato PNPP
Sustrato PNPP
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
BIOT
CONJ
CONC
Concentrato coniugato con biotina
Concentrado de conjugado de biotina
AVID
HRP
CONC
Concentrato avidina HRP
Concentrado avidina-HRP
ASS
BUF
Soluzione tampone per test
Tampón de ensayo
Ab
BIOT
Coniugato con biotina
Conjugado de biotina
Anticorpo Specifico
Anticuerpo específico
Streptavidina-HRP concentrata
Estreptavidina-HRP Concentrado
Legame non-specifico
Unión no específica
2° Anticorpo
Segundo anticuerpo
Tampone Acidificante
Tampón de Acidificación
Ab
SAV
HRP
NSB
2nd Ab
ACID
BUF
CONC
P.I. Number : 1701000
Revision nr 070716
WASH
SOLN
CAL
0
CAL
N
CONTROL
CONC
N
Símbolos utilizados
Använda symboler
Consulte instruções de utilização
Läs instruktionerna före användning
Temperatura de conservação
Förvaringstemperatur
Utilizar antes de
Används av
Código de lote
Lotnummer
Número de catálogo
Katalognummer
Controlo
Kontroll
Dispositivo médico de diagnóstico in vitro
In vitro diagnostiskt kit
Fabricante
Tillverkare
Conteúdo suficiente para <n> testes
Innehållet räcker till <n> prover
Solução de lavagem concentrada
Tvättlösning, koncentrerad
Calibrador zero
Nollkalibrerare
Calibrador #
Kalibrator #
Controlo #
Kontroll #
Ag
125I
Marcador
Radioisotop, antigen
Ab
125I
Marcador
Radioisotop, antikropp
Ag
125I
CONC
Marcador concentrada
Radioisotop, antigen koncentrerad
Ab
125I
CONC
Marcador concentrada
Radioisotop, antikropp koncentrerad
Tubos
Rör
Tampão de incubação
Inkuberingsbuffert
Acetonitrilo
Acetonitril
Soro
Serum
INC
BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL
SPE
Diluidor de espécimes
Spädningsbuffert för prover
DIL
BUF
Tampão de diluição
Spädningsbuffert
ANTISERUM
Anti-soro
Antiserum
IMMUNOADSORBENT
Imunoadsorvente
Immunoadsorberare
DIL
CAL
Diluente do calibrador
Kalibratordiluent
REC
SOLN
Solução de Reconstituição
Rekonstitutionslösning
Polietileno-glicol
Polyetylenglykol
EXTR
SOLN
Solução de Extracção
Extraktionslösning
ELU
SOLN
Solução de Eluição
Elueringslösning
Cartuchos de silica Bond Elut
Silikonpatroner för elueringsbindning
Solução de pré-tratamento
Förbehandlingslösning
Solução de neutralização
Neutraliseringslösning
Tampão Marcador
Tracerbuffert
Placa de micro titulação
Microtiterplatta
HRP Conjugação
HRP-konjugat
PEG
GEL
PRE
SOLN
NEUTR
SOLN
TRACEUR
BUF
Ab
HRP
Ag
HRP
HRP Conjugação
HRP-konjugat
Ab
HRP
CONC
HRP Conjugação concentrada
HRP-konjugat-koncentrat
Ag
HRP
CONC
HRP Conjugação concentrada
HRP-konjugat-koncentrat
CONJ
BUF
Conjugue o tampão
Konjugatbuffert
Cromogénica TMB concentrada
Kromogeniskt TMB-koncentrat
Solução Cromogénica TMB
Kromogenisk TMB-lösning
CHROM
TMB
CHROM
TMB
CONC
SUB
BUF
Tampão de substrato
Substratbuffert
STOP
SOLN
Solução de Paragem
Stoplösning
INC
SER
Soro de incubação
Inkubationsserum
Tampão
Buffert
BUF
Ab
AP
AP Conjugação
AP-konjugat
SUB
PNPP
Substrato PNPP
Substrat-PNPP
BIOT
CONJ
CONC
Concentrado conjugado de biotina
Biotinkonjugat koncentrat
AVID
HRP
CONC
Concentrado HRP de avidina
Avidin HRP-koncentrat
ASS
BUF
Tampão de ensaio
Provbuffert
Ab
BIOT
Conjugado de biotina
Biotinkonjugat
Anticorpo específico
-
Estreptavidina HRP concentrado
-
Ligações não especificas
-
Anticorpo secundário
-
Tampão de acidificação
-
Ab
SAV
HRP
NSB
2nd Ab
ACID
BUF
CONC
P.I. Number : 1701000
Revision nr 070716
WASH
SOLN
CAL
0
CAL
N
CONTROL
CONC
N
Επεξήγηση συμβόλων
Anvendte symboler
Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης
Læs brugsvejledningen
Θερμοκρασία αποθήκευσης
Opbevaringstemperatur
Ημερομηνία λήξης
Anvend inden
Αριθμός παρτίδας
Batchkode
Αριθμός καταλόγου
Katalognummer
Πρότυπο ελέγχου
Kontrol
In Vitro Διαγνωστικό Ιατροτεχνολιγικό προιόν
Medicinsk udstyr til in vitro-diagnosticering
Κατασκευαστής
Fabrikant
Περιεχόμενο επαρκές για «ν» εξετάσεις
Indeholder nok til <n> test
Συμπυκνωμένο διάλυμα έκπλυσης
Koncentreret vaskeopløsning
Μηδενικός βαθμονομητής
Nul-kalibrator
Βαθμονομητής #
Kalibrator nr.
Ορός ελέγχου #
Kontrol nr.
Ag
125I
Ιχνηθέτης
Markør
Ab
125I
Ιχνηθέτης
Markør
Ag
125I
CONC
Χρωμογόνος Ιχνηθέτης
Koncentreret markør
Ab
125I
CONC
Χρωμογόνος Ιχνηθέτης
Koncentreret markør
Σωληνάρια
Tuber
Ρυθμιστικό διάλυμα επώασης
Inkubationsbuffer
Ακετονιτρίλιο
Acetonitril
Ορός
Serum
INC
BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL
SPE
Διάλυμα αραίωσης δειγμάτων
Prøvediluent
DIL
BUF
Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης
Fortyndingsbuffer
ANTISERUM
Αντιορός
Antiserum
IMMUNOADSORBENT
Ανοσοπροσροφητικό
Immonoadsorbent
DIL
CAL
Αραιωτικό βαθμονομητών
Kalibratordiluent
REC
SOLN
Διάλυμα ανασύστασης
Rekonstitueringsopløsning
Πολυαιθυλενογλυκόλη
Polyetylenglykol
EXTR
SOLN
Διάλυμα εκχύλισης
Ekstraktionsopløsning
ELU
SOLN
Διάλυμα έκλουσης
Elueringsopløsning
Φύσιγγες πυριτίου Bond Elut
Patroner med bindingselueringssilica
Διάλυμα προεπεξεργασίας
Forbehandlingsopløsning
Διάλυμα εξουδετέρωσης
Neutraliseringsopløsning
Ρυθμιστικό διάλυμα
Markørbuffer
Πλάκα μικροτιτλοδότησης
Mikrotiterplade
HRP Σύζευγμα
HRP-konjugat
PEG
GEL
PRE
SOLN
NEUTR
SOLN
TRACEUR
BUF
Ab
HRP
Ag
HRP
HRP Σύζευγμα
HRP-konjugat
Ab
HRP
CONC
Χρωμογόνος HRP Σύζευγμα
HRP-konjugat-koncentreret
Ag
HRP
CONC
Χρωμογόνος HRP Σύζευγμα
HRP-konjugat-koncentreret
CONJ
BUF
Ρυθμιστικό διάλυμα συζεύγματος
Konjugatbuffer
Χρωμογόνος TMB
Kromogen TMB-koncentreret
Διάλυμα χρωμογόνου ΤΜΒ
Kromogen TMB-opløsning
Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος
Substratbuffer
CHROM
TMB
CHROM
TMB
CONC
SUB
BUF
STOP
SOLN
Ανασχετικό αντιδραστήριο
Stopopløsning
INC
SER
Ορός επώασης
Inkubationsserum
Ρυθμιστικό διάλυμα
Buffer
AP Σύζευγμα
AP-konjugat
PNPP υποστρώματος
Substrat PNPP
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
BIOT
CONJ
CONC
Συμπυκνωμένο αντιδραστήριο συζευγμένο με βιοτίνη
Biotin konjugat koncentrat
AVID
HRP
CONC
Συμπυκνωμένο διάλυμα αβιδίνης-HRP
Avidin HRP koncentrat
ASS
BUF
Ρυθμιστικό διάλυμα προσδιορισμού
Prøvebuffer
Ab
BIOT
αντιδραστήριο συζευγμένο με βιοτίνη
Biotin konjugat
Ειδικό Αντίσωμα
-
Συμπυκνωμένη στρεπταβιδίνη συνεξευγμένη με HRP
-
μη-ειδική δέσμευση
-
2ο Αντίσωμα
-
Ρυθμιστικό Διάλυμα όξινο
-
Ab
SAV
HRP
NSB
2nd Ab
ACID
BUF
CONC
P.I. Number : 1701000
Revision nr 070716
WASH
SOLN
CAL
0
CAL
N
CONTROL
CONC
N
Stosowane symbole
Használt szimbólumok
Przed zastosowaniem zapoznać się z instrukcją
Olvassa el a használati útmutatót
Temperatura przechowywania
Tárolási hőmérséklet
Zużyć przed
Lejárati idő
Kod serii
Gyártási kód
Numer katalogowy
Katalógus szám
Kontrola
Kontrol
Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro
In vitro diagnosztikai eszköz
Producent
Gyártó
Zawartość wystarczająca do <n> testów
Tartalma <n> teszt elvégzésére elegendő
Roztwór płuczący stężony
Mosó folyadék koncentrátum
Kalibrator zerowy
Zero kalibrátor
Kalibrator nr
Kalibrátor #
Kontrola nr
Kontrol #
Ag
125I
Znacznik izotopowy
Nyomjelző izotóp
Ab
125I
Znacznik izotopowy
Nyomjelző izotóp
Ag
125I
CONC
Znacznik izotopowy stężony
Nyomjelző izotóp koncentrátum
Ab
125I
CONC
Znacznik izotopowy stężony
Nyomjelző izotóp koncentrátum
Probówki
Csövek
Wymagana inkubacja buforu
Inkubáló puffer
Acetonitryl
Acetonitril
Surowica
Szérum
INC
BUF
ACETONITRILE
SERUM
DIL
SPE
Rozcieńczalnik próbki
Mintahigító
DIL
BUF
Bufor do rozcieńczania
Higító puffer
ANTISERUM
Antysurowica
Antiszérum
IMMUNOADSORBENT
Immunoadsorbent
Immunadszorbens
DIL
CAL
Rozcieńczalnik kalibratora
Kalibrátor higító
REC
SOLN
Roztwór do rozcieńczania
Mintaelőkészítő oldat
Glikol poli(oksy)etylenowy
Polietilén glikol
EXTR
SOLN
Roztwór ekstrakcyjny
Extrakciós oldat
ELU
SOLN
Roztwór elucyjny
Eluáló oldat
Kolumny krzemionkowe Bond Elut
Bond Elut Silica szilikagél patronok
Roztwór do przygotowania wstępnego
Előkezelő oldat
Roztwór neutralizujący
Semlegesítő oldat
Bufor znacznika
Nyomjelző izotóp higító puffer
mikropłytka
Mikrotiter lemez
Koniugat peroksydazy chrzanowej
HRP konjugátum
PEG
GEL
PRE
SOLN
NEUTR
SOLN
TRACEUR
BUF
Ab
HRP
Ag
HRP
Koniugat peroksydazy chrzanowej
HRP konjugátum
Ab
HRP
CONC
Koncentrat koniugatu peroksydazy chrzanowej
HRP konjugátum koncentrátum
Ag
HRP
CONC
Koncentrat koniugatu peroksydazy chrzanowej
HRP konjugátum koncentrátum
CONJ
BUF
Bufor do koniugacji
Konjugátum puffer
Koncentrat chromogenu TMB (czterometylobenzydyny)
Kromogén TMB koncentrátum
Roztwór chromogenu TMB (czterometylobenzydyny)
Kromogén TMB oldat
Bufor substratu
Szubsztrát puffer
CHROM
TMB
CHROM
TMB
CONC
SUB
BUF
STOP
SOLN
Roztwór zatrzymujący reakcję
Stop oldat
INC
SER
Wymagana inkubacja surowicy
Inkubációs szérum
Bufor
Puffer
Koniugat AP (fosfatazy alkalicznej)
AP konjugátum
p-nitrofenylofosforan substratowy
Szubsztrát PNPP
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
BIOT
CONJ
CONC
Koncentrat koniugatu biotyny
Biotin konjugátum koncentrátum
AVID
HRP
CONC
Koncentrat peroksydazy chrzanowej z awidyną
Avidin HRP koncentrátum
ASS
BUF
Bufor do oznaczania
Vizsgálati puffer
Ab
BIOT
Koniugatu biotyny
Biotin konjugátum
Przeciwciało swoiste
Specifikus ellenanyag
Koncentrat streptawidyny HRP
Sztreptavidin HRP koncentrátum
NSB
Wiązanie nieswoiste
Nem-specifikus kötődés
2nd Ab
Drugie przeciwciało
Másodlagos ellenanyag
Bufor zakwaszający
Savas puffer
Ab
SAV
ACID
HRP
BUF
CONC
P.I. Number : 1701000
Revision nr 070716
Използвани символи
Вижте инструкцията за работа
Температура на съхранение
Използвайте с
Партиден код
Каталожен номер
Контрол
Ин витро диагностично медицинско изделие
Производител
Съдържание достатъчно за <n> теста
WASH
SOLN
CAL
0
CAL
N
CONTROL
CONC
Концентриран измиващ разтвор
Нулев калибратор
Калибратор #
Контрол #
N
Ag
125I
Ab
125I
Ag
125I
CONC
Концентриран маркер
Ab
125I
CONC
Концентриран маркер
INC
BUF
Трейсър
Трейсър
Епруветки
Инкубационен буфер
Ацетонитрил
ACETONITRILE
Серум
SERUM
DIL
SPE
Разредител за пробите
DIL
BUF
Буфер за разреждане
ANTISERUM
Антисерум
IMMUNOADSORBENT
Имуноабсорбент
DIL
CAL
Разредител за калибратора
REC
SOLN
Пресъздаващ разтвор
Полиетилен гликол
PEG
EXTR
SOLN
Екстрактов разтвор
ELU
SOLN
Разтвор за елюиране
Силикагелни пълнители
GEL
PRE
Пред-лечебен разтвор
SOLN
NEUTR
Неутрализиращ ратвор
SOLN
TRACEUR
Маркерен буфер
BUF
Микротитърна пластина
HRP конюгат / Конюгат на хрянова пероксидаза
Ab
HRP
Ag
HRP
Ab
HRP
CONC
HRP конюгиран концентрат
Ag
HRP
CONC
HRP конюгиран концентрат
CONJ
BUF
CHROM
TMB
CHROM
TMB
HRP конюгат / Конюгат на хрянова пероксидаза
Буфер за конюгата
CONC
Хромогенен TMB концентрат
Хромогенен TMB разтвор
Субстратен буфер
SUB
BUF
STOP
SOLN
Стоп разтвор
INC
SER
Инкубационен серум
Буфер
BUF
Ab
AP
SUB
PNPP
AP конюгат / конюгат на алкална фосфатаза
Субстрат PNPP / пара нитрофенил фосфат
BIOT
CONJ
CONC
Биотин конюгиран концентрат
AVID
HRP
CONC
Авидин HRP концентрат
ASS
BUF
Буфер за пробите
Ab
BIOT
Биотин конюгат
специфично антитяло
Ab
SAV
HRP
стрептавидин HRP концентрат
не специфично свързване
NSB
второ антитяло
2nd Ab
ACID
CONC
BUF
киселинизиращ буфер

hGH-EASIA

Transcript

Documenti analoghi

HGH Ref.No. - InterMedical, prodotti diagnostici

scheda di sicurezza - Thermo Fisher Scientific

HrP - UIFAT

per analisi di routine - X

alimenti sani e sicuri: linee guida per l`acquisto e la

Polyclonal Rabbit Anti-Human Growth Hormone Cod. A0570

determina dirigenziale

I ragazzi di Pireo

pratiche di gestione delle risorse umane, performance individuali e