Determinazione dello zinco nei capelli mediante spettroscopia di

A.A. 2013/2014
DISPENSE DEL CORSO
CHIMICA ANALITICA 2
(MODULO B)
corso di Laurea in Chimica
Gabriella Favaro
Valerio Di Marco
1
Determinazione degli acidi grassi in lipidi di origine naturale mediante
Gas-Cromatografia
I grassi (o lipidi) sono sostanze di origine vegetale o animale, e possono trovarsi allo stato
solido o liquido (oli). Sono insolubili in acqua e meno densi di essa. Dal punto di vista chimico
sono costituiti quasi esclusivamente da acidi grassi lineari esterificati (R = residuo alchilico) con la
glicerina (trigliceridi).
O
H2C
R1
O
O
HC
O
H2C
O
R2
R3
O
Gli acidi grassi possono essere sia saturi che insaturi e sono generalmente formati da catene
lineari con un numero pari di atomi di carbonio (da C4 fino a C26). I saturi più abbondanti sono
l’acido palmitico (C16) e l’acido stearico (C18), mentre gli insaturi più importanti sono l’acido
oleico (C18:1), l’acido linoleico (C18:2) e l’acido linolenico (C18:3).
Le molecole dei trigliceridi naturali sono di solito formate da due o tre acidi grassi diversi.
Quando un acido grasso supera il 60% del totale si hanno anche gliceridi costituiti da un unico
acido, come accade nell’olio di oliva che contiene circa il 50% di trioleato di glicerina (trioleina).
Alcuni acidi occupano posizioni preferenziali nei trigliceridi degli oli vegetali. In particolare,
gli acidi palmitico e stearico (entrambi saturi) occupano di preferenza le posizioni 1 e 3. Gli acidi
insaturi oleico e linoleico, invece, occupano di preferenza la posizione 2.
Diversamente dai prodotti naturali, nei trigliceridi di sintesi la posizione dei diversi acidi segue
una distribuzione di tipo statistico e ciò può evidenziare eventuali frodi. Nel caso dell’olio di oliva
si considera normale una percentuale di acido palmitico in posizione 2 che non superi il 2 %
nell'olio di sansa e d'oliva, e addirittura l'1.3 % nell'olio d'oliva vergine.
A seconda della provenienza del grasso la composizione dei trigliceridi è molto variabile. Di
conseguenza la determinazione della composizione acidica in campioni di olio, burro, margarina, ed
in prodotti contenenti frazioni significative di sostanza grassa (alimenti, cosmetici, farmaci, ecc.)
2
risulta essenziale per una loro caratterizzazione sia in termini di composizione che di qualità del
prodotto.
L’analisi degli acidi grassi può essere convenientemente eseguita per via gas-cromatografica,
sfruttando la volatilità dei loro esteri metilici che è maggiore sia degli acidi grassi liberi che degli
originali trigliceridi. Gli esteri metilici si ottengono per trans-esterificazione catalizzata dei
trigliceridi con metanolo, secondo la seguente reazione:
O
H2C
O
R1
O
H2C
OH
R1
O
CH3
O
CH3
O
HC
O
R2
HC
OH
H2C
OH
catalizzatore
H2C
O
R3
O
+
O
R2
O
R3
O
CH3
Analisi gas-cromatografica
Impostare o caricare il metodo di analisi (tra cui i valori di Tiniettore, Trivelatore, Tcolonna; i valori
normalmente impiegati con una colonna EC-WAX sono: Tiniettore = 230 – 250 °C, Trivelatore = 260 °C,
Tcolonna = 180 – 200 °C). Regolare il flusso del gas di trasporto a 14 psi (se necessario), e scegliere i
parametri di acquisizione ed integrazione del segnale.
La composizione qualitativa degli acidi grassi presenti nel campione si fa per confronto con
una miscela standard a composizione nota di esteri metilici degli acidi grassi; oppure, sulla base
delle proprietà della fase stazionaria, si può prevedere il seguente ordine di eluizione.
1) il tempo di ritenzione aumenta all’aumentare del numero di atomi di carbonio;
2) gli esteri insaturi escono dopo i corrispondenti esteri saturi;
3) il tempo di ritenzione degli esteri insaturi aumenta all’aumentare del numero di doppi
legami;
4) gli esteri ramificati escono prima degli esteri lineari con uguale numero di atomi di
carbonio;
In realtà con l’invecchiamento delle colonne i tempi di ritenzione possono cambiare e si possono
anche verificare delle inversioni nell’ordine di eluizione.
L’analisi quantitativa del campione di olio con rivelatore FID può essere eseguita in maniera
più semplice rispetto ad una generica analisi cromatografica, evitando la calibrazione. Infatti, l'olio
3
può essere considerato come costituito al 100 % da trigliceridi, cioè solo da componenti che
vengono rivelati in fase di analisi, e tali componenti presentano all'incirca lo stesso fattore di
risposta strumentale f rispetto alla massa di analita (f è la costante di proporzionalità tra area del
picco e concentrazione: A = f·C) utilizzando come rivelatore il FID. La concentrazione relativa
percentuale Ci (w/w %) di ogni componente si ricava dalla formula:
Ci 
Ai
 100
A
 i
dove le Ai sono le varie aree misurate durante la corsa del campione incognito. Tale metodo di
analisi è denominato normalizzazione interna. Un altro requisito per la validità della
normalizzazione interna è che tutti i componenti vengano eluiti (cioè la corsa cromatografica deve
essere sufficientemente lunga).
Per calcolare con maggiore accuratezza i valori di concentrazione relativa percentuale è
necessario calcolare i fattori di risposta fi di ciascun componente. Ciò viene fatto iniettando, prima
del campione incognito, una miscela di calibrazione avente un contenuto noto degli esteri in esame.
Dalla corsa di calibrazione si possono ricavare i valori di fi:
fi 
Ai
Ci
dove Ai è l'area del picco dell'estere i-esimo, e Ci è la sua concentrazione relativa percentuale (w/w
%) (valore dato dal produttore). Il valore di Ci per ciascun componente nel campione incognito si
ricava da:
Ai
fi
Ci 
A
 fi
i
dove Ai è l'area del picco dell'estere i-esimo nel campione incognito, ed fi è il fattore di risposta
calcolato dalla miscela di calibrazione.
4
Procedimento sperimentale
Reagenti, frasi di rischio e di sicurezza

acido solforico al 98 % (C, R35, S26, S30, S45)

metanolo (F, T, R11, R23/24/25, R39/23/24/25, S7, S16, S36/37, S45)

n- pentano (F+, Xn, N, R12, R51/53, R65, R66, R67, S9, S16, S29, S33, S61, S62)
oppure n-esano (F+, Xn, N, R11, R38, R48/20, R51/53, R62, R65, R67, S9, S16, S29, S33,
S36/37, S61, S62)
oppure etere di petrolio (p. eb.40 – 60 °C) (F+, Xn, N, R11, R51/53, R65, R67, S61, S62)

standard singoli o in miscela dei principali esteri metilici degli acidi grassi (Xi, R36/37/38, S26,
S36)

carbonato di sodio (Xi, R36, S22, S26)

solfato di sodio anidro (-)
oppure solfato di magnesio anidro (S22, S24/25)
Attrezzatura

gas-cromatografo equipaggiato con colonna capillare polare, per esempio EC-WAX (30 m)
e rivelatore FID

integratore o computer

bagno riscaldante

fiala da 20 mL munita di setto rivestito in teflon e ghiera in allumino (con cup crimper)

pipetta graduata da 1 mL

pipetta tarata da 2 mL

pipetta tarata da 5 mL

pipetta Pasteur con tettarella

siringa da GC da 5 µL

spatolina in acciaio

6 matracci da 2 o 5 mL
Procedimento
1.
Introdurre nella fiala circa 0.5 g di campione di olio;
2.
Aggiungere 2 mL di metanolo e 80 L di acido solforico concentrato (98 %) utilizzando una
pipetta graduata da 1.0 mL. NB. Seguire questo ordine di aggiunta dei reagenti. L’acido
solforico va introdotto con cautela perché la sua solvatazione è fortemente esotermica.
3.
Chiudere con setto e ghiera la fiala;
5
4.
Indossando occhiali protettivi porre la fiala in un bagno termostatico alla temperatura di 80
°C per 40 minuti;
5.
Nel frattempo preparare una soluzione sciogliendo la minima quantità possibile per ogni
estere metilico a disposizione in n-esano, e successivamente una soluzione contenente una
miscela di questi, utilizzando dei matracci da 2 o 5 mL od una fiala con tappo, di volume
opportuno; se invece è disponibile una miscela standard commerciale, diluirla
opportunamente prima di iniettarla;
6.
Tenendo conto che la fiala è calda, raffreddare a temperatura ambiente con acqua corrente,
dopo aver tolto il sostegno metallico;
7.
Aprire la fiala e introdurre 5 mL di n-esano;
8.
Agitare bene in modo da estrarre completamente gli esteri metilici nella fase organica (strato
superiore) e poi separare la fase organica (per esempio con una Pasteur) e conservarla a
parte; se la soluzione è appena torbida (per la presenza di acido solforico), aggiungere del
carbonato di sodio e agitare fino al termine dell’effervescenza; aggiungere poi del solfato di
sodio o di magnesio anidro per eliminare l’acqua residua;
9.
Iniettare i singoli standard, 0.1 L, e poi la miscela di questi, verificando la sequenza di
uscita;
10.
Se tutti i picchi risultano separati procedere col campione, altrimenti modificare le condizioni
di separazione (T della colonna od eventuale rampa di temperatura);
11.
Iniettare 0.1 L di campione (fase organica) nel gas-cromatografo nelle condizioni scelte, 2 o
3 volte.
Elaborazione dati
Dai cromatogrammi ricavare una tabella con i componenti e i relativi tempi di ritenzione e aree.
Calcolare le concentrazioni relative col metodo della normalizzazione interna. Dare valore medio
con incertezza se il campione è stato analizzato più volte. Ottenere una seconda serie di
concentrazioni relative e deviazioni standard tenendo conto dei fattori di risposta; riportare i fattori
di risposta normalizzati, cioè ponendo uguale ad 1 il fattore di risposta del primo componente che
eluisce.
Riportare nella relazione un cromatogramma della miscela degli standard ed un
cromatogramma del campione.
6
Determinazione della caffeina in caffè, tè, Coca-Cola e farmaci analgesici
tramite HPLC con rivelazione spettrofotometrica nell'UV
La presente esperienza prevede l’uso della cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) per
determinare la concentrazione della caffeina in bevande o analgesici, come per esempio nel caffè,
nel tè, nella Coca-Cola, ecc.. Il metodo tradizionale per la determinazione della caffeina prevede
un’estrazione dal campione e determinazione mediante spettrofotometria UV-Vis. L’uso dell’HPLC
permette una veloce e facile separazione della caffeina da altre sostanze come acido tannico, acido
caffeico e saccarosio, normalmente presenti nei campioni considerati. La procedura qui suggerita
prevede di analizzare direttamente il campione di interesse e di determinare il contenuto di caffeina
mediante una calibrazione esterna.
O
H3C
O
N
N
N
CH3
N
CH3
Caffeina
Procedimento sperimentale
Reagenti, frasi di rischio e di sicurezza

caffeina  98% (Xn, S22)

metanolo (F, T, R11, R23/24/25, R39/23/24/25, S7, S16, S36/37, S45)

acido fosforico (C, R34, S26, S45)

campioni da analizzare (uno o più): caffè, tè, Coca-Cola, farmaci analgesici contenenti caffeina.
Strumentazione e attrezzatura

cromatografo per HPLC con rivelatore spettrofotometrico UV-VIS

colonna analitica a fase inversa C18, 250x4.6 mm i.d., 5 µm

vetrino da orologio piccolo
7

spatolina

imbuto

spruzzetta

propipette

1 matraccio da 100 mL

7 matracci tarati da 25 mL

micropipette a volume variabile

2 cilindri da 500 o 1000 mL per preparare l’eluente

una bottiglia di vetro da 1000 mL per l’eluente
Procedimento
1.
Preparare, servendosi di cilindri tarati e di una bottiglia in vetro da litro, una quantità di
eluente sufficiente per utilizzarlo sia come eluente che come solvente per le soluzioni
standard e del campione (0.5÷1 L). La miscela deve contenere metanolo/acqua 40/60 v/v
(solventi per HPLC ad elevata purezza e acqua milliQ) e deve essere acidificata con 1
goccia/L di acido fosforico.
2.
Preparare 100 mL di soluzione madre standard di caffeina da 1000 ppm (mg/L), sciolta in
metanolo (sufficiente per 2 gruppi); se si scioglie con difficoltà utilizzare il bagno ad
ultrasuoni con cautela (inserire per pochi secondi di seguito, per evitare
surriscaldamento del metanolo).
3.
In 5 matracci tarati da 25 mL (o 50 mL) preparare soluzioni a concentrazione 1.0, 5.0, 10.0,
20.0, 50.0 ppm di caffeina in eluente, utilizzando una micropipetta e relativi puntali, o una
pipetta di vetro graduata.
4.
Accendere i vari moduli del cromatografo ed il computer.
5.
Impostare una velocità di flusso di 1.0 mL/min (0.6 mL/min per una colonna con particelle
da 3 m, strumento verso la finestra) raggiungendo gradualmente tale valore. Accendere il
rivelatore e impostare una  = 270 nm (massimo di assorbimento della caffeina).
6.
Fare stabilizzare il segnale di fondo lasciando fluire l’eluente per almeno una decina di
minuti per l’equilibrazione della colonna e la stabilizzazione della lampada.
7.
Avvinare 3 volte la siringa di iniezione con la soluzione da iniettare. Iniziare con il bianco
(eluente) e poi procedere con la soluzione standard più diluita e via via con quelle più
concentrate.
8.
Introdurre la siringa nell’apposito alloggiamento dell’iniettore e riempire il «loop». Per
lavarlo al meglio inserire un volume di almeno 3 volte il loop, in modo da riempire anche i
8
tubi di collegamento. Assicurandosi di essere nella posizione «LOAD».
9.
Commutare la valvola di iniezione nella posizione «INJECT» attivando simultaneamente
l’integratore o il computer.
10.
Ripetere l’iniezione dello stesso standard per tre volte, e riportare i valori delle tre aree
corrispondenti in grafico in funzione della concentrazione. Si faccia lo stesso per le rimanenti
soluzioni standard.
11.
Analizzare con la stessa procedura i campioni incogniti (trattati e/o diluiti come indicato
nella sezione seguente).
Preparazione dei campioni di caffeina da caffè, tè e Coca Cola
–
Per il caffè (bevanda) si suggerisce di diluire il campione 1:100 o 1:200 v/v con l'eluente.
–
Per il caffé macinato si trattano 2 g con 20 mL di CH2Cl2 a ricadere per 2 ore. L’estratto viene
filtrato, portato a secchezza in evaporatore rotante (dotato di trappola per il recupero del
solvente) e ripreso in metanolo. La soluzione (eventualmente diluita con acqua) viene iniettata
direttamente. (N.B. l’estrazione con acqua calda (caffettiera) è più efficiente).Per il tè si
suggerisce di diluire il campione 1:25 v/v.
–
Per la Coca-Cola si deve prima degassare in bagnetto ad ultrasuoni, e poi si suggerisce di
diluire 2:25 la bevanda degassata.
–
Per i farmaci, l’estrazione della caffeina si ottiene macinando la compressa in mortaio,
trasferendo il tutto in beuta e trattando con 50 mL di metanolo (eventualmente portare in bagno
ad ultrasuoni per 10 min). Si filtra su carta e si raccogliere la soluzione in matraccio da 100
mL. Si lava il filtro con metanolo e si porta a volume. La soluzione può essere iniettata tal
quale o eventualmente diluita con acqua (previa filtrazione).
–
Le diluizioni suggerite per le bevande sono indicative, dato che i campioni commerciali
possono variare da uno all’altro.
–
Tutti i campioni incogniti vanno filtrati su filtro da siringa in materiale inerte prima
dell’analisi.
–
Si inietti il campione incognito per 3-5 volte.
Elaborazione dati
Costruire la retta di calibrazione e riportarne i parametri richiesti (cfr. dispense statistica).
Determinare il contenuto di caffeina nel campione per interpolazione sulla retta di taratura.
Tenendo conto della diluizione riportare il valore finale con il suo intervallo di confidenza.
Nella relazione inserire un cromatogramma degli standard ed uno del campione.
9
Determinazione di anioni inorganici presenti in acque potabili tramite
cromatografia ionica e rivelazione conduttimetrica soppressa
Questa esperienza vuole introdurre lo studente alla cromatografia ionica (IC). Questa tecnica
riveste oggi un ruolo estremamente importante in quanto con essa è stato possibile determinare
specie non facilmente analizzabili per altra via come ad esempio gli ioni solfato, ammonio,
fluoruro, e fosfato. La grande versatilità della tecnica è data sia dall’odierna tecnologia delle resine
a scambio ionico che dalla possibilità di utilizzare la tecnica conduttimetrica per la rivelazione degli
analiti. Quest’ultima circostanza è dovuta alla possibilità di sopprimere la conducibilità del fondo
dovuta all’eluente utilizzato, aumentando nel contempo la conducibilità e quindi il segnale degli
analiti.
In questa esperienza la IC viene usata per la quantificazione degli anioni inorganici presenti
nell’acqua potabile (o in un’acqua oligominerale o in un acqua di scarico, in quest’ultimo caso
previa filtrazione ed eventuale diluizione) ed in particolare di Cl–, NO3–, PO43– e SO42–, per mezzo
di una calibrazione esterna.
Procedimento sperimentale
Reagenti, frasi di rischio e di sicurezza

carbonato di sodio (Xi, R36, S22, S26)

bicarbonato di sodio (-)

acido solforico (C, R35, S26, S30, S45)

cloruro di sodio (-)

nitrato di sodio (O, Xn, R8, R22, R36/37/38, S17, S26, S27, S36/37/39)

fosfato biacido di potassio (S22, S24/25)

solfato di sodio (-)
Strumentazione e attrezzatura

cromatografo ionico (inerte) dotato di rivelatore conduttimetrico

colonna analitica anionica DIONEX AS4A-SC 250x4 mm con precolonna AG4A-SC 50x4
mm o AS22 250x4 mm con precolonna AG22 50x4 mm

soppressore anionico a micromembrana DIONEX ASRS ULTRA II 4 mm, o AMMS 300
4mm

2 spatoline
10

2 vetrini da orologio

4 imbuti

2 propipette

1 matraccio tarato da 1000 mL per l’acido solforico per il soppressore, se necessario

1 matraccio tarato da 1000 mL per l’eluente

4 matracci tarati da 100 mL

5 matracci tarati da 25 mL

4 pipette graduate da 1 mL, 4 pipette graduate da 2 mL
oppure micropipette a volume variabile e relativi puntali
Procedimento
1. Utilizzando i matracci tarati da 100 mL preparare quattro soluzioni madre contenenti 1000 ppm
(mg/L di ione, non di sale!) rispettivamente di Cl–, NO3–, PO43– e SO42–; utilizzare i rispettivi
sali disponibili come standard primari, e diluire con acqua milliQ.
2. Se non disponibile, preparare la soluzione eluente costituita da una miscela di
carbonato/bicarbonato di sodio rispettivamente 1.8/1.7 mM per una colonna AS4A-SC ed
invece 4.5/1.4 mM per una colonna AS22 (ICS900). Tale soluzione va preparata in acqua
milliQ.
3. Se il soppressore non è di tipo elettrochimico, preparare una soluzione di H2SO4 25 mM per la
rigenerazione della membrana di soppressione (ICS900).
4. In 5 matracci tarati da 25 mL preparare le soluzioni standard miste contenenti tutti gli anioni,
rispettivamente in concentrazione:
Cl– (ppm)
NO3– (ppm)
PO43– (ppm)
SO42– (ppm)
soluzione 1
1
1
1
1
soluzione 2
5
5
2
2
soluzione 3
10
10
5
5
soluzione 4
20
20
10
10
soluzione 5
50
50
20
20
portando a volume con acqua milliQ.
5. Accendere il cromatografo e tutti i suoi moduli, innescare la pompa (PRIME/PURGE);
impostare una velocità di flusso di 1.5 mL/min per lo strumento di DX ed invece 1.2 mL/min
per l’ICS900, ed azionare la pompa stessa;
11
-
subito dopo avviare la rigenerazione del soppressore impostando un valore di corrente di 50
mA per il soppressore elettrochimico (strumento a DX);
Fare stabilizzare il segnale di fondo, lasciando fluire l’eluente per almeno una decina di minuti
(conducibilità di fondo minore di 25 S).
6. Accendere il computer e caricare il software di gestione dei dati (Chromeleon a SX e PeakNet a
DX); creare una propria cartella (per esempio gruppo_1) nella directory opportuna.
7. Avvinare 3 volte la siringa di iniezione con la soluzione da iniettare. Si inizi con il bianco
(acqua milliQ) e si proceda con la soluzione standard più diluita.
8. Introdotta la siringa nell’apposito alloggiamento dell’iniettore si riempia il «loop» (inserire
almeno 3 volte il suo volume) assicurandosi di essere nella posizione LOAD.
9. ICS900 (a SX): scegliere o costruire un metodo con le condizioni cromatografiche, un metodo
di quantificazione e preparare una sequenza di iniezioni;
far partire la corsa e attivare l’acquisizione, premendo il tasto BATCH/START
Software PeakNet (a DX): aprire e caricare il metodo ISOCRATICASTUDENTI2 e premere
RUN/START; nominare il campione o lo standard in modo riconoscibile e progressivo, anche
nella seconda riga dove compare la directory (ad esempio std1a) e premere OK;
in entrambi i casi la valvola verrà commutata automaticamente.
10. Lasciare eluire i picchi e poi ripetere l’iniezione dello stesso standard per altre 2 volte.
11. Costruire una tabella riportando le aree dei picchi di ogni ione per i diversi livelli di
concentrazione.
12. Analizzare con la stessa procedura i campioni incogniti preoccupandosi di filtrare, se richiesto,
la soluzione (acque di scarico o superficiali).
Elaborazione dati
Costruire le rette di calibrazione per ciascun ione, riportando i singoli punti; per ciascuna
retta riportare i parametri richiesti (cfr. dispense statistica).
Determinare il contenuto di ogni ione nel campione per interpolazione sulla retta di
calibrazione. Riportare i valori finali con il loro intervallo di confidenza.
Nella relazione inserire come esempio almeno un cromatogramma del campione e uno delle
soluzioni standard.
Condurre dei test statistici di confronto tra ciascun valore trovato e quello tabulato (se
disponibile) o riportato in etichetta.
12
Determinazione di cationi inorganici in acque potabili tramite cromatografia
ionica e rivelazione conduttimetrica soppressa
Questa esperienza vuole introdurre lo studente alla cromatografia ionica (IC). Questa tecnica
riveste oggi un ruolo estremamente importante, grazie sia all’odierna tecnologia delle resine a
scambio ionico, che alla possibilità di utilizzare la tecnica conduttimetrica per la rivelazione degli
analiti. Quest’ultima circostanza dipende dalla possibilità di sopprimere la conducibilità di fondo
dovuta all’eluente utilizzato, ma non quella degli analiti, il cui segnale viene anzi aumentato.
In questa esperienza la IC viene usata per la quantificazione dei cationi inorganici presenti
nell’acqua potabile (o in un’acqua oligominerale o in un acqua di scarico, in quest’ultimo caso
previa filtrazione ed eventuale diluizione) ed in particolare di Ca2+, Mg2+, Na+ e K+ (NH4+ dovrebbe
essere assente) per mezzo di una calibrazione esterna.
Procedimento sperimentale
Strumentazione e attrezzatura

cromatografo ionico (inerte) dotato di rivelatore conduttimetrico

colonna analitica cationica DIONEX CS12A 250x4 mm con precolonna CG12A 50x4 mm

soppressore cationico a micromembrana DIONEX CMMS III 4 mm, o CSRS ULTRA 4
mm

2 spatoline

2 vetrini da orologio

4 imbuti

2 propipette

1 matraccio tarato da 1000 mL per l’idrossido di tetrabutilammonio per il soppressore, se
necessario (con CMMS III)

1 matraccio tarato da 1000 mL per l’eluente

4 matracci tarati da 100 mL

5 matracci tarati da 25 mL

4 pipette graduate da 1 mL

4 pipette graduate da 2 mL
oppure micropipette a volume variabile e relativi puntali
13
Reagenti, frasi di rischio e di sicurezza

acido metansolfonico (C, R34, S26, S36, S45) o acido solforico (C, R35, S26, S30, S45)

idrossido di tetrabutilammonio (C, R34; S26, S36/37/39, S45))

cloruro di sodio (-)

cloruro di potassio (S22, S24/25)

cloruro di calcio (Xi, R36, S22, S24)

cloruro di magnesio (S22, S24/25)

cloruro di ammonio (Xn, R22; R36, S22))
Procedimento
1. Se non disponibile, preparare la soluzione eluente costituita da acido metansolfonico 20 mM
(o, in alternativa, H2SO4 11 mM) in acqua milliQ, per una colonna CS12A.
2. Se il soppressore non è di tipo elettrochimico, preparare una soluzione idrossido di
tetrabutilammonio 100 mM per la rigenerazione della membrana di soppressione (ICS900).
3. Utilizzando i matracci tarati da 100 mL preparare quattro soluzioni madre contenenti 1000
ppm (mg/L di ione, non di sale!) di ciascun catione, ottenute da NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2
(NH4Cl) per analisi, essiccati in stufa (oppure soluzioni standard commerciali), in acqua
milliQ.
4. In 5 matracci tarati da 25 mL preparare le soluzioni standard miste contenenti tutti i cationi,
aventi la concentrazione data in tabella, e portando a volume con acqua milliQ.
Na+ (ppm)
K+ (ppm)
Mg2+ (ppm)
Ca2+ (ppm)
soluzione 1
0.1
0.1
1
5
soluzione 2
1
1
5
10
soluzione 3
5
5
10
20
soluzione 4
10
10
20
50
soluzione 5
20
20
50
100
5. Accendere il cromatografo e tutti i suoi moduli, innescare la pompa (PRIME/PURGE);
impostare una velocità di flusso di 1.2 mL/min ed azionare la pompa stessa;
6. subito dopo avviare la rigenerazione del soppressore impostando un valore di corrente di 50
mA per il soppressore elettrochimico (strumento a DX);
7. Fare stabilizzare il segnale di fondo, lasciando fluire l’eluente per almeno una decina di
minuti (conducibilità di fondo minore di 1-2 S).
14
8. Accendere il computer e caricare il software di gestione dei dati (Chromeleon a SX e
PeakNet a DX); creare una propria cartella (per esempio gruppo_1) nella directory
opportuna.
9. Avvinare 3 volte la siringa di iniezione con la soluzione da iniettare. Si inizi con il bianco
(acqua milliQ) e si proceda con la soluzione standard più diluita.
10. Introdotta la siringa nell’apposito alloggiamento dell’iniettore si riempia il «loop» (inserire
almeno 3 volte il suo volume) assicurandosi di essere nella posizione LOAD.
11. ICS900 (a SX): scegliere o costruire un metodo con le condizioni cromatografiche, un
metodo di quantificazione e preparare una sequenza di iniezioni;
12. far partire la corsa e attivare l’acquisizione, premendo il tasto BATCH/START
13. Software PeakNet (a DX): aprire e caricare il metodo CATIONI_2010_2011 e premere
RUN/START; nominare il campione o lo standard in modo riconoscibile e progressivo,
anche nella seconda riga dove compare la directory (ad esempio std1a) e premere OK;
14. in entrambi i casi la valvola verrà commutata automaticamente.
15. Lasciare eluire i picchi e poi ripetere l’iniezione dello stesso standard per altre 2 volte.
16. Costruire una tabella riportando le aree dei picchi di ogni ione per i diversi livelli di
concentrazione.
17. Analizzare con la stessa procedura i campioni incogniti preoccupandosi di filtrare, se
richiesto, la soluzione (acque di scarico o superficiali).
Elaborazione dati
Costruire le rette di calibrazione per ciascun ione, riportando i singoli punti; per ciascuna
retta riportare i parametri richiesti (cfr. dispense statistica).
Determinare il contenuto di ogni ione nel campione per interpolazione sulla retta di
calibrazione. Riportare i valori finali con il loro intervallo di confidenza.
Nella relazione inserire come esempio almeno un cromatogramma del campione e uno delle
soluzioni standard.
Condurre dei test statistici di confronto tra ciascun valore trovato e quello tabulato (se
disponibile) o riportato in etichetta.
15
METODO UFFICIALE DI DOSAGGIO DEL FOSFATO SOLUBILE NELLE ACQUE
D-011 marzo 1981
Il fosforo nelle acque naturali e di scarico è presente quasi esclusivamente come fosfato, in
particolare ortofosfato, fosfato condensato (piro-, meta-, polifosfato) e fosfato legato a composti
organici. Queste specie possono trovarsi in forma solubile o non solubile. Non si può comunque
escludere la presenza di composti del fosforo con più basso numero di ossidazione.
Nella determinazione del fosforo totale è necessario trasformarlo tutto in ortofosfato. Ciò viene
effettuato con un attacco ossidante per i composti organici e per quelli in cui il fosforo è presente
con numero di ossidazione inferiore a +5, e con idrolisi acida per i polifosfati.
Il metodo spettrofotometrico al blu di molibdeno descritto di seguito viene utilizzato per la
determinazione dell'ortofosfato solubile e del fosforo totale.
Determinazione dell'ortofosfato solubile
Principio del metodo
Il metodo prevede la reazione degli ioni PO43– con il molibdato di ammonio
((NH4)6Mo7O24·4H2O) e il tartrato di ossido di antimonio e potassio (K(SbO)C4H4O6·1/2 H2O) in
ambiente acido per formare un etero poliacido che viene ridotto a blu di molibdeno con acido
ascorbico.
Il metodo è applicabile alle acque naturali (anche di mare) e può essere impiegato in un
intervallo di concentrazioni compreso tra 0.03 e 0.3 mg/L di fosforo (come P).
Interferenze
Il Cu(II) e il Fe(III) non interferiscono se presenti in quantità rispettivamente inferiori a 10 e 50
ppm (mg/L). Gli arseniati interferiscono in quanto danno la stessa reazione dei fosfati. Il Cr(VI) e i
nitriti danno interferenza negativa dell'ordine del 3 % se presenti in concentrazione superiore a
1 mg/L. Solfuri e composti del silicio non interferiscono se presenti in concentrazioni inferiori a 1.0
e 10.0 ppm (rispettivamente mg/L di S e SiO2).
16
Parte sperimentale
Reagenti, frasi di rischio e di sicurezza

eptamolibdato di esammonio tetraidrato ((NH4)6Mo7O24·4H2O) (Xi, R36/37/38, S26)

acido solforico (C, R35, S26, S30, S45)

acido ascorbico (C6H8O6) (-)

tartrato di ossido di antimonio e potassio (K(SbO)C4H4O6·1/2 H2O) (Xn, N, R20/22,
R51/53, S61)

diidrogenofosfato di potassio anidro (KH2PO4, standard primario) seccato a 105°C (-)
Attrezzatura

spettrofotometro UV-Visibile

cuvette di vetro da 1 cm

bilancia analitica

bilancia tecnica

vetrini da orologio

pinza e spatolina

imbuto

1 bottiglia di polietilene da 500 mL

1 bottiglia di polietilene da 250 mL

bottiglia da 500 mL

bottiglia da 1 L

bottiglia scura da 1 L (250 mL)

pipetta tarata da 10.0 mL

9 matracci da 100 mL
Di seguito sono riportate le istruzioni per preparare la quantità minima di reagenti necessari per
entrambi i gruppi di laboratorio.
Soluzione di molibdato d'ammonio
Si sciolgono 3 g di eptamolibdato di esammonio tetraidrato in 100 mL di acqua MilliQ (la
soluzione, conservata in bottiglie di polietilene al riparo dalla luce, è stabile per molti mesi).
Soluzione di acido solforico
Si versano cautamente sotto cappa 35 mL di H2SO4 concentrato in 220 mL di acqua MilliQ
(per 1 L: 140 mL di H2SO4 conc. in 900 mL di acqua) in bottiglia di vetro.
Soluzione di acido ascorbico
17
Si sciolgono 5.4 g di acido ascorbico in 100 mL di acqua MilliQ (la soluzione conservata in
frigorifero in bottiglie di polietilene è stabile per molti mesi, mentre a temperatura ambiente si
conserva per due o tre giorni).
Soluzione di tartrato di ossido di antimonio e potassio
Si sciolgono 67 mg di tartrato di ossido di antimonio e potassio in 50 mL di acqua MilliQ,
scaldando se è necessario.
Reagente misto
Si mescolano: 100 mL della soluzione di molibdato d'ammonio
250 mL di soluzione di acido solforico
100 mL di soluzione di acido ascorbico
50 mL di soluzione di tartrato di antimonio e potassio
in bottiglia di plastica.
Il reagente misto, preparato al momento dell'uso, non può essere conservato per più di 6 ore,
per cui va eliminato alla fine dell’esperienza.
Soluzione standard di fosforo
Si sciolgono 0.1075 g di diidrogenofosfato di potassio anidro in acqua milliQ e si diluisce a 250
mL in matraccio tarato (soluzione contenente 300 ppm (mg/L) di PO43–). Annotare la quantità esatta
pesata e calcolare la concentrazione esatta (Se si conserva la soluzione bisogna trasferirla in
bottiglia scura).
Si prepara una soluzione diluita prelevando 10.0 mL della soluzione concentrata e diluendo a
100 mL con acqua MilliQ in matraccio (concentrazione 30 ppm, cioè 30 mg/L di PO43–).
Procedimento
1.
In 7 matracci da 100 mL si introducono con una pipetta o una micropipetta a volume variabile,
rispettivamente 0.0 (per il bianco), 0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 mL di soluzione standard diluita di
fosfato. Si aggiunge a ciascun matraccio acqua milliQ e 10.0 mL del reagente misto,
mescolando, e si porta a volume. Appena preparato il bianco, azzerare lo strumento.
2.
Azzerare lo strumento ponendo il bianco in entrambe le celle.
3.
Misurare l'assorbanza del bianco ad una “ fissa” pari a 885 nm usando come riferimento
acqua milliQ. L'assorbanza del bianco non deve superare 0.005. Se il valore fosse più alto si
dovranno controllare i reattivi ed in particolare il molibdato di ammonio.
4.
Misurare l'assorbanza di ogni soluzione ad una “ fissa” pari a 885 nm (a 710 nm si ottengono
valori di assorbanza del 20 % circa), usando come riferimento la soluzione del bianco. La
18
misura di assorbanza per ogni soluzione va fatta dopo i 10 e non oltre i 15 minuti successivi
alla preparazione della soluzione stessa.
5.
Effettuare in modo analogo la misura del campione (vedere pagina successiva).
6.
Per seguire la cinetica di reazione, scegliere l’opzione “cinetica” e, dopo aver impostato la 
di misura e aver azzerato l’assorbanza col bianco, inserire una cuvetta contenente 3 mL di acqua
milliQ, 300 L di reagente misto e 30 L di soluzione standard di fosfato diluita, mescolare
rapidamente in situ e registrare l’assorbanza nel tempo fino a che rimane costante per
qualche minuto.
Elaborazione dati
Si costruisce la retta di calibrazione ponendo in diagramma i valori di assorbanza letti in
funzione della concentrazione delle soluzioni. Riportare i parametri richiesti per tale retta (cfr.
dispense statistica).
19
DETERMINAZIONE DELL'ACIDO FOSFORICO
NELLA COCA-COLA
La determinazione dell’acido fosforico nella Coca-Cola si può effettuare con lo stesso metodo
utilizzato per la determinazione del fosfato nelle acque. In alternativa si può analizzare un campione
incognito fornito dal docente.
Procedimento
1.
Degassare preventivamente il campione di Coca-Cola in bagnetto ad ultrasuoni (o, in
alternativa lasciato all'aria per 24 ore).
2.
Diluire 200 L di Coca-Cola a 100.0 mL in matraccio tarato.
3.
Introdurre in un matraccio da 100 mL 10.0 mL di reagente misto e portare a volume col
campione degassato e diluito. Leggere l'assorbanza a 885 nm dopo i 10 e non oltre i 15 minuti
successivi alla preparazione della soluzione stessa.
4.
Preparare un bianco campione (soluzione preparata come al punto precedente, ma ponendo 10
mL di acqua anziché di reagente misto), leggere la sua assorbanza, e sottrarre questo valore a
quello del campione.
5.
Nel caso di un campione di acqua a contenuto incognito di fosfato, in matraccio da 100 mL,
aggiungere direttamente 10 mL di ragente misto e portare a volume con acqua milliQ. Leggere
l'assorbanza a 885 nm dopo i 10 e non oltre i 15 minuti successivi alla preparazione della
soluzione stessa.
6.
Per verificare l’effetto dell’interferenza, preparare in un altro matraccio il campione con la
stessa modalità vista sopra ma aggiungendo, prima di portare a volume, 2 mL di soluzione di
NaNO2 alla concentrazione di 100 ppm (interferenza negativa) o 2 mL di soluzione di silice
(come metasilicato, Na2SiO3) alla concentrazione di 3500 ppm (interferenza positiva).
Elaborazione dati
Il valore di concentrazione incognita di fosfato si ricava per interpolazione sulla retta di
calibrazione precedentemente costruita, e successivo calcolo della eventuale diluizione effettuata.
Fornire il dato finale con il suo intervallo di confidenza.
Confrontare (t-test) la concentrazione ottenuta con quella teorica di acido fosforico nella Coca
Cola (informazione reperibile in rete).
Quantificare l’effetto dell’interferenza con un opportuno test statistico.
20
Determinazione dello zinco nei capelli mediante spettroscopia di assorbimento
atomico in fiamma
I capelli sono costituiti principalmente da cheratina, una proteina che contiene il 14% di zolfo.
Inoltre, nei capelli sono presenti vari elementi in tracce (Mg, Al, Cl, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Cu, Zn,
etc.). La quantità di questi elementi varia durante la crescita dei capelli e dipende dal tipo di
alimentazione. Lo zinco è presente nel corpo umano in combinazione con enzimi e con diverse
proteine. Il suo contenuto normale nei capelli, che è di circa 150-200 ppm (g/g), dipende da diversi
fattori quali età, sesso, colore, clima, lunghezza, zona del prelievo, uso di shampoo antiforfora ecc..
Lo zinco assunto con il cibo è normalmente sufficiente al fabbisogno dell’organismo umano. Una
sua concentrazione troppo bassa può causare disturbi quali ad esempio stanchezza e difficoltà di
apprendimento.
L’esperienza ha come oggetto la determinazione della quantità di zinco nei capelli mediante
misure di spettroscopia di assorbimento atomico in fiamma. A tale scopo, i capelli dovranno essere
portati in soluzione con acido nitrico (HNO3) e acido perclorico (HClO4) e la concentrazione di
zinco verrà determinata mediante confronto con una retta di taratura e con il metodo delle aggiunte
standard. L’intervallo di linearità è compreso tra 0.05 e 1.5 ppm.
Parte sperimentale
Reagenti, frasi di rischio e di sicurezza

acido nitrico al 65 % per spettrofotometria (C, R35, S23, S26, S36, S45)

acido perclorico al 65 % per spettrofotometria (O, C, R5, R8, R35, S23, S26, S36, S45)

soluzione standard concentrata di Zn2+ (circa 1000 ppm di ione - il valore esatto è riportato
sull'etichetta) (Xi, R36/38, S26)
Apparecchiature

spettrofotometro per assorbimento atomico (AAS)

lampada a catodo cavo per lo Zn

capsula di porcellana

pipetta tarata da 10 mL

micropipetta da 1000 µL
21

1 matraccio tarato da 100 mL

6 matracci tarati da 25 mL

filtro da siringa inerte

siringa di plastica da 5 mL

pipetta graduata da 2 mL o micropipetta a volume variabile
Procedimento per la costruzione della retta di taratura
1. Preparare in matraccio da 25 mL una soluzione standard diluita da 25 ppm (mg/L) di ione Zn2+
partendo dalla soluzione standard madre.
2. Preparare 5 soluzioni standard a concentrazione di 0.25, 0.50, 0.75, 1.00 e 1.50 ppm
rispettivamente in 5 matracci tarati da 25 mL per diluizione con acqua distillata di volumi
appropriati della soluzione a 25 ppm.
3. Ottimizzare le condizioni strumentali alla lunghezza d’onda di lavoro di 213.9 nm secondo le
specifiche riportate nelle apposite tabelle (allineamento della lampada ed eventualmente
aggiustamento del flusso di soluzione in fiamma).
4. Azzerare lo strumento con acqua milliQ prima di ogni misura.
5. Fare tre letture del valore di assorbanza per ogni soluzione (15 letture in totale).
6. Tracciare la retta di calibrazione esterna ricavata con il metodo dei minimi quadrati utilizzando
tutte le quindici letture (riportare i dati richiesti - cfr. dispensa di statistica - per la retta di
calibrazione).
Trattamento del campione
1. Pesare circa 0.3 g di capelli puliti e tagliati alla radice e sminuzzarli.
2. Trasferire i capelli in una capsula di porcellana e, indossando guanti ed occhiali, aggiungere
10 mL di HNO3 concentrato, sotto cappa.
3. Scaldare blandamente in bagno a sabbia, fino a dimezzare all’incirca il volume iniziale.
4. Lasciare raffreddare e aggiungere quindi 2 mL di HClO4, sempre sotto cappa.
5. Scaldare fino a disgregazione completa dei capelli e fino ad ottenere un volume finale di circa 2
mL di soluzione.
6. Raffreddare e trasferire quantitativamente la soluzione in un matraccio tarato da 100 mL.
Portare a volume con acqua milliQ.
7. Filtrare con estrema cautela il campione con un filtro resistente agli acidi, appoggiando il filtro
sulla bocca del matraccio ed indossando occhiali e guanti, data la possibilità di schizzi e dato
che bisogna esercitare una certa forza sul pistone della siringa.
22
8. Azzerare lo strumento con acqua distillata e fare quindi tre letture del valore di assorbanza della
soluzione.
9. Calcolare il valore medio e ricavare la concentrazione di zinco presente nei 100 mL di
soluzione per estrapolazione dalla retta di calibrazione esterna. Se la concentrazione risulta
fuori dell’intervallo di concentrazione utilizzato per la calibrazione, procedere ad una adeguata
diluizione.
10. Fornire il dato finale in termini di g di zinco per g di capelli, con il suo intervallo di
confidenza.
Metodo delle aggiunte standard
1.
Trasferire in 5 matracci tarati da 25 mL, numerati da 1 a 5, 10 mL di soluzione del campione di
capelli.
2.
Aggiungere ai matracci 1, 2, 3, 4 e 5 rispettivamente 0, 0.25, 0.5, 0.75 e 1.00 mL di soluzione
diluita di zinco (da 25 ppm).
3.
Portare a volume con acqua milliQ.
4.
Dopo azzeramento con acqua milliQ, effettuare tre misure di assorbanza per ogni campione.
5.
Tracciare la retta assorbanza contro concentrazione di zinco aggiunta con il metodo dei minimi
quadrati (riportare i dati richiesti - cfr. dispensa di statistica - per la retta di calibrazione).
6.
Determinare la concentrazione di zinco presente nella soluzione proveniente dal trattamento dei
capelli dalla retta di calibrazione per estrapolazione al valore di assorbanza nulla.
7.
Calcolare il contenuto in zinco nel campione di capelli.
8.
Fare un confronto statistico dei dati (pendenze delle rette e contenuto di zinco) ottenuti con i
due metodi (calibrazione esterna e aggiunte standard), e fare le opportune considerazioni (F-test
e t-test).
23
DETERMINAZIONE DEL FLUORURO NEI DENTIFRICI O NEI
COLLUTTORI CON ELETTRODO IONO-SELETTIVO
Il fluoruro viene aggiunto nei dentifrici tipicamente al livello dello 0.05 % (da 500 a 1500
g/g), anche se in alcune zone viene addizionato all’acqua potabile (USA). Sono permesse tre
diverse fonti di fluoruro (Food and Drug Administration): NaF, SnF2 e Na2PO3F (sodio
monofluorofosfato). Nel caso di un colluttorio la quantità di fluoruro (NaF) mediamente è intorno ai
225 ppm (espressi come g/g di F–).
Composizione tipica di un dentifricio:

pirofosfato di calcio
39 %

acqua
25 %

sorbitolo (soluzione al 70 %)
20 %

glicerina
10 %

miscellanea di componenti
5%

pirofosfato stannoso
1%

fluoruro stannoso
0.4 %
La parte minerale dei denti è costituita da idrossiapatite che reagendo con il fluoruro forma
l’apatite fluorinata e poi la fluoroapatite, molto meno solubile nell’ambiente acido creato dai batteri
della bocca in presenza di cibo, in particolare nella digestione dei carboidrati.
Ca10(PO4)6(OH)2 + F–  Ca10(PO4)6(OH)F + OH–
Ca10(PO4)6(OH)F + F–  Ca10(PO4)6F2 + OH–
La principale applicazione della misura dei fluoruri con elettrodo ionoselettivo è relativa alle
acque potabili, e quindi di fiumi, di laghi, di sorgenti, di prelevamento dal sottosuolo, in acquedotti
(U.S.EPA metodo 340.2). L’importanza dei fluoruri è legata alla limitazione e prevenzione della
carie dentale e quindi è importante conoscere la quantità di fluoruri contenuti in acque potabili o
destinabili alla potabilizzazione. E’ bene che il contenuto di fluoruri sia misurabile ma inferiore a 2
ppm (2 mg/L). Acque con contenuto superiore a 2 ppm presentano invece un aspetto non più
benefico, ma dannoso, perché l’eccessiva ingestione di fluoruri nel periodo di formazione della
corona dentale (fino agli 8 anni) provoca una malattia, la fluorosi, che comporta una
mineralizzazione dei denti che li scurisce ed indebolisce e provoca l’incurvatura della spina dorsale.
24
Del fluoruro ingerito il 60 % viene escreto con le normali funzioni mentre il rimanente 40 % si
deposita sullo scheletro e sugli altri tessuti calcificati.
La misura viene effettuata anche in acque minerali imbottigliate, dentifrici, colluttori, nonché in
campo medico ossa, urina, plasma, ecc.. Altre applicazioni importanti sono la misura dei fluoruri
nei minerali e nell’industria del vetro, della ceramica, dell’alluminio e nell’industria alimentare.
Presupposti teorici
L’equazione che descrive la risposta dell’elettrodo in funzione dell’attività dello ione per cui è
selettivo è l’equazione di Nikolskii-Eisenman, che tiene conto di eventuali interferenti:
E  K  2.303

RT
z /z
log ai  kija j i j
zi F

con i ione principale, j ione interferente, zi e zj cariche dei due ioni e kij coefficiente di selettività che
 
dipende dal tipo di elettrodo. a F    F   F 
con  F   1 per soluzioni diluite (< 10–4 M).
L’elettrodo al fluoruro è a membrana solida, che consiste in un monocristallo di trifluoruro di
lantanio (LaF3) drogato con Eu2+ per aumentare la conducibilità. All’interno dell’elettrodo è
presente una soluzione contenente KCl (3 M) ed F– (0.01 M), un filo metallico d'argento ed una
pasta di AgCl depositata sopra. Questo componente elettrodico viene talvolta chiamato "riferimento
interno". L'elettrodo a fluoruro è strutturalmente identico ad un elettrodo di vetro, e si differenzia da
questo solo per la membrana esterna. Anche il meccanismo con cui l'elettrodo a fluoruro risponde
agli ioni F– è del tutto analogo a quello con cui un elettrodo di vetro risponde agli ioni H+.
L’unico ione interferente per questo tipo di membrana è l’OH– (kF,OH  0.01) per cui le
determinazioni vanno effettuate a pH  7. Interferenze chimiche possono essere dovute invece ad
equilibri che diminuiscono la quantità di fluoruro libero, come ad esempio:
25
H3O+ + F– = HF + H2O
HF + F– = HF2–
SiO2 + 4 HF = SiF4 + H2O
Al3+ + 6 F– = AlF63–
Di conseguenza è opportuno evitare di conservare soluzioni di fluoruro in recipienti di vetro, ed
effettuare la determinazione del fluoruro in presenza di un complessante per i metalli interferenti
(Al3+, Fe3+, fino a 3 ppm) come ad esempio citrato o CDTA. Se la concentrazione di fluoruro nel
campione non supera i 10 ppm non si hanno perdite di fluoruro per associazione.
Per evitare errori dovuti alla variazione di  F  tra la fase della calibrazione e quella delle misure
incognite, tutte le misure vengono effettuate in un ambiente a forza ionica tamponata. Ciò viene
realizzato aggiungendo il TISAB (Total Ionic Strength Adjustment Buffer) a tutte le soluzioni. Il
TISAB ha pH 5.0 e forza ionica 1.75 M, ed è così composto:

NaCl 1.0 M

acido acetico 0.25 M

acetato di sodio 0.75 M

citrato di sodio 0.001 M
Campioni e soluzioni standard vanno diluiti 1:1 con il TISAB. Si può anche utilizzare il TISAB III
(con CDTA), 8 volte più concentrato del precedente, 1 parte + 9 di campione, riducendo così la
diluizione.
Il metodo ha un intervallo di linearità tra 0.1 e 1000 ppm di F– (510–6÷510–2 M).
La misura con elettrodo ionoselettivo è una misura potenziometrica, dunque condotta in quasi
totale assenza di corrente nel circuito, ed in presenza di un elettrodo di riferimento. Tale riferimento
viene talvolta chiamato "esterno", per distinguerlo dal riferimento "interno" presente nell'elettrodo
ionoselettivo.
L’accuratezza dell’analisi dipende da molte variabili. Tra queste, oltre agli usuali errori nelle
procedure analitiche (di pesata, volumetrici, purezza dei reagenti, ecc.) sono da prendere in
considerazione gli errori dovuti all’uso di un elettrodo ionoselettivo. Questi coinvolgono l’elettrodo
di misura, l’elettrodo di riferimento, il potenziale di giunto liquido, il potenziometro, la temperatura
e l’equazione di Nernst. Derivando l’equazione di Nernst rispetto alla concentrazione si ottiene:
dE 
59.16 dC

2.303 C
mV a 25°C
26
per cui un errore di 1 mV nella lettura del potenziale comporta un errore sulla concentrazione del 4
%.
Se il millivoltmetro ha un’accuratezza di 0.1 mV, l’errore è dell’ordine di alcuni decimi di
millivolt, e quindi l'errore sulla concentrazione è apprezzabilmente inferiore al 4 %, purché gli
elettrodi di misura e di riferimento siano di buona qualità e la temperatura sia controllata al grado
centigrado.
Parte sperimentale
Reagenti, frasi di rischio e di sicurezza

Cloruro di sodio (-)

acido acetico (C, R10, R35, S23, S26, S45)

acetato di sodio (S22, S23, S24/25)

citrato di sodio (-)

fluoruro di sodio essiccato in stufa per 2 ore a 110°C (T, R25, R32, R36/38, S22, S36, S45)
Vetreria

spruzzetta

vetrini da orologio

pinzetta e spatolina

imbuto per buretta e imbuto per matraccio

matracci da 100 mL in plastica
27

matraccio in vetro da 250 mL

matraccio in plastica da 500 mL

matraccio in plastica da 250 mL

cilindro da 250 mL

bicchieri in plastica alti e stretti da 100, 150 o 250 mL

bicchiere in vetro da 250 mL

pipette tarate da 5, 25 e 50 mL

micropipette e relativi puntali

buretta da 25 mL
Apparecchiature

elettrodo ionoselettivo al fluoruro

elettrodo di riferimento

millivoltmetro

agitatore con ancoretta magnetica
Procedimento
1.
Preparare 500 mL di TISAB con NaCl, acido acetico, acetato di sodio e citrato di sodio in
modo da realizzare le seguenti concentrazioni: NaCl 1.0 M, acido acetico 0.25 M, acetato di
sodio 0.75 M e citrato di sodio 0.001 M.
2.
Preparare una soluzione standard da 1000 ppm (mg/L di F–, non di sale!) con NaF (100
mL). Preparare poi due soluzioni diluite da 1 e 10 ppm (100 mL) e una da 50 ppm (500
mL); conservare in recipienti di plastica (dove sono stabili per diversi mesi).
3.
Preparazione del campione di colluttorio. A causa della presenza di tensioattivi, per
evitare la formazione di eccessiva schiuma è opportuno diluire il campione nel seguente
modo. Porre 125 mL di TISAB in un matraccio di plastica da 250 mL. Aggiungere acqua
MilliQ fin quasi a portare a volume, lasciando lo spazio per il colluttorio. Calcolare la
quantità di colluttorio da aggiungere (ad esempio 2.5 mL se la concentrazione dichiarata è
225 ppm di F–; se la concentrazione fosse diversa, modificare opportunamente la quantità di
colluttorio prelevato). Aggiungere il colluttorio, portare a volume e mescolare. Nel
frattempo procedere alla calibrazione dell’elettrodo.
28
3bis. In alternativa
Preparazione del campione di dentifricio. Pesare con bilancia analitica 500 mg di
dentifricio direttamente in bicchiere di plastica da 250 mL. Aggiungere 125 mL di TISAB,
disperdere bene con una bacchetta di vetro in modo da facilitare la dissoluzione del
fluoruro, trasferire quantitativamente in bicchiere di vetro, e bollire per 2 min. Lasciar
raffreddare, trasferire quantitativamente in un matraccio da 250 mL e diluire portando a
volume con acqua MilliQ. Nel frattempo procedere alla calibrazione dell’elettrodo.
4.
Taratura dell’elettrodo per 2 punti. Trasferire 25 mL di TISAB e 25 mL di soluzione di
F– da 1 ppm in un bicchiere da 100 mL e aggiungere un’ancoretta magnetica. Inserire gli
elettrodi puliti in modo che siano sufficientemente immersi e collegarli al millivoltmetro.
Dopo che l’elettrodo si è stabilizzato (1÷3 min.) leggere la f.e.m. e prenderne nota. Ripetere
la procedura con la soluzione da 10 ppm di F–, dopo aver sciacquato e asciugato gli
elettrodi.
5.
Procedere con la taratura su più punti (retta di calibrazione esterna dell’elettrodo).
Trasferire 25 mL di TISAB in un bicchiere da 150 o 250 mL (alto e stretto) aggiungere 25
mL di acqua MilliQ e un’ancoretta magnetica. Inserire gli elettrodi puliti in modo che siano
sufficientemente immersi e collegarli al millivoltmetro.
Costruire una retta di taratura per l’elettrodo con almeno 5 punti, aggiungendo con una
buretta successive aliquote crescenti di soluzione standard di fluoruro da 50 ppm alla
soluzione iniziale (per esempio aggiungere 0.5, 1.0, 2.0, 6.0 ed infine altri 12.0 mL totali).
Dopo ogni aggiunta attendere che l’elettrodo si sia stabilizzato e leggere la f.e.m..
Ripetere la taratura per altre due volte, rinnovando ogni volta la soluzione iniziale.
Dopo ogni taratura, gli elettrodi devono essere risciacquati con acqua MilliQ e asciugati con
la carta, senza strofinare.
6.
Analisi dei campioni. Trasferire 50 mL di campione in un bicchiere di plastica alto e
stretto da 150 o 250 mL, immergere gli elettrodi e l’ancoretta magnetica; collegare gli
elettrodi al millivoltmetro. Dopo che l’elettrodo si è stabilizzato leggere e registrare il
valore di f.e.m. (misura diretta della f.e.m.).
Procedere poi con le aggiunte standard di soluzione da 50 ppm di NaF, leggendo la f.e.m.
dopo stabilizzazione del segnale. Effettuare almeno 3 aggiunte di 1.0 mL ciascuna,
verificando che l’incremento complessivo del potenziale sia di almeno 20 mV (altrimenti
aumentare l'entità delle aggiunte). Ripetere il procedimento per 2 altre aliquote di campione
(misura iniziale e aggiunte standard).
29
Dopo ogni serie di misure nel campione gli elettrodi devono essere risciacquati con acqua
MilliQ e asciugati con la carta, senza strofinare (dopo aver effettuato la misura sul
campione si dovrebbe anche rinnovare il giunto liquido).
Elaborazione dei dati
I dati ottenuti vengono elaborati utilizzando tre metodi: quello della taratura per due punti,
quello della calibrazione esterna, e quello delle aggiunte standard. Si ottengono quindi tre valori
distinti per la concentrazione di fluoruro nel campione (espressa come massa F–/massa campione).
1.
Taratura per due punti. Utilizzare i 2 punti della taratura dell’elettrodo e la media delle
misure dirette di f.e.m. effettuate sul campione. In questo caso non è possibile ottenere una
stima affidabile per l'intervallo di confidenza.
2
Calibrazione esterna dell'elettrodo. Mettere in un unico diagramma i valori di E contro
log[F–] ottenuti dalle 3 calibrazioni dell’elettrodo e ricavare la retta (riportarne i dati richiesti
- cfr. dispensa statistica). Partendo dalla media delle misure dirette di f.e.m. effettuate sul
campione, ricavare il valore di concentrazione di F– ed il suo intervallo di confidenza per
interpolazione con tale retta di calibrazione.
3.
Metodo delle aggiunte standard. Utilizzando i dati delle aggiunte standard, riportare in
diagramma la funzione (V0+V)·10–E/S (funzione di Gran) in funzione del volume V di
soluzione standard di F– aggiunto (S è la pendenza ottenuta dalla retta di calibrazione, il cui
valore teorico è 59.16 mV, per z = 1 e T 25°C). Col metodo dei minimi quadrati ricavare
l'espressione della retta (cfr. dispensa statistica). Ricavare per estrapolazione della funzione
di Gran a zero il valore V dal quale ricavare C0 = CV/V0 = concentrazione inizialmente
presente di fluoruro. Ricavare poi la quantità di fluoruro presente nel campione, con relativo
intervallo di confidenza.
Confrontare tra di loro i valori di concentrazione ottenuti col metodo della calibrazione esterna e
col metodo delle aggiunte standard (t-test, F-test). Confrontare questi valori con quello dichiarato
sull'etichetta del prodotto (t-test).
30
INDICE
Determinazione degli acidi grassi in lipidi di origine naturale mediante ..........................................
Gas-Cromatografia
Parte sperimentale............
Determinazione della caffeina in caffè, te, Coca-Cola e farmaci ..........................................
analgesici tramite HPLC con rivelazione spettrofotometrica nell'UV
Parte sperimentale............
Determinazione di anioni inorganici presenti in acque potabili tramite
cromatografia ionica e rivelazione conduttimetrica soppressa
..........................................
Parte sperimentale............
Determinazione di cationi inorganici presenti in acque potabili tramite ..........................................
cromatografia ionica e rivelazione conduttimetrica soppressa
Parte sperimentale............
Metodo ufficiale di dosaggio del fosfato solubile nelle acque (D-011 ..........................................
marzo1981)
Parte sperimentale............
Determinazione dell'acido fosforico nella Coca-Cola
.........................................
Parte sperimentale............
Determinazione dello zinco nei capelli mediante spettroscopia di ..........................................
assorbimento atomico in fiamma
Parte sperimentale............
Determinazione del fluoruro nei dentifrici con elettrodo iono-selettivo
..........................................
Parte sperimentale............
2
5
7
7
10
10
13
13
16
17
20
20
21
21
24
27
Dispense di Laboratorio di Chimica Analitica 2, Laurea in Chimica.
Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università di Padova
Gabriella Favaro, Valerio Di Marco
A.A. 2013/14
31