boyan2011giulia cocco

Giulia Cocco
Biosiqu 1
DIABETE MELLITO
Colpisce circa 220 milioni di persone al mondo. Circa il 10% ha
il tipo I.
 Tipo I (diagnosi precoce) = risposta autoimmunitaria
mediata dalle cellule T verso le cellule β delle isole di
Langherans, nel pancreas (produttrici di insulina).
INSULINO DIPENDENTE
 Tipo II (diagnosi ritardata) = deficit parziale nella
produzione di insulina e generale insulino-resistenza
INSULINO INDIPENDENTE (almeno in una prima fase)
Entrambi sono dovuti alla sovrapposizione di un fattore
ambientale su una predisposizione genetica
COMPLICANZE
Sono queste la reale causa di morte dei pazienti diabetici. Più
frequenti del diabete di tipo II, ma proprie di entrambi i tipi
Danneggiamenti
al
microcircolo
che
portano
problemi
soprattutto
al
sistema nervoso e
ai reni, ma anche
a occhi, piedi e,
con il tempo, al
cuore.
INSULINA
(ormone proteico di 51 aa)
Stimola l´ingresso di glucosio nel citosol delle cellule di organi
insulino-dipendenti (es. muscoli) legandosi ad un recettore
esterno della membrana cellulare. Inoltre riduce la produzione di
glucosio da parte del fegato
Deriva dalla proinsulina
(polipeptide di 110 aa,
compresa una sequenza
segnale di 24 aa,
non mostrata).
1.
2.
Taglio del peptide C grazie a
proormone convertasi 2 e 3
Legami disolfuro tra catena A
e B.
FORMULAZIONI INSULINICHE
• Insulina regolare: lenta nel picco d’azione, ma a lunga durata
 Analoghi ad azione rapida (Lispro
e Aspart): picco d’azione più veloce,
ma durata inferiore; consente
assunzione dopo pasti principali;
previene da eventuali ipoglicemie ma
non copre eventuali spuntini.
 Analoghi ad azione lenta: lunga
durata di azione quindi usata per
insulinizzazione basale. Nessuna
presenza di picchi
 Mix di analoghi rapidi con forme di
essi protaminate (queste ultime ad
assorbimento più lento)
METODI DI SOMMINISTRAZIONE
 Via parenterale
ha però vari svantaggi: dolore, prurito,
allergie, lipodistrofie al sito di iniezione e quindi non conformità
con il regime di insulina
 Uso di siringhe a penna
 Uso di microinfusori
 Approcci alternativi:
 Spray boccale: MA minore durata di azione, dosaggio richiesto molto
maggiore
 Somministrazione per inalazione: es. exubera MA tolto dal mercato
per gli effetti collaterali
 Farmaco orale antidiabetico: MA utile solo per il tipo II
 Somministrazione orale
SOMMINISTRAZIONE ORALE
Varie sfide da superare:
 Protezione dalla degradazione enzimatica nello stomaco
 Assorbimento efficiente nel GALT (tessuto linfoide
associato all’intestino)
Approcci:
 Incapsulamento con nanoparticelle e somministrazione con
inibitori delle proteasi
 Espressione dell’insulina in cellule di pianta
Vantaggi con espressione in pianta
 Bassi costi, facilità di purificazione e processamento,
eliminato il bisogno di conservazione al freddo, semplificato
trasporto e somministrazione
PRODUZIONE INSULINA
•Produzione insulina commerciale (eliminato il peptide C):
•In E.Coli o lievito come proteine di fusione prodotte separatamente
(catena A e catena B) e poi unite.
•Dal gene della proinsulina in lievito
•Metodo alternativo di produzione proposto nell’articolo:
• espressione in cloroplasto di CTB-PFx3: proinsulina fusa con la
CTB e contenente 3 siti di taglio della furina
Giunzione che serve
per evitare ingombro
sterico
FURINA
 Endoproteasi ubiquitaria nelle cellule umane
 Naturalmente taglia le sequenze che rendono inattiva
una proteina
 Serve per permettere il processamento nelle cellule
dell’intestino (ovviamente fuori dal pancreas)
 Taglio dipendente da motivo di sequenza specifico di 20
aa: 8 fanno parte di una regione core, gli altri sono in 2
regioni polari.
RUOLO DELLA FUSIONE CON IL CTB
La subunità B della tossina colerica (AB5,la vera tossina è la
subunità A) serve:
 Per facilitare la purificazione del CTB-PFx3 con tecniche
cromatografiche. La CTB ha 3 His vicini con fold
appropriato che consentono legame a resina di scambio
anionico
 Per migliorare l’uptake al livello del GALT (tessuto linfoide
associato alla mucosa intestinale) grazie all’interazione con
il recettore gangliosidico GM1 sulle cellule epiteliali
dell’intestino. L’interazione con GM1 è aiutata dalla
pentamerizzazione dei CTB che sono legati all’ N-term del
costrutto.
PEPTIDE C
 Funzione indipendente dall’insulina
 Importante somministrarla perché i diabetici di tipo I non
la producono
 Attiva le G-protein che danno il segnale alle cellule per
l’apertura dei canali in entrata del calcio. Questo stimola i
pathway delle eNOS (endothelial nitric oxide synthase),
delle Na+ e K+ ATPasi e delle MAP chinasi
 Essenziale per la funzione dei nervi e per la funzione
renale (può aiutare nei trattamenti a lungo termine delle
complicanze, alleviandole)
 Di solito è utilizzato solo come marker per determinare
l’estensione di rilascio di insulina nei pazienti
ESPRESSIONE IN CLOROPLASTO
Vari vantaggi:
 Contenimento perché il cloroplasto segue eredità materna
quindi il polline sarà wt
 Alte rese: perché il DNA cloroplastico può arrivare al 10- 20 % di
tutto il DNA cellulare:
 Una sola cellula può avere dozzine di cloroplasti
 Ogni cloroplasto ha più nucleoidi
 Ogni nucleoide ha più ripetizioni del DNA cloroplastico
E’ necessario però
 Che la sequenza introdotta sia fiancheggiata da regioni
omologhe al cromosoma plastidico di circa 400 bp (inoltre
trasformazione in sito specifico)
 Uso della tecnica di bombardamento
 Fare vari passaggi di selezione per raggiungere l’omoplasmia
VETTORI PER TABACCO E LATTUGA
pLD
pLsLF
Il costrutto (CTB-PFx3) è
inserito nei vettori, costruiti
con:
• regioni fiancheggianti (trnI
–spesso in essa c’è oriA- e
trnA) omologhe al plastoma
•Gene per la resistenza alla
spectinomicina (aadA)
•Promotore dell’operone rrn
(entro cui sono i siti trnI e
trnA) = Prrn
•Nella lattuga c’è un secondo
promotore regolato dalla luce
(LsPpsbA) che nel tabacco è
in una regione 5’UTR
TRASFORMAZIONE e VALUTAZIONE
DELL’OMOPLASMIA
 DNA di tabacco è stato digerito con AflIII
e sondato con una sequenza di 0,81 kb
complementare alle regione trnI/trnA del
cloroplasto nativo.
Frammento di
4,2 kb nel tabacco non trasformato e
frammento di 6,4 kb in tabacco
trasformato
 Le due linee transplastomiche analizzate
Confermate
(A e B) con Southern Blot avevano solo
INTEGRAZIONE ed frammenti di 6,4 kb, Il wt aveva solo
OMOPLASMIA
frammenti di 4,2 kb (Figura)
TRASFORMAZIONE e VALUTAZIONE
DELL’OMOPLASMIA
 DNA
Confermate
INTEGRAZIONE ed
OMOPLASMIA
di lattuga è stato
digerito con BgIII e sondato
come in tabacco.
Frammento di 3,75
kb
nella
lattuga
non
trasformata e frammento di6,3
kb nella lattuga trasformata
 Tutte le linee transplastomiche
analizzate con Southern Blot
avevano solo frammenti di 6,3
kb. Il wt aveva solo frammenti
di 3,75 kb (Figura)
Tabacco: DETERMINAZIONE
DELL’ESPRESSIONE DI CTB-PFx3
 Estrazione
proteina da foglie
giovani, mature e vecchie
 Centrifugazione
campioni:
supernatante (S), pellet (P) e
frazione omogenata (H)
 Corsa dei campioni su gel di SDSpage. (fig. A). N.B. 22kDa= peso di
CTB-PFx3. La
proteina
si
è
accumulata in corpi di inclusione
perché non è nel supernatante.
 Immunoblot con Ab anti-CTB. (fig.
B). Banda da 22 kDa rappresenta i
monomeri, da 44 e 66 kDa (ecc.) i
dimeri e trimeri (ecc.).
22
kDa
Tabacco: DETERMINAZIONE
DELL’ESPRESSIONE DI CTB-PFx3
I livelli di espressione in tabacco sono stati valutati con corsa su SDS-page e
successiva misura quantitativa della densità ottica degli spot usando varie [CTBPFx3]. (Uso di una curva standard di [CTB])
CTB-PFx3 era espresso a livelli superiori al 47% delle proteine totali
ed in concentrazioni oltre i 2,92 mg/g di tessuto fogliare nelle
foglie vecchie.
Lattuga: DETERMINAZIONE
DELL’ESPRESSIONE DI CTB-PFx3
I campioni di lattuga sono stati preparati come quelli di tabacco ed i test
effettuati sono stati i medesimi.
CTB-PFx3 era espresso a livelli superiori al 53% delle proteine totali
ed in concentrazioni oltre i 3,28 mg/g di tessuto fogliare nelle
foglie vecchie.
VALUTAZIONE DELLA STABILITÀ DI
CTB-PFX3
 Estrazione di proteine da foglie
senescenti
 Omogenato fogliare su gel di SDSpage testato con Ab anti-CTB (fig.
A) o anti-insulina (fig. B).
CTB-PFx3 era espresso, nelle
foglie senescenti secche, ad
alti livelli: più del 39% delle
proteine totali. Esso quindi,
in quanto insolubile, è
altamente stabile e protetto
dalla
degradazione
proteolitica
SOLUBILIZZAZIONE E TAGLIO DELLA
PROINSULINA
1.
Rimozione della proteina come corpo di inclusione, conversione in forma
solubile e rinaturazione della proteina
-F
+F
2. Saggio di taglio della furina
(Fig. a): immunoblot con Ab antiCTB. In +F scompare la banda
da 22 kDa e ne compaiono due:
•11kDa= CTB
•14kDa=taglio incompleto:
CTB-B chain
N.B. Si vede una sola banda perché i pesi
Silver strain per visualizzare le bande
della catena A (2kDa), B (3kDa) e del
da 2-3kDa (Fig. b).
peptide C (2,5kDa) sono troppo vicini tra
loro.
PURIFICAZIONE
 Estratti di pianta solubilizzati e rifoldati sono stati fatti passare attraverso una
colonna per cromatografia di affinità (Ni-NTA). Le frazioni eluite sono state
corse in SDS-page e visualizzate con colorazione di Coomasie.
Si vedono i corpi di inclusione da 22 kDa nel pellet e nelle frazioni
purificate, ma c’è anche la RUBISCO (50 kDa) quindi la
purificazione non è ottimale.
• Seconda purificazione e rimozione della
RUBISCO: uso di foglie vecchie –campione 3- più
precipitazione con sodio fitato –campione 4-.
Nel campione 4 si vede il CTB-PFx3 e non c’è
più la RUBISCO.
DS= supernatante
dializzato; FT= passato
attrverso; W1-2-3= lavaggi;
2-3= frazioni purificate
PURIFICAZIONE
Le porzioni purificate con la rimozione della RUBISCO sono state analizzate con
immunoblot con Ab anti-CTB (Fig. c) e Ab anti-insulina (Fig. D)
In entrambi i blot la CTBPFx3 nelle frazioni purificate
(22 kDa) è maggiore che in
DS e sono maggiori anche i
monomeri
(funzionalità
proteina)
PURIFICAZIONE
•Studi di densitometria sui blot della slide precedente
In
DS c’è CTB-PFx3 puro al 27% (30.000 ng/ml), dopo la prima
purificazione la purezza sale al 57% (320.000 ng/ml) ed infine, dopo
la seconda purificazione, si arriva ad una purezza dell’ 87% (140.000
ng/ml). N.B. questo calo nella concentrazione probabilmente è
dovuto al fatto che diminuisce il volume totale nella colonna
VALUTAZIONE FUNZIONALE DELLA
PROINSULINA
•PBS (tampone fosfato salino)=
c0ntrollo negativo;
•Insulina
commerciale
=
controllo positivo
tabacco
Il
CTB-PFx3
è
stato
somministrato 2 volte a distanza
di 180 min
Sono state fatte misurazioni di glucosio nel sangue (topi) prima della
somministrazione e, dopo di essa, ad intervalli regolari.
A 120 min dopo la seconda somministrazione, i livelli di glucosio
erano comparabili a quelli dovuti a somministrazione dell’insulina
commerciale. Questo dimostra che la proinsulina è distribuita nella
circolazione e propriamente tagliata e foldata.
DISCUSSIONE
Basandosi solo sulla resa di monomeri e dimeri (circa 3 mg/g di
tessuto fogliare) di proinsulina e con un 50% di perdita della
proteina durante la purificazione (sottostima significativa), un
acro può rendere 20 milioni di dosi di insulina al giorno.
La maggior parte dell’accumulo si ha nelle foglie più vecchie ma
anche in foglie senescenti e secche (prima volta). Questo
facilita la raccolta, l’essiccazione in campo, la conservazione ed il
trasporto.
Aspetti non investigati in questo studio:
 Percentuale di proteina, somministrata al livello orale, assorbita
dal GALT e trasportata dal sistema circolatorio
 Efficienza di refolding dell’insulina
Futuri studi:
Effetti a lungo termine del peptide C e del CTB-PFx3
BIBLIOGRAFIA
 Boyhan D. and Daniell H. 2010 Low cost production of
proinsulin in tobacco and lettuce chloroplasts for injectable or
oral delivery of functional insulin and C-peptide Plant
Biotechnology Journal 9 pp. 585-598
 Santi L. 2012 Dispense di lezione
 Tian S 2009 A 20 Residues Motif Delineates the Furin
Cleavage Site and its Physical Properties May Influence Viral
Fusion Biochemistry insights 2 9-20
 Verma D. and Daniell H. 2007 Chloroplast Vector Systems for
Biotechnology Applications Plant Physiology Vol. 145, pp.
1129–1143
GRAZIE PER
L’ATTENZIONE