enzimi enologici: metodo di produzione, modo d`azione

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BAJARD SPARROW ET AL., ENZIMI ENOLOGICI: PRODUZIONE, AZIONE E IMPATTO, PAG.1
ENZIMI ENOLOGICI: METODO DI PRODUZIONE, MODO D'AZIONE ED IMPATTO
SULLA TRASFORMAZIONE DELL'UVA IN VINO
Céline BAJARD SPARROW, Céline FAUVEAU, Catherine GRASSIN, Patrice PELLERIN
DSM Food Specialties
Il primo enzima prodotto su scala industriale, un’amilasi, è stato creato nel 1922 nel Nord della
Francia, dalla azienda Rapidase. In questi impianti di Seclin, recentemente automatizzati e
sottoposti ad una politica di qualità (certificati ISO 9002 dal 1993), DSM Food Specialties,
successore della società Rapidase, produce enzimi destinati all'industria delle bevande.
DSM Food Specialties, azienda olandese specializzata in chimica e in biotecnologie, è leader
mondiale nel settore agro-alimentare degli ingredienti e degli ausiliari tecnologici. La sua
vastissima gamma di prodotti comprende soprattutto lieviti e prodotti da essi derivati, ma anche
enzimi di cui una specifica linea enologica.
Le frequenti domande sui metodi di produzione degli enzimi per vinificazione o sul loro utilizzo in
enologia hanno spinto il servizio tecnico-applicativo della DSM a redigere questo articolo.
Fotografia 1: impianti per la produzione di enzimi - Seclin Francia
Produzione indotta delle attività enzimatiche ricercate
Per produrre gli enzimi utilizzati in enologia, DSM Food Specialties coltiva, in fermentatori in
condizioni aerobiche, i microrganismi selezionati (Aspergillus Niger o Trichoderma). La
composizione del substrato di crescita, di origine vegetale, permette di indurre un'ottima
produzione delle attività enzimatiche ricercate, ad es. un substrato ricco in pectine induce i
microrganismi a secernere pectinasi nel mezzo.
Gli enzimi secrèti nel mezzo sono poi isolati mediante centrifugazione, ultrafiltrazione e
concentrazione. Al termine di queste fasi, i microrganismi sono completamente eliminati. Si ottiene
allora un prodotto la cui attività principale è accompagnata da molte attività secondarie; le quali
hanno un ruolo in enologia più o meno importante, o addirittura fondamentale.
Gli enzimi sono disponibili sia sotto forma liquida sia in microgranuli. Un controllo qualità certifica la
conformità secondo le specifiche stabilite. Un certificato di attività enzimatiche, di analisi chimiche
e microbiologiche, conforme alle vigenti legislazioni, è redatto per ogni partita di prodotto e ciò ad
ogni consegna.
Richiamo sulla struttura e la composizione dell'acino d'uva
Per comprendere l'importanza degli enzimi in enologia, occorre conoscere il loro modo d'azione.
Gli enzimi svolgono un importante ruolo di infragilimento delle cellule della polpa e della pellicola.
Benché la composizione degli acini dipenda dal vitigno, dal terreno e dalle condizioni climatiche, la
struttura delle cellule vegetali varia poco.
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rete vascolare periferica
esocarpo
(buccia)
cuticola
mesocarpo
(polpa)
vinacciolo
fasce vascolari
Schema 1: composizione dell'acino
d'uva
pedicello
In vinificazione, la pellicola svolge un ruolo fondamentale. Rappresenta dal 6 al 9% della massa
dell'acino. All'interno delle cellule pellicolari, si trovano antociani, tannini, aromi e precursori di
aromi.
La spessa parete pecto-cellulosica delle cellule pellicolari garantisce la loro rigidità, ma impedisce
la diffusione dei composti intracellulari nel mosto durante la vinificazione.
La polpa costituisce il 75-85% dell’acino maturo. È composta di grandi cellule a fini parete pectocellulosiche che oppongono poca resistenza meccanica alla trasformazione dell'uva. Queste
cellule sono fonte di polisaccaridi pectici nel mosto; l'interno del loro vacuolo contiene una
soluzione concentrata di acidi organici e di zuccheri fermentescibili (glucosio e fruttosio: 150-300
grammi per litro). La pectina è situata nella parete primaria e la lamella mediana tra le cellule
pellicolari e quelle della polpa. La parete pecto-cellulosica è una struttura complessa, composta di
microfibrille di cellulosa, collegate tra esse da una matrice costituita di xiloglucani, mannani, xilani
(generalmente chiamati emicellulasi) e di pectine; il tutto solidificato da una rete proteica
secondaria. Alcuni osi neutri (galattosio ed arabinosio) intervengono nella struttura delle catene
laterali della pectina e con le proteine formano macromolecole che ostacolano la chiarifica dei
mosti.
Nel corso della maturazione delle uve, delle attività pectinasi endogeni dell'acino trasformano e
solubilizzano lentamente le pectine. Queste idrolisi parziali contribuiscono al rammollimento
progressivo dell’acino. Sotto la sua forma solubile, la pectina passa nel mosto nel corso della
pressatura. Il tasso di pectina nell'uva varia in funzione del vitigno1 (tab. 1).
vitigno
Carignano
Grenache
Syrah
Alicante
pellicola
polpa
64
66
65
68
19
25
25
20
pectina
mosto
in % sul totale
17
9
10
12
Totale in g/kg di acini
Tabella 1: Tasso di pectine e poliosidi neutri di vari vitigni.
1,86
2,01
2,19
2,61
La pectina, una molecola complessa
La pectina è probabilmente una delle macromolecole più complesse in natura. È composta da 3
principali costituenti2, 3:
- gli omogalatturonani (HG). Sono molecole non ramificate composte di un concatenamento
di acidi galatturonici. Questi ultimi possono essere esterificati da una molecola di metanolo.
Costituiscono le zone dette lisce.
- I ramnogalatturonani I (RG-I). Principale catena, composta di un'alternanza di ramnosio e
di acido galatturonico, porta catene laterali di arabinani e di arabinogalattani per formare le zone
dette ramificate.
- Il ramnogalatturonano II (RG-II) ha una struttura molto complessa e resiste alle
degradazioni enzimatiche.
In merito all'organizzazione di questi 3 costituenti nelle pareti, esistono diverse ipotesi. Tuttavia si è
dimostrato che, per formare la pectina, sono legati tra loro da collegamenti osidici covalenti (fig. 2).
La porosità della parete è definita da collegamenti incrociati tra le varie catene di pectine (ioniche,
elettrostatiche, ponti borato diestere)
Figura 2: Rappresentazione schematica di una pectina
Visto la sua forte viscosità, la pectina, solubilizzata sin dalla pigiatura, è un ostacolo all'estrazione,
alla chiarificazione e alla filtrazione dei succhi. È un costituente principale delle pareti cellulari che
si oppongono alla diffusione dei composti fenolici e degli aromi nel mosto durante le fasi
prefermentative e fermentative.
Attività enzimatiche autorizzate in enologia
Le attività utilizzabili in enologia sono elencate nel regolamento UE 1493/1999. Le risoluzioni Œno
11-18/2004 dell'OIV riconoscono un importante ruolo, nel metodo di vinificazione alle seguenti
attività: pectinliasi, pectinmetilesterasi, poligalatturonasi, glicosidasi, emicellulasi, cellulasi e ßglucanasi. In quest'articolo ci soffermeremo sull'impatto degli enzimi sui composti dell’acino d'uva.
Fanno parte della famiglia dei pectinasi le principali attività solitamente utilizzate nelle preparazioni
enologiche: pectinliasi (PL), pectinmetilesterasi (PME) e poligalatturonasi (PG). Le attività dette
depolimerizzanti di tipo PL tagliano la catena di pectina tra due acidi galatturonici metilati, mentre
le PG, preferiscono un substrato non metilato. L'attività PME non depolimerizza la catena di
pectina, ma libera il gruppo metile degli acidi galatturonici esterificati. Favorisce l'azione della PG.
Degradando la pectina, le pectinasi offrono un certo numero di vantaggi tecnologici evidenti, come
l'accelerazione delle fasi pre-fermentative: chiarificazione, pressatura, aumento delle rese in
succo, quindi migliorano la qualità dei mosti.
Le formulazioni prodotte da DSM per la vinificazione sono in numerosi casi frutti di studi congiunti
con gli istituti di ricerca quale l'INRA. Da oltre venti anni, gli impianti DSM di Seclin producono
pectinasi di Aspergillus Niger, adatte alle diverse applicazioni enologiche. Queste preparazioni
enzimatiche sono prodotte a partire da ceppi classici (non geneticamente modificati) secondo un
piano HACCP e vengono rilasciati attestati ISO 90024.
Evitare la formazione di fenoli volatili grazie ad un'appropriata scelta dell’enzima
La padronanza delle tecnologie di fermentazione in produzione e l'impiego di ceppi d'Aspergillus
niger provenienti da selezioni orientate all'utilizzo enologico, consentono a DSM di abbassare a
livelli naturalmente minimi le attività indesiderate dei suoi preparati enzimatici.
L'analisi dimostra che i livelli di attività cinnamil-esterasica degli enzimi DSM sono naturalmente
inferiori a quelli degli enzimi purificati o detti "FCE", e ciò senza effettuare un trattamento di
purificazione post-produzione. L'utilizzo in vinificazione degli enzimi DSM consente di limitare la
formazione di fenoli volatili.
Utilizzo e vantaggi degli enzimi in vinificazione
Succo di sgrondo e resa di pressatura
Indebolendo le pareti cellulari della polpa ed idrolizzando la pectina solubile, gli enzimi di
macerazione in bianco facilitano la liberazione dei succhi e aumentano le rese di sgrondo, evitando
perciò le pressature troppo forti.
Le attività enzimatiche necessarie per questa applicazione sono: pectinasi (PG, PL, PME) ma
anche alcune attività che permettono l'idrolisi delle zone ramificate della pectina.
Esempio con Rapidase®X-PRESS5
Produzione: 35.000 hl
Volume della prova: 10 tonnellate per lotto
Vitigno: Sauvignon (vendemmia sana)
Per la vinificazione del Sauvignon, questa cantina utilizza un metodo di pressatura diretta con
aggiunta di enzima pectolitici. Abbiamo paragonato l'efficacia di Rapidase® X-Press e quella
dell'enzima di riferimento della cantina.
Le rispettive resi sono state di 132 kg/hl (succo estratto al 76%) per la pectinasi di riferimento,
contro 124 kg/hl (ossia l’80,5%) per la specifica formulazione DSM. Questo aumento è stato
notevole per quanto riguarda i succhi di pressa (+ 15%). La figura 3 riporta i risultati ottenuti.
sgrondo
pressa
100%
80%
60%
20%
24%
56%
57%
Enz C
Rapidase® XPRESS
Figura 3: Cantina privata, Aude ripartizione delle rese in succo di
sgrondo e di pressatura durante
la prova (aggiunta di 1 g/hl di
enzima sull’uva).
40%
20%
0%
Defecazione e chiarificazione
La chiarificazione è il risultato di molti fenomeni:
- calo della viscosità dovuta all'idrolisi delle pectine mediante una combinazione delle attività
(PG, PL, PME)
- destabilizzazione elettrostatica del deposito che porta alla sua sedimentazione. La parziale
demetilazione delle molecole di pectina con un'attività pectinmetilesterasi crea delle cariche
elettrostatiche negative che reagiscono con le cariche di altri composti che possiedono cariche
positive; quali le proteine e i composti fenolici.
È importante che un enzima utilizzato in defecazione abbia un rapporto PG/PL sufficientemente
elevato per permettere una rapida idrolisi delle pectine solubili.
Esempio con Rapidase®CB
Produzione: Cantina sperimentale
Volume della prova: 10 tonnellate per lotto
Vitigno: Moscato (vendemmia sana)
È stato utilizzato 1 g/hl Rapidase®CB. Si osserva (foto 2) dopo 24 di
contatto una torbidità di 208 NTU per il testimone e di 7 NTU per il lotto
enzimato.
®
Fotografia 2: defecazione Moscato petit grain 2005 - Rapidase CB/testimone non
enzimato
In occasione della defecazione di mosti molto ricchi in zuccheri, si nota che la fase di
sedimentazione è sempre più lunga in quelli da Moscati destinati all'elaborazione di vini dolci
naturali: conseguenza della viscosità del mosto, legata alla sua ricchezza in zuccheri.
Estrazione e stabilizzazione del colore
Come visto precedentemente, la pellicola delle uve è una barriera fisica nella diffusione degli
antociani, tannini ed aromi contenuti nelle cellule dell'epiderma.
Per liberare il contenuto cellulare, occorre dunque idrolizzare i polisaccaridi neutri ed acidi dell'uva
situati nella parete pecto-cellulosica e la lamella mediana delle cellule dell’acino. Nella vinificazione
in rosso, questi composti sono estratti nel corso della fermentazione alcolica sotto l'effetto della
temperatura, dell'alcool e delle operazioni meccaniche quali rimontaggi, pigiature, délestages.
Alcuni procedimenti fisici come la termo-vinificazione e la flash détente permettono di incrementare
questi fenomeni d'estrazione.
Le preparazioni commerciali di estrazione in rosso agiscono per rafforzare e facilitare l'azione di
questi procedimenti fisici. Devono, quindi, possedere attività emicellulolitiche secondarie non
trascurabili, oltre alle attività pectolitiche richieste, per permettere l’indebolimento delle pareti
cellulari e facilitare la diffusione del contenuto vacuolare.
Recenti studi6,7 dimostrano che la diffusione dei tannini si effettua in modo selettivo. Solo i tannini
liberi del vacuolo e quelli della parete sono liberati grazie all'azione degli enzimi sopraccitati; quindi
influiscono sulla struttura dei tannini dei vini addizionati di enzimi, questi tannini sono generalmente
più stabili e più morbidi.
Esempio con Rapidase® ExColor
quadro gustativo
Prova comparativa di enzimi presso
l'Università di Talca (Cile) su
Cabernet Sauvignon: quantità di
enzima 3 g/hl, macerazione 15
giorni a 21°C. Risultati riportati in
figura 2
acidità
4
3
amaro
volume
2
1
0
struttura
colore
astringenza
Figura 4 (a destra): profili olfattivo e
gustativo di un vino Cabernet
Sauvignon – Cile
testimone
complessità
Rapidase® ExColor
quadro olfattivo
Enz C'
fruttato
4
3
intensità
Figura
5
(sotto):
Evoluzione
dell'intensità colorante nel tempo su
un vino di Syrah – monitoraggio 18
mesi.
®
Confronto
tra
Rapidase ExColor
(dose 3 g/hl) e senza enzimi aggiunti
(Francia)
2
fiorale
1
0
altri
vegetale
8
b oisé
7
testimone
6
Rapidase® ExColor
Enz C'
5
4
3
2
1
0
iniziale
testimone
dopo 10 mesi
Rapidase® ExColor
dopo 18 mesi
Enz C'
Liberazione dei precursori di aromi
I precursori aromatici inodori sono presenti sotto forma legata agli zuccheri8 nella pellicola delle
uve. Le loro composizione e quantità sono variabili secondo i vitigni. Fra questi composti, i
terpenoli rappresentano la maggior parte degli aromi varietali delle uve bianche in particolare per i
Moscati.
Nei vitigni come i Moscati o il Riesling, i più abbondanti sono i precursori di linalolo, nerolo e
geraniolo, la loro parte "zuccheri„ è costituita da ramnosio-glucosio quali rutinosidi, da arabinosioglucosio quali arabinosidi o apiosio-glucosio per gli apiosidi. L'idrolisi sequenziale di questi
zuccheri con enzimi glicosidasi permette di liberare terpenoli molto odorosi.
In un primo tempo, gli zuccheri terminali sono tagliati da una ramnosidasi, una arabinosidasi o una
apiosidasi. La ß-glucosidasi libera successivamente i terpenoli. Non si possono dunque ridurre le
attività enzimatiche liberatrici di aromi solamente alla ß-glucosidasi, poiché questa può agire
soltanto su terpenoli glicosilati.
HO
O
CH3
HO
OH
TERP
CH2
O
O
O
O
O
HO2 HC
OH
Ramnosidasi
O
HO
OH
OH
Arabinosidasi
O
O
HO
OH
OH
Apiosilglucosidi
OH
Apiosidasi
TERP
CH2 OH

O
CH2 OH
Arabinosilglucosidi
OH
TERP
CH2
O
OH
OH
Rutinosidi
O
OH
HO
OH
TERP
CH2
O
O
OH
OH
β-glucosidasi
TERP-OH
Figura 6: Idrolisi sequenziale dei glicosidi
Questi enzimi hanno dunque per effetto di liberare dai loro precursori glicosilati composti aromatici,
non soltanto terpenoli, ma anche alcuni esteri o norisoprenoidi (composti in C13).
Esempio con Rapidase® AR2000
AR2000 è un pectinasi prodotta da un ceppo di Aspergillus Niger che racchiude naturalmente le
attività secondarie di tipo glicosidasi: ß-glucosidasi, arabinosidasi, ramnosidasi ed apiosidasi.
Queste attività sono presenti nelle proporzioni ottimali per la liberazione degli aromi. L’enzima
prodotto da DSM è una preparazione enzimatica esclusiva: è l’unica a contenere queste quattro
attività in concentrazioni efficaci. La sua applicazione è oggetto di un brevetto comune dell'INRA e
della DSM.
Un mosto di Riesling è stato addizionato con 3 g/hl di Rapidase® AR2000. La tabella 2 descrive i
tenori in composti aromatici nel vino, paragonato con un testimone senza enzima.
Composti in mg/l
Terpenoli
Esteri polari
Norisoprenoidi
Totale degli aromi volatili
Riesling testimone
0,31
0,12
0,05
104,3
Riesling
dopo aggiunta di
Rapidase® AR2000
0,63
0,15
0,16
116,5
Tabella 2: effetto delle pectinasi sulla liberazione dei composti aromatici.
Conclusione
In conclusione, le pectinasi utilizzate in enologia portano numerosi vantaggi al vinificatore quali
l’accelerazione della defecazione, l’aumento della resa in succo, il miglioramento della diffusione
dei composti fenolici e dei precursori di aromi, il miglioramento della stabilità cromatica,
l’ammorbidimento della struttura, l’aumento dei tenori in composti aromatici ma anche il
miglioramento della filtrabilità dei vini9.
Le pectinasi delle preparazioni della DSM sono efficaci nelle condizioni di pH, di tenore in SO2 e di
grado alcolico riscontrati in vinificazione. Non interagiscono sul pH o sull'acidità totale. Possiedono
scarse attività secondarie di tipo antocianasi o cinnamilesterasi, non hanno effetti negativi sulla
qualità dei vini ottenuti.
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