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Istruzioni d‟uso
BAGene DNA-SSP Kits
 IVD
Kit per la determinazione dei
gruppi del sangue AB0, fenotipi RH
sistemi Kell, Kidd e Duffy, MNS, HPA e specificità HNA
in biologia molecolare
10/20 tipizzazioni - pronte all’uso prealiquotate
REF 6640: BAGene ABO-TYPE
(rosso)
REF 6641: BAGene ABO-TYPE variant
(rosso)
REF 6645: BAGene RH-TYPE
(porpora)
REF 6646: BAGene Partial D-TYPE
(giallo)
REF 6647: BAGene Weak D-TYPE
(bianco)
REF 6648: BAGene D Zygosity-TYPE
(blu)
REF 6650: BAGene KKD-TYPE
(verde)
REF 6652: BAGene MNS-TYPE
(giallo)
REF 6660: BAGene HPA-TYPE
(blu)
REF 66701: BAGene HNA-TYPE extra3
(bianco)
Indice
1.
Descrizione del prodotto ................................................................................. 2
2.
Materiale ....................................................................................................... 10
2.1
Contenuto dei BAGene DNA-SSP kits .............................................. 10
2.2
Materiale necessario e supplementare................................................ 10
2.3
Conservazione e stabilità .................................................................... 11
3. Dati per l‟esecuzione ....................................................................................... 11
4. Procedura del test............................................................................................ 12
4.1
Condizioni di sicurezza ed indicazioni speciali .................................... 12
4.2
Estrazione del DNA ............................................................................. 14
4.3
Amplificazione ..................................................................................... 14
4.4
Gel elettroforesi ................................................................................... 17
4.5
Documentazione ed interpretazione .................................................... 18
4.6
Spiegazione dei fogli di lavoro e del diagramma d‟interpretazione ..... 19
5. Avvertenze e precauzioni ................................................................................ 21
6. Soluzione dei problemi .................................................................................... 22
7. Riferimenti........................................................................................................ 23
8. Spiegazione dei simboli .................................................................................. 29
Versione 06/2010
1.
Descrizione del prodotto
Recentemente sono stati fatti molti progressi nella determinazione dei gruppi del sangue e
delle piastrine mediante l‟utilizzo della Polymerase Chain Reaction (PCR). La tecnica è
ideale per completare, chiarire e confermare i risultati sierologici. Il sequenziamento degli
alleli ABO [1-13], RHD/RHCE [14-38], Kell- Kidd- e Duffy [39-56], MNS [57-60],
HPA [61-66] e HNA [67-71] ha facilitato una chiara tipizzazione dei donatori, dei riceventi e
delle donne gravide al livello del DNA con un‟alta risoluzione e ha molti vantaggi rispetto ai
metodi sierologici tradizionali.
Il materiale base per la tipizzazione con i BAGene DNA-SSP kits è il DNA leucocitario
purificato. La procedura del test prevede l‟uso del metodo Sequence Specific Primers
(SSP)-PCR (vedi Fig. 1) [74,75]. Questo metodo si basa sul fatto che l‟estensione del
primer, e perciò la riuscita della amplificazione da PCR, dipende da un esatto match di
entrambi i primers all‟estremità 3‟. Quindi, l‟amplificazione avviene solo se i primers sono
complementari alla sequenza target, e l‟amplificato (esistente se la reazione è positiva)
viene di seguito evidenziato dall‟elettroforesi su gel d‟agarosio.
Match esatto
Amplificazione
Amplificazione
(Allele specifico)
Mismatch
Mismatch
Nessuna
NessunaAmplificazione
Amplificazione
(Allele
(Allelenon
nonspecifico)
specifico)
Fig. 1: Principio dell‟SSP-PCR
L‟insieme delle reazioni ottenute o meno dalle diverse miscele di primers rende possibile
una chiara identificazione dei genotipi AB0, RH, KEL, JK, FY, MNSs, HPA e HNA
mediante i rispettivi diagrammi d‟interpretazione. Per ogni kit sono usate un certo numero
di mix di reazione prealiquotate e liofilizzate incluso il controllo di amplificazione interno
con un volume finale di 10 µl.
2 di 29
Determinazione in genetica molecolare del gruppo del sangue AB0
La determinazione molecolare del gruppo del sangue AB0 è applicabile
nei
neonati,
poichè
l‟espressione
dell‟antigene
AB0
non
è
sviluppata
completamente e gli anticorpi potrebbero essere acquisiti passivamente dalla
madre;
nei casi in cui il sierotipo originale è mascherato in seguito a massicce e ripetute
trasfusioni di eritrociti omologhi;
nel monitoraggio di un trapianto di midollo osseo ABO incompatibile [9];
negli esami forensi.

BAGene ABO-TYPE e BAGene ABO-TYPE variant
Le caratteristiche del sistema del gruppo del sangue AB0 sono definite da residui
terminali di zucchero delle catene di carboidrati di glicoproteine e glicolipidi sulla
superficie delle emazie. Specifiche glicosiltransferasi catalizzano queste modifiche.
Perciò le proprietà degli antigeni non sono direttamente determinate dai geni A, B, o
O, ma sono determinate geneticamente dalla presenza e dall‟attività delle
glicosiltransferasi. Il trasferimento del substrato N-acetilgalactosamina via transferasi
A e del D galattosio via transferasi B caratterizza il gruppo del sangue A o B. Se una
persona mostra entrambe le transferasi, lui/lei appartiene al gruppo del sangue AB,
se lui/lei non mostra ne transferasi A o B, lui/lei appartiene al gruppo del sangue O.
I geni per le transferasi A e B si trovano sul braccio lungo del cromosoma 9 (9q34) e
sono costituiti da sette esoni con una lunghezza totale di 1065 paia di basi. Le
mutazioni più significative (sostituzioni di base, delezioni, inserimenti) si trovano
nell‟esone 6 e 7.
In letteratura sono descritti cinque principali alleli: ABO*A101, ABO*A201,
ABO*B101, ABO*O01, e ABO*O03 e ci sono numerose varianti e sottogruppi [1-13].
Il BAGene ABO-TYPE e il BAGene ABO-TYPE variant permettono la
determinazione di questi cinque principali alleli in biologia molecolare, così come
l‟allele comune ABO*O02 e il sottogruppo A e B (per es. A3, Ax, Ael, Aw, B3, Bx, Bw)
3 di 29
varianti. Attualmente non c‟è una nomenclatura ufficiale per gli alleli ABO*. Oltre alla
nomenclatura descritta in queste istruzioni d‟uso ne esiste un‟altra.
Il
Database
Blood
Group
Antigen
Gene
Mutation
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/mhc/xslcgi.cgi?cmd=bgmut/systems_info&system=abo
è costantemente aggiornato con l‟elenco di tutti gli alleli AB0 pubblicati.
Determinazione in genetica molecolare dei genotipi RH
Per la forte immunogenicità dell‟antigene D e per l‟elevata immunizzazione di individui
D-negativi dopo trasfusione di eritrociti D-positivi, la determinazione degli alleli RHD è
di grande importanza [34].
L‟immunizzazione delle persone D-negative si verifica per esempio
nelle trasfusioni di eritrociti D-positivi
nelle gravide D-negative con feto D-positivo
Una determinazione molecolare attendibile del D contribuisce alla prevenzione delle
immunizzazioni. Inoltre, le emazie concentrate D-negative possono essere assegnate
con maggiore precisione. Ultima ma non meno importante, la tipizzazione degli alleli
RHCE contribuisce alla validazione di risultati sierologici incerti e deboli.
La differenza tra D+/D+ e D+/D-
nei partners di madri D-negative tramite la
determinazione del D-zygosity, è di importanza clinica rilevante per la valutazione dei
rischi di MHN (Morbus Haemolyticus Neonatorum) [38] e contribuisce al
miglioramento della cura durante la gravidanza.

BAGene RH-TYPE
I due geni RH RHD e RHCE si trovano sul braccio corto del cromosoma 1 (p34.3 a
p36.1) [14]. Le loro estremità 3„ sono allineate e separate l‟una dall‟altra da 30,000
paia di basi. In questa zona si trova un altro gene (SMP1), che codifica per una
proteina di membrana [26]. Il gene RHD codifica per l‟antigene D; il gene RHCE
codifica per gli antigeni C, c, E, e. I geni RHD e RHCE sono costituiti da 10 esoni
ciascuno, di 69 kilobasi.
4 di 29
Approssimativamente il 18% degli Europei sono sierologicamente D-negativi. In
quasi tutti i Caucasici RhD-negativi, generalmente il gene RHD
è assente su
entrambi i cromosomi [28].
In altri gruppi etnici (Africani, Asiatici) e con una bassa frequenza anche negli
Europei, è stata determinata la presenza di un gene RHD similare non funzionante in
individui fenotipicamente RhD-negativi (Cdes, RHD ) [14, 15, 20, 21, 26-28, 30,
32-34]. BAGene RH-TYPE permette la determinazione molecolare degli alleli
standard RHD/RHCE così come la tipizzazione di alcuni RHD-varianti quali DVI, DIV
type 3, Cdes, RHD , RHD(W16X), RHD-CE(8-9)-D, RHD-CE(3-7)-D [33] e DEL
types ad es. RHD(K409K), RHD(M295)I, RHD(IVS3+1G>A) [35]. E‟ inoltre inclusa la
determinazione di Cw. Se l‟insieme della reazione indica un D, si dovrebbe eseguire
un‟ulteriore test usando il BAGene Partial D-TYPE per escludere mutazioni
puntiformi che potrebbero dare origine a questo risultato.
La figura 2 A mostra la struttura genomica e la disposizione dei geni RHD e RHCE
nell‟aplotipo RHD-positivo
La figura 2 B mostra un modello della struttura del gene nell‟aplotipo RHD-negativo
A
SMP1
RHD
B
SMP1
RHCE
RHCE
Upstream Rhesus Box
Downstream Rhesus Box
Hybrid Rhesus Box
Figura 2: Modello della struttura del gene RHD e RHCE [acc. a 26, 27]
5 di 29

BAGene Partial D-TYPE e BAGene Weak D-TYPE
Le variazioni della struttura dell‟antigene RhD sono sia un parziale (partial D) sia un
debole (weak D) fenotipo D.
La valutazione molecolare di questi D-varianti hanno mostrato che i fenotipi D deboli
così come alcuni tipi D parziali sono causati da mutazioni puntiformi. In altri tipi D
parziali, uno o più
segmento del
esoni del gene RHD
gene RHCE,
sono scambiati con il corrispondente
formando così una proteina di fusione RhD-CE-D.
In queste proteine di fusione, mancano gli epitopi della proteina completa RhD.
Perciò individui con tali tipi D parziali (per es. con la categoria D VI clinicamente
rilevante) possono essere immunizzati tramite una trasfusione di eritrociti con la
proteina completa RhD [16, 22, 34].
Come descritto in letteratura, la sostituzione degli aminoacidi nei fenotipi D parziali si
trova principalmente nella zona extracellulare della proteina RhD; la sostituzione
degli aminoacidi nei tipi D deboli generalmente si trova nella zona intracellulare o
nella parte transmembrana [22, 23, 25, 26, 28-31, 35].
BAGene Partial D-TYPE permette la determinazione molecolare delle D parziali ad
es. DII, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DAU, DBT, DFR, DHMi, DHMii, DNB e
DHAR (Rh33) [16, 17, 19, 20, 22, 24, 25, 28, 36, 37]. Attualmente non è possibile
una differenziazione molecolare dei D-varianti DCS, DFW, DIM, DNU dall‟RHD
standard. La considerazione degli aplotipi può essere utile allo scopo.
BAGene Weak D-TYPE permette la determinazione molecolare dei tipi D deboli ad
es. 1, 2, 3, 4.0/4.1, 4.2, 5, 11, 15, e 17.

BAGene D Zygosity-TYPE
Nell‟aplotipo RhD positivo, il gene RHD è affiancato da due segmenti di DNA
altamente omologhi, i cosiddetti Rhesus Boxes, che si trovano alla estremità 5„
(Upstream Rhesus Box) e alla estremità 3„ (Downstream Rhesus Box) del gene
RHD (vedi Figura 2 A). Nei Caucasici RhD-negativi, il gene RHD
completamente deleto su entrambi i cromosomi.
6 di 29
è in genere
Ciò risulta in un Hybrid Rhesus Box, che include la
estremità 5‟ dell‟Upstream
Rhesus Box e la estremità 3‟ del Downstream Rhesus Box (vedi Figura 2 B) [26, 27,
38]. Il BAGene D Zygosity-TYPE permette la determinazione del
D-zygosity
(D omozigote o eterozigote) tramite la determinazione positiva rispettivamente del
Downstream Rhesus Box (DD) o del Hybrid Rhesus Box (dd) o del Downstream
e del Hybrid Rhesus Box (Dd). In caso di un Hybrid Rhesus Box mancante nella
popolazione nera, bisogna tenere in considerazione gli alleli RHD
e Cdes ottenuti
col BAGene RH-TYPE. Altri alleli RHD negativi dell‟antigene D non possono essere
esclusi con i kits attualmente disponibili. Questo va preso in considerazione
nell‟interpretazione dei risultati. Comunque l‟incidenza di questi alleli nella
popolazione bianca è abbastanza bassa [33, 38].
Determinazione in genetica molecolare delle caratteristiche inerenti al sistema
di gruppo sanguigno Kell, Kidd e Duffy (KKD)
Gli antigeni più importanti del sistema Kell sono KEL*1 (K) e KEL*2 (k – Cellano),
dove il KEL*1 è di grande interesse per la sua forte immunogenicità.
Gli alleli antitetici del sistema Kidd sono chiamati JK*A e JK*B (Jka, Jkb).
Le caratteristiche più significative del sistema Duffy sono FY*A e FY*B (Fya, Fyb).
Gli anticorpi, diretti contro gli antigeni del sistema KKD provocano sia reazioni di
trasfusioni emolitiche e/o gravi casi di MHN.
Perciò una determinazione affidabile di questi antigeni nei campioni di sangue da
donatori e pazienti è di grande interesse.

BAGene KKD-TYPE [39-56]
La differenza significativa tra KEL*1 e KEL*2 (nomenclatura sierologica K e kCellano), è data da una sostituzione di base singola nell‟esone 6 del suo antigene.
Il sistema Kidd si trova sul cromosoma 18 e consiste di tre specificità Jka, Jkb, Jkdifferenti. Gli alleli JK*A, JK*B dei sistemi-Kidd differiscono in una sostituzione
singola di aminoacidi alla posizione 280 dell‟antigene.
7 di 29
Il gene FY è localizzato sul cromosoma 1. Consiste negli alleli FY*A, FY*B, FY*X e
FY*zero01 che potrebbero essere rappresentate reciprocamente al locus del gene.
Per quanto riguarda la nomenclatura sierologica l‟allele FY*A corrisponde all‟antigene
Fya e l‟allele FY*B all‟antigene FYb. L‟allele FY*X (Fyx) espresso debolmente è
determinato sierologicamente come Fybweak. Nella popolazione africana, si può
osservare il fenotipo Fy(a-b-) con una frequenza del 68%, mentre in Europa, il Fy(ab-) si verifica estremamente di rado (<0,1%). Individui con questo allele silenzioso
chiamato FY*zero01 sono resistenti al patogene della Malaria tertiana (Plasmodium
vivax), dovuto alla mancanza di un antigene determinante.
In contrasto alle tecniche sierologihe il BAGene KKD-TYPE permette una
identificazione chiara degli alleli immunologici rilevanti Fybweak (Fy*X) e FY*zero01.
Il kit BAGene KKD-TYPE permette di determinare le seguenti caratteristiche:
Kell (k,k) – KEL*1 e KEL*2; Kidd (Jka, Jkb) – JK*A e JK*B; Duffy (Fya, Fyb, Fyzero,
Fyx) – FY*A, FY*B, FY*zero01 e FY*X
Determinazione in genetica molecolare delle caratteristiche inerenti il
sistema di gruppo sanguigno MNS
Gli antigeni M ed N furono scoperti nel 1927 da Landsteiner e Levine [57], S ed s nel
1947 da Walsh e Montgomery [58]. Le glicoforine umane sono le principali
sialoglicoproteine espresse sulla superficie dei globuli rossi che portano antigeni del
sistema di gruppo sanguigno MNS [59]. La Glicoforina A (GPA) si presenta in due
forme alleliche che portano l‟antigene M o N; la Glicoforina B (GPB) si presenta
anch‟essa sotto forma di due alleli che portano gli antigeni S o s. GPA e GPB sono
codificate da GYPA e GYPB, rispettivamente: tali geni sono membri di una famiglia
genica localizzata sul cromosoma 4 [60].

BAGene MNS-TYPE [57-60]
Il kit consente la determinazione dei quattro principali alleli del sistema MNS
(M, N, S ed s) sfruttando le tecniche di genetica molecolare.
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Determinazione in genetica molecolare delle specificità HPA
Le
alloimmunotrombocitopenie
come
l‟alloimmunotrombocitopenia
neonatale,
purpura post-trasfusionale o condizioni refrattarie dopo trasfusioni di trombociti sono
causate da anticorpi diretti contro gli antigeni piastrinici umani,
che si possono
formare nell‟ambito di trasfusioni o gravidanze. Per assegnare emocomponenti
idonei per i pazienti con questo tipo di malattie è necessaria una determinazione
attendibile delle specificità HPA [61-66].

BAGene HPA-TYPE
Gli antigeni HPA (Human Platelet Antigen) trombocitari rappresentano un gruppo di
marcatori allelici polimorfici localizzati sulle glicoproteine trombocitarie umane
GPIIb/IIa, GPIa, GPIb , e GPIb . I polimorfismi sono basati su mutazioni puntiformi
che danno origine a diversi aminoacidi [65].
Il BAGene HPA-TYPE permette la determinazione molecolare delle specificità
ad es. HPA-1a/b, HPA-2a/b, HPA-3a/b, HPA-4a/b,HPA-5a/b, HPA-15a/b.
Determinazione in biologia molecolare delle specificità HNA
La neutropenia alloimmune neonatale (NIN) e l‟edema polmonare acuto posttrasfusionale (TRALI) sono causati da alloanticorpi diretti contro antigeni neutrofili
umani, formati durante la gravidanza o trasfusi a riceventi, rispettivamente. La TRALI
severa è spesso causata da anticopi nei componenti sanguigni diretti contro
l‟alloantigene HNA-3°. Per via della semplicità ed affidabilità del test in genetica
molecolare per le specificità HNA, questo è consigliato nello screening del sangue
dei donatori per diminuire il rischio connesso a TRALI e come supporto alla diagnosi
e all‟assegnazione opportuna di componenti sanguigni per i pazienti [67-71].
9 di 29

BAGene HNA-TYPE extra3
Gli antigeni granulocitari HNA (human neutrophil antigens) costituiscono un
gruppo di marcatori allelici polimorfici, localizzati sulla superficie dei granulociti
neutrofili umani. Gli alloantigeni di rilevanza clinica sono HNA-1a, -1b, -1c (NA1, NA2
e SH) presenti sulla glicoproteina Fc RIIIb [67, 68], HNA-3a, -3b (5b, 5a) (choline
transporter-like protein-2-gene CTL2) [69]. Ulteriori antigeni clinicamente importanti
sono HNA-4a (Mart) e HNA-5a (Ond), che appartengono alla famiglia delle
2-
integrine [70, 71].
BAGene HNA-TYPE extra3 consente la determinazione in biologia molecolare
delle specificità ad es. HNA-1a/b/c, HNA-3a/b, HNA-4a/bw, HNA-5a/bw.
2.
Materiale
2.1
Contenuto del BAGene DNA-SSP Kits
10/20 BAGene piastre/strisce sufficienti per 10/20 tipizzazioni. Le mixes di
reazione prealiquotate e liofilizzate includono i primers allale-specifici, i primers del
controllo interno (specifici per il gene HGH - Human Growth Hormone [76] - e la
sequenza genomica del cromosoma I, rispettivamente 90.000 bp 5‟ della Rhesus
Box) e i nucleotidi. La prima mix di reazione è contrassegnata della stampa del
numero di lotto.
PCR-buffer 10 x sufficiente per 10/20 tipizzazioni
12 strisce di tappi da 8 sufficienti per 10/20 tipizzazioni
Istruzioni d‟uso, fogli di lavoro e diagramma d‟interpretazione.
2.2
Matariale necessario supplementare
Taq Polymerase (5 U/µl, per es. Qiagen), non usare una Taq Polimerasi hot start
BAG EXTRA GENE Kit (facoltativo) per l‟estrazione del DNA da sangue / linfociti /
leucociti o altro materiale per altri metodi di estrazione di DNA
DNA length standard
Pipette (0,5-250 µl)
Punte sterili con filtro
10 di 29
Termociclatore (per es. PTC 200 con coperchio termostatato , MJ Research /
Bio-Rad)
Strumenti e materiale per l’elettroforesi del gel
Agarosio
TBE buffer 0.5 x (45 mM di Tris, 45 mM di acido borico, 0,5 mM di EDTA)
Etidiobromuro (EtBr)
Cella elettroforetica
Alimentatore (200-300 V, 200 mA)
Strumenti per l’interpretazione e la documentazione
Transilluminatore (220-310 nm)
Macchina fotografica (per es. sistema Polaroid) con pellicole (Polaroid tipo 667)
2.3.
Conservazione e stabilità
Il kit è fornito senza ghiaccio secco. Conservare tutti i reagenti –20/-80°C. La data di
scadenza è indicata sull‟etichetta di ogni reagente.
La data di scadenza indicata
sull‟etichetta esterna è valida anche dopo il primo utilizzo e si riferisce al reagente
contenuto nel kit con la stabilità più breve. Scongelare brevemente il PCR-buffer 10 x
prima dell‟uso.
3.
Dati per l’esecuzione
sensibilità analitica :
Viene garantita una tipizzazione attendibile usando 50 - 100 ng
di DNA per ciascuna mix di reazione. Dato che con il kit
BAGene D-Zygosity-TYPE si usa un programma di PCR più
lungo, si raccomanda di partire da una concentrazione di DNA
inferiore (30-50 ng).
11 di 29
specificità diagnostica:
La
composizione
delle
mixes
dei
primers
garantisce
un‟identificazione attendibile degli alleli indicati nei fogli di lavoro
e nel diagramma d‟interpretazione.
La sensibilità diagnostica e la specificità di ogni mixes di primers è stata testata con DNA
di campioni di riferimento. Gli alleli non disponibili, che per la loro rarità non sono stati
testati, sono indicati nel foglio di lavoro e nel diagramma d‟interpretazione con n.t.(non
testati). Per tutti i BAGene DNA-SSP Kits è stato eseguito uno studio della performance
con più di 1000 campioni pretipizzati. Le ricerche hanno mostrato risultati chiari in
relazione alle pretipizzazioni sierologiche e/o genomiche.
4.
Procedura del test
4.1
Condizioni di sicurezza ed indicazioni speciali
La PCR è un metodo molto sensibile che dovrebbe essere eseguito da personale
debitamente addestrato con esperienza in tecniche di biologia molecolare e sierologia dei
gruppi del sangue. Dovrebbero essere seguite le linee guida della medicina trasfusionale e
della determinazione dei gruppi del sangue così come quelle dell‟anamnesi trasfusionale
per evitare rischi di false tipizzazioni, in particolar modo in caso di discrepanze nei risultati
tra metodo sierologico e quello in biologica molecolare. La genotipizzazine delle specificità
ABO e RHD/RHCE così come Kell, Kidd, Duffy, MNSs, HPA e HNA vanno eseguite dopo
la determinazione sierologica.
Limiti generali nella tipizzazione molecolare con l’uso dei BAGene DNA-SSP Kits:
Se usando i BAGene DNA SSP Kits non si ottengono dei risultati chiari (per es. a causa di
alleli sconosciuti che non possono essere determinati con i primers esistenti), si
dovrebbero seguire le linee guida nazionali per le trasfusioni in relazione alle tipizzazioni
sierologiche. Si consiglia l‟analisi del sequenziamento di questi campioni.
12 di 29
Limiti nella determinazione del gruppo del sangue ABO:
Poiché solo una selezione di alleli A varianti può essere determinato dal BAGene ABO
variant, altri alleli A varianti possono essere nascosti dietro il risultato PCR A1. Poiché solo
una selezione di alleli B varianti e nessun allele A2 variante può essere determinato dal
BAGene ABO variant, altri alleli B varianti o alleli A2 varianti possono essere nascosti
rispettivamente dietro i risulati PCR B1 e A2. Anche la maggior parte di alleli B(A) e cis AB
mostrano un risultato positivo nella reazione B1.
Limiti ed osservazioni nella tipizzazione D zygosity:
Negli alleli RHD, che non possono essere determinati con il metodo sierologico (RhD
neg.), può verificarsi una discrepanza tra il risultato del test sierologico e la tipizzazione
genomica. La determinazione positiva del Downstream Rhesus Box mostra la
presenza di un allele RHD (RHD pos.), tranne RHD
rispettivamente omozigote e
emizigote. In questo caso la reazione è negativa anche in presenza di allele RHD.
Inoltre, il risultato con un Downstream Rhesus Box modificato geneticamente potrebbe
essere anche un falso negativo, anche se il campione è sierologicamente D-positivo.
Così, con un risultato sierologico D-positivo e una PCR positiva per l‟Hybrid Rhesus
Box, il risultato è quindi “Dd”. Con una
PCR negativa per l‟Hybrid Rhesus Box il
risultato è “DD”.
A causa di un polimorfismo caratteristico nel Hybrid Rhesus Box degli Africani,
potrebbe verificarsi un risultato falso positivo in presenza di un RHD
e un ulteriore
allele RHD.
Il DNA degradato può portare a risultati falsi negativi di entrambi il Downstream Rhesus
Box e l‟Hybrid Rhesus Box. Questo è indicato o solo dalle bande del controllo interno, o
dalle bande mancanti.
Limiti ed osservazioni nella tipizzazione D parziale:
Una banda mancante nella reazione nr. 4 potrebbe indicare DFR (positivo debole con antiD) o RHD
(hemi- o omozigote, D negativo in sierologia). Se manca un‟informazione
sierologia, è possibile ottenere una conferma o un‟esclusione con l‟uso del BAGene
13 di 29
RH-TYPE. In caso di un weak D type 41 e 45 può verificarsi assenza di reazione nella mix
n° 9. In caso di weak D type 20 potrebbe essere assente la banda di reazione nella mix
n° 10.
Si devono osservare condizioni speciali di sicurezza per evitare contaminazioni e perciò
false reazioni:
Indossare i guanti durante il lavoro (se possibile senza talco)
Usare un nuovo puntale con filtro per ogni campione
Usare aree di lavoro separate per la pre-amplificazione (estrazione del DNA e
preparazione
delle
reazioni)
e
post-amplificazione
(elettroforesi
del
gel,
documentazione); usare preferibilmente due stanza separate
Usare strumenti ed altro materiale solo nelle rispettive aree e non scambiarli
4.2 Estrazione del DNA
Per le tipizzazione del BAGene sono necessari 5-10 µg di DNA (corrispondenti
approssimativamente a 0.5 ml di sangue). Per es. il BAG EXTRA-GENE kit è ideale per
l‟estrazione del DNA puro ottenibile da sangue intero in breve tempo senza l‟uso di
reagenti chimici tossici e solventi. Inoltre, altri metodi descritti in letteratura [72] come il
metodo
chloroform-triethyl-ammonium-bromide
(CTAB)
o
la
purificazione
fenolo-
cloroformio sono idonei per fornire una sufficiente purezza del DNA. L‟eparina
potenzialmente inibisce la PCR [73]. Perciò per la tipizzazione si consiglia sangue in EDTA
o in citrato. Il DNA dovrebbe avere una purezza tra 1.5 e 2.0 (extinction ratio
OD260/OD280).
4.3 Amplificazione
Tutte le mixes di reazione prealiquotate e liofilizzate contengono i primers allele-specifici,
primers di controllo interno e i nucleotidi. Questi sono forniti liofilizzati adesi nel fondo delle
provette di reazione. I parametri di amplificazione sono ottimizzati per un volume finale di
10 µl.
14 di 29
Prelevare il numero richiesto di piastre BAGene da –20/-80°C e scongelare il
1.:
PCR-buffer 10 x a temperatura ambiente.
2.:
Preparare la Master-Mix costituita da PCR-buffer 10x, soluzione di DNA, TaqPolymerase e acqua distillata e miscelare bene. I differenti BAGene DNA-SSP Kits
funzionano tutti con la stessa Master-Mix e perciò possono essere combinati. La
composizione della Master-Mix dipendente dal numero di mixes di reazioni (vedi
Tabella 1).
Tabella 1:
Composizione della Master-Mix in funzione del numero di mixes
n°di
mixes
Acqua dist.
PCR-buffer 10x
Soluzione DNA
(50-100 ng/µl)♦
Taq-Polymerase
(5 U/µl)
Volume
totale
1
8
1
1
0,08
10
µl
2
16
2
2
0,2
20
µl
6
50
7
7
0,5
65
µl
8
80
10
10
0,8
100
µl
9
88
11
11
0,9
110
µl
10
96
12
12
1,0
120
µl
11
104
13
13
1,0
130
µl
12
112
14
14
1,1
140
µl
13
128
16
16
1,3
160
µl
14
136
17
17
1,4
170
µl
15
144
18
18
1,4
180
µl
16
152
19
19
1,5
190
µl
 per concentrazioni di DNA diverse, le quantità di DNA e di acqua devono variare in
proporzione (per es. per 12 mixes: DNA (120 ng/µl): usare 5,8 µl di DNA e 119 µl di
Acqua dist.).
 si consiglia una preparazione minima di mastermix per 6 mixes di reazione, per il basso
volume di Taq-Polymerase.
♦ per il kit BAGene D Zygosity-TYPE si consiglia una concentrazione di DNA di 30 – 50
ng/µl
15 di 29
3.:
Dopo aver vortexato la mastermix dispensare 10 µl di questa miscela nelle provette
di reazione preseminate. Cambiare il puntale dopo ogni semina. Chiudere bene le
provette con i rispettivi tappi. Assicurarsi di
non toccare con le dita la parte interna dei
Marking 
tappi ed il bordo superiore delle provette per
evitare
contaminazione.
Se
si
usa
 
 
.
 .
 .
 .
 .
 .

un
termociclatore con coperchio a chiusura
ermetica, è anche possible usare PCR mats
riciclabili.
Scuotere
leggermente
la
piastra
N°
lotto
per
dissolvere il pellet blue sul fondo della
provetta. Tutte le miscele di reazione PCR
dovono depositarsi sul fondo.
4.:
Mettere le provette di reazione nel termociclatore e chiudere il coperchio in modo che
le provette non si deformino riscaldandosi. Avviare il programma di PCR. Se si
utilizza un coperchio termostato non è necessario aggiungere olio minerale nelle
provette!
Parametri
di
amplificazione
per
tutti
i
BAGene
DNA-SSP
Kits
ad
eccezione
del D Zygosity-TYPE
Programma
Tempo Temp.
Numero di cicli
Prima denaturazione
5 Min
96°C
1 ciclo
Tipi di
Denaturazione
10 Sec
96°C
5 cicli
termociclatori:
Annealing+Estensione 60 Sec
70°C
Denaturazione
10 Sec
96°C
Annealing
50 Sec
65°C
Estensione
45 Sec
72°C
Denaturazione
10 Sec
96°C
Annealing
50 Sec
61°C
Estensione
45 Sec
72°C
Estensione finale
5 Min
72°C
per es. PTC 100 / 200
10 cicli
(MJ Research/Bio-Rad),
GeneAmp PCR-
15 cicli
System 9600 / 9700
(ABI Co.) e Mastercycler
1 ciclo
16 di 29
epGradient S (Eppendorf)
ATTENZIONE: Programma di PCR diverso !
Parametri di amplificazione D Zygosity-TYPE
Programma
Tempo
Temp. Numero di cicli
Prima denaturazione 10 Min
95°C
1 ciclo
Denaturazione
20 Sec
92°C
35 cicli
Annealing
30 Sec
64°C
Estensione
5 Min
68°C
Estensione finale
5 Min
72°C
Tipi di termociclatori:
per es. PTC 100 / 200
(MJ Research/ Bio-Rad),
GeneAmp PCR- System
9600 / 9700 (ABI Co.) e
1 ciclo
Mastercycler epGradient S
(Eppendorf)
Poichè i termociclatori di produttori diversi hanno performance diverse ed anche i
singoli apparecchi dello stesso tipo possono funzionare in modo diverso, potrebbe
essere necessario ottimizzare i parametri di amplificazione.
Per ottimizzare il Vs. apparecchio seguire le seguenti istruzioni:
Con reazioni false positive (bande non specifiche aggiuntive): aumentare la temperatura
di annealing di 1° C.
Con reazioni false negative (bande assenti): diminuire la temperatura di annealing di 1° C
e/o aumentare i tempi di annealing di 5 secondi e/o aumentare i tempi di denaturazione di
5 secondi.
Si consiglia di usare solo termociclatori regolarmente calibrati. Per questa
procedura di calibrazione è ideale il BAG CYCLER CHECK kit (Cat.-No.: 7104).
I test per il controllo della qualità sono stati eseguiti con i seguenti termocilatori:
rispettivamente PTC 200 e PTC 100 (MJ Research/Bio-Rad), 9700 (ABI) e
Mastercycler epGradient S (Eppendorf).
4.4
Gel elettroforesi
La separazione dei prodotti di amplificazione si esegue tramite gel di agarosio in
elettroforesi orizzontale. Si consiglia come tampone per l‟elettroforsi TBE 0.5x (45 mM di
tris, 45 mM di acido borico, 0.5mM di EDTA). La concentrazione del gel dovrebbe essere
17 di 29
2.0 – 2.5% di agarosio. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 30 minuti
caricare il campione.
prima di
Al termine dell‟amplificazione, prelevare i campioni dal
termociclatore e caricare con attenzione ciascuna miscela di reazione in ogni pozzetto del
gel. Inoltre, caricare 10 µl di DNA length standard per la valutazione del peso molecolare.
L‟elettroforesi è eseguita a 10-12 V/cm (per es. con elettrodi distanti 20 cm impostare 200240V), per 20-40 minuti. Per migliorare la separazione delle bande che si ottengono con il
kit D-Zygosity-TYPE è preferibile una corsa della durata di 40 minuti.Al termine della
corsa, il gel viene immerso in una soluzione di etidiobromuro (EtBr) (circa 0.5 µg/ml di EtBr
in H2O o buffer TBE). In alternativa, l‟EtBr (0.5 µg/ml) può essere aggiunto al buffer per
l‟elettroforesi o al gel di agaorosio. Se necessario rimuovere l‟EtBr
in eccesso
immergendo il gel in H2O per 20-30 minuti.
4.5
Documentazione ed interpretazione
Per la documentazione, visualizzare il prodotto di PCR usando un transilluminatore UV
(220-310 nm) e fotografare con una macchina fotogratica, filtri ed una pellicola adatti (per
es. polaroid, pellicola tipo 667). Scegliere i tempi di esposizione e di apertura in modo che
le bande siano bene visibili e risaltino sul sfondo scuro (per es. apertura 11, tempo
d‟esposizione 1 sec).
Per l‟interpretazione usare il diagramma; sono da considerare positive sole le bande che
hanno un peso molecolare corretto in confronto al DNA length standard. Le dimensioni
corrette sono indicate nel foglio di lavoro e nel diagramma d‟interpretazione. In ogni
reazione senza amplificazione allele-specifica il controllo interno deve risultare di 434 bp
(eccetto il D Zygosity-TYPE e la 2° reazione del RH-TYPE: qui la lunghezza del
frammento del controllo interno è di 659 bp). Nelle reazioni con una positività allelespecifica il controllo interno è generalmente più debole, o potrebbe scomparire
completamente a causa della competizione delle diverse
vedere la “Soluzione dei problemi” 6.).
18 di 29
PCR! Per risultati anomali
4.6 Spiegazione dei fogli di lavoro e dei diagrammi d’interpretazione

Generale
I risultati delle determinazioni molecolari eseguiti tramite i BAGene DNA-SSP Kit sono
documentati nei fogli di lavoro forniti.
Per favorire l‟interpretazione vengono forniti nei fogli di lavoro l‟elenco delle caratteristiche,
le specificità, il fenotipo, il genotipo, la combinazione delle reazioni, e alcuni esempi. Le
mixes di reazione sono indicate con un numero (per es. ABO-TYPE reazione n. 1 - 8).
La lunghezza del prodotto di PCR (bande specifiche) è espresso in bp. Nelle righe sotto
sono indicate possibili combinazioni di reazione. I prodotti di PCR specifici (reazioni
positive) sono contrassegnati con
+
ed i corrispondenti riquadri del diagramma sono
colorati (ABO-TYPE, ABO-TYPE variant, Partial D-TYPE, Weak D-TYPE, KKD-TYPE, D
Zygosity-TYPE, HPA-TYPE, HNA-TYPE extra3 – verde, RH-TYPE anche in rosso, rosa e
blu.
L‟assenza di amplificati specifici è contrassegnata con
-
L‟interpretazione è da leggersi da sinistra verso destra (indicata con frecce rosse nei fogli
di lavoro) ed è da trascivere nel riquadro del risultato insieme ai dati del campioni e la
fotografia del gel.

BAGene ABO-TYPE [8] e BAGene ABO-TYPE variant [6,7,10,13]
L‟omozigosi degli alleli ABO*O01, ABO*O03, ABO*B101, ABO*A201 è indicata dalle
corrispondenti bande di reazione specifiche (1, 3, 5, e 7). In caso di eterozigosi le
„non-reazioni“ devono essere tutte e quattro positive (2, 4, 6, 8) insieme a due
reazioni specifiche (1, 3, 5, e 7). L‟omozigosi dell‟allele ABO*A101 è indicata solo
dalle quattro “non-reazioni” (2, 4, 6, 8), poiché non c‟è una reazione specifica per
l‟ABO*A101. L‟etorezigosi con l‟allele ABO*A101 può essere riconosciuta dalla
presenza di una sola banda addizionale delle reazioni allele-specifiche (1, 3, 5, 7, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16). Le spiegazioni dettagliate sono descritte in istruzioni
extra per l‟interpretazione del BAGene ABO-TYPE variant, incluse in ogni kit.
Consultare comunque
le osservazioni speciali sul foglio di lettura del BAGene
ABO-TYPE e il protocollo risultati del BAGene ABO-TYPE variant.
19 di 29
Si deve tenere conto dei limiti della determinazione molecolare ABO (vedi pag. 13).
Una banda specifica per HGH con un frammento lungo 434 bp è un controllo interno.

BAGene RH-TYPE [18, 20, 32, 33, 35]
La determinazione molecolare del‟ RHD standard così come quella di alcuni RHDvarianti (aplotipi RHD-positivi in campioni D-negativi sierologici, D parziali) si esegue
nelle reazioni di PCR specifiche.
Le reazioni 1 e 2 sono delle Multiplex-PCR per esaminare cinque polimorfismi RHD
(RHD introne 4 e 7, esone 7, così come la determinazione specifica del
RHD
(W16X) e RHD ). Questo significa, che a differenza di tutti gli altri BAGene DNASSP Kits (eccetto che per la banda del controllo interno) in una reazione di PCR
possono verificarsi non solo una, ma anche due reazioni specifiche. Per agevolare
l‟interpretazione, i rispettivi riquadri sono divisi quando appaiono due possibili bande
ed hanno uno sfondo di due colori diversi. Le lunghezze dei prodotti di PCR ed i
polimorfismi sono identificati con lo stesso colore specifico in relazione ai riquadri.
Esempio RHD :
Reazione N. 1: Devono apparire due bande specifiche nel gel.
prodotto di PCR 224 bp – evidenziato in verde, campione
+
della reazione nel riquadro con sfondo verde
prodotto di PCR 123 bp – evidenziano in blu, campione
+
della reazione nel riquadro con sfondo blu
Reazione N. 2: Devono apparire due bande specifiche nel gel.
prodotto di PCR 154 bp – evidenziato in rosso, campione
+
della reazione nel riquadro con sfondo rosso
prodotto di PCR 390 bp – evidenziato in verde, campione
della razione nel riquadro evidenziato in verde
20 di 29
+
Specifiche reazioni si usano per la determinazione molecolare del gene RHCE. Una
banda specifica per HGH, con una lunghezza del frammento di 434 bp è il controllo
interno
Fa eccezione la reazione n. 2: qui la banda del controllo interno è di 659 bp (specifica
per la sequenza genomica del cromosoma I, 90,000 bp 5„della Rhesus Box).

BAGene Partial D-TYPE [20, 22, 24, 25, 28, 35-37 ], Weak D-TYPE [23, 25, 31], D
Zygosity-TYPE
[38],
KKD-TYPE
[56],
MNS-TYPE
[59],
HPA-TYPE
[66],
HNA-TYPE extra3 [67]
Vedere il capitolo „Generale“ a pagina 19.
5. Avvertenze e precauzioni
L‟etidiobromuro è un potente mutageno. Evitare il contatto con la pelle e contaminazioni.
Consultare le avvertenze, le precauzioni e le istruzioni d‟uso del produttore. Il
transilluminatore UV emette onde molto corte che possono causare bruciature alla pelle e
alla retina. Usare una maschera per la protezione facciale UV!
Tutti i materiali biologici impiegati per l‟estrazione del DNA, per es. sangue o tessuto
umano, devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si consigliano precauzioni
di sicurezza appropriate quando si maneggiano materiali biologici (non pipettare con la
bocca; indossare guanti monouso quando si maneggia materiale biologico e si esegue il
test; al termine del test disinfettare le mani).
Il materiale biologico deve essere inattivato prima dello smaltimento (per es. in autoclave).
Il materiale smaltito deve essere autoclavato dopo l‟uso.
La fuoriuscita di materiale potenzialmente infetto deve essere rimosso immediatamente
con carta assorbente e le aree contaminate pulite con un disinfettante standard o con
etanalo al 70%. Il materiale usato per pulire le fuoriuscite, incluso i guanti, deve essere
inattivato prima dello smaltimento (per es. in autoclave).
21 di 29
6. Soluzione dei problemi
Problema
Possibile causa
Soluzione
nessuna amplificazione,
DNA contaminato con inibitori di PCR
ripetere l‟estrazione del DNA,
length standard visibile
DNA degradato
provare metodi diversi
concentrazione di DNA
modificare la concentrazione di DNA /
troppo alta / troppo bassa
ripetere l‟estrazione di DNA
enzima mancante
ripetere la tipizzazione, modificare la
o concentrazione troppo bassa
concentrazione dell‟enzima
DNA da sangue in eparina
ripetere la tipizzazione con sangue in
EDTA
parametri di amplificazione errati
ottimizzare i parametri di amplificazione
(vedere 4.3) 
Ripetuto insuccesso in
perdita nelle provette di reazione;
ciascun pozzetto (nessun
evaporazione di acqua e variazione
della concentrazione durante la PCR
controllo di amplificazione)
amplificazione
aspecifica, contaminazione
bande addizionali,
(bande
dimensioni
prodotti
di DNA contaminato con sali
devono
essere tralasciate)
di ripetere la tipizzazione,assicurarsi
dell‟esatta procedura del lavoro
amplificazione
addizionali
errate
con
chiudere bene le provette con i tappi
ripetere l‟estrazione di DNA,
provare metodi diversi
concentrazione di DNA troppo alta
usare meno DNA
concentrazione dell‟enzima troppo alta usare meno enzima
parametri di amplificazione errati
ottimizzare i parametri di amplificazione
(vedi 4.3) 
l‟interpretazione mostra più
-contaminazione carry-over
controllare la Master Mix
di 2 specificità
-(prodotti di amplificazione!)
(senza aggiunta di DNA)
-nuovo allele
assicurarsi dell‟esatta procedura del
lavoro
nessuna banda visibile o
colorazione EtBr troppo debole
ripetere la colorazione
molto debole, length
standard invisibile
lo sfondo del gel è troppo colorazione troppo forte,
immergere il gel in H2O o TBE per
chiaro
concentrazione di EtBr troppo alta
diminuire la concentrazione di EtBr
bande confuse
-buffer per elettroforesi troppo caldo
diminuire il voltaggio
-errato buffer per elettroforesi
usare buffer TBE 0,5 x
 Quando si usano gli strumenti e i materiali elencati, considerare come ultima possibilità l‟ottimizzazione
dei parametri di amplificazione. In molti casi, è possibile interpretare il test eliminando le bande addizionali
che hanno pesi molecolari non corretti.
22 di 29
7.
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8. Spiegazione dei Simboli
IVD
For in vitro diagnostic use / Per uso diagnostico in vitro
LOT
Batch code / Codice del lotto
REF
Catalogue number / Codice
Storage temperature / Temperatura di conservazione
Use by / Utilizzare fino a
Consult Instructions for use / Consultare le istruzioni d‟uso
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