PCR - Liceo Lanza

Biologia Molecolare
Applicata
Le tecniche di manipolazione e studio del DNA al
servizio delle scienze (non solo) biologiche
Luciano Beneduce
Dipartimento di Scienze degli Alimenti
Facoltà di Agraria – Università degli studi di Foggia
Nascita della biologia
molecolare
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1938. Warren Weaver della fondazione Rockfeller fa per
la prima volta menzione della biologia molecolare,
riferendosi alle innovazioni della cristallografia a raggi X
1943. Esperimento di Avery: il materiale genetico è
costituito da acidi nucleici
1953: Watson e Crick (e Rosalind Franklin!) scoprono la
struttura del DNA
1958 Meselson e Stahl: duplicazione semiconservativa
del DNA
1959 Jacom e Monod introducono il concetto di operone
e scoprono l'RNA
1961 Decodificazione del codice genetico
Accelerazione delle scoperte
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1969 Scoperta degli enzimi di restrizione; prima sintesi
completa di un gene (Gobind Khorana)
1970 Temin e Baltimore scoprono la trascrittasi
inversa nei virus.
1971 Sintesi della ribonucleasi; sintesi dell’ormone
della crescita.
1973 Doy introduce il termine "transgenosi" per
descrivere il trasferimento artificiale di informazioni
genetiche da cellule batteriche a cellule eucariote,
mediante fagi
1977 Sanger e la sua equipe scoprono la struttura
genetica completa di un fago il cui DNA circolare
consta di 5400 nucleotidi
..ancora
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1980 Viene prodotto interferone umano da parte di un
batterio.
1983 Tecnica della diagnosi prenatale basata sul
prelievo dei villi coriali.
1984 Identificazione del retrovirus dell’HIV.
1989 Il batterio patogeno Agrobacterium tumefascens
è utilizzato per trasferire geni nelle piante coltivate e
ottenere così piante resistenti agli erbicidi, parassiti e
malattie.
1990 Scoperta foglia di magnolia di 20 milioni di anni
fa non mineralizzata, di cui si può studiare frammenti
di DNA.
...e ancora!
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1993 A Kary Mullis viene attribuito il premio Nobel per
la chimica per aver messo a punto la tecnica del
PCR che consente di produrre numerose copie di
singoli frammenti di DNA .
1993 Pubblicazione della prima carta fisica del
genoma umano. Ipotesi di relazione fra l’Helicobacter
pylori e l’ulcera gastrica. Scoperta del gene
responsabile del morbo di Huntington.
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1996 Mappa completa del genoma umano.
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1997 Nasce Dolly.
Pechè la biologia molecolare
è così importante?
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Studiando e manipolando DNA, RNA e proteine si
agisce sugli strumenti di trasmissione delle
informazioni utili alla vita organica
Tutti gli esseri viventi basano il sistema di
trasmissione delle informazioni genetiche su
queste tre molecole
L'evoluzione delle specie è l'evoluzione dei loro
geni
I geni possono viaggiare da specie a specie ed
attraversare i confini di specie differenti
Gli enzimi di restrizione
Un enzima di restrizione è un complesso
proteico in grado di rompere i legami
fosfodiesterici base-base del Dna a doppio
filamento. Il ruolo biologico di questi enzimi è di
protezione e salvaguardia della cellula: nei
procarioti questi enzimi sono essenziali per il
taglio e la degradazione di filamenti estranei al
genoma (come ad esempio quello derivante da
una infezione fagica).
Gli enzimi di restrizione
Ogni enzima (in quelli di classe II) possiede
una propria sequenza bersaglio (detta
anche sequenza consenso), che riconosce
e taglia. Questa sequenza, solitamente di
4-8 paia di basi, è detta sito di restrizione
Si tratta di siti con sequenze palindromiche
(possono essere lette in entrambi i versi
sui due filamenti).
Uso delle “forbici
molecolari” in laboratorio
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Gli enzimi di restrizione sono le
“forbici” che ci permettono di inserire
un gene in una sequenza di DNA (es.
in un plasmide)
Se trattiamo il plasmide e il gene con
lo stesso enzima di restrizione, le
estremità avranno sequenze
omologhe e potremo “incollarle” tra
loro
Alcune applicazioni
Clonaggio molecolare
Es. produzione insulina, piante OGM
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Mappe cromosomiche
Es. genomica umana, medicina molecolare
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Marcatori molecolari
Es. PFGE, ARDRA, AFLP
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La reazione a catena della
DNA polimerasi - PCR
Fino a 30 anni fa era molto difficile analizzare
il DNA per gli studi biomolecolari

Negli anni '80 Kary Mullis intuisce e idea la
PCR, una reazione enzimatica che permette di
moltiplicare in vitro miliardi di copie di un
segmento specifico di DNA

Nel 1993 Mullis viene insignito del premio
Nobel per la chimica

Grazie alla PCR le scoperte di biologia
molecolare subiscono una accelerazione
impressionante

In pratica…
10x PCR buffer
Taq
Water
DNA template
dNTPs
Come funziona la PCR
Video PCR
Elettroforesi
Il sequenziamento del DNA
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E' una tecnica che serve a leggere
l'ordine dei nucleotidi che costitusicono
l'acido nucleico
Leggendo la sequenza si determinano le
informazioni genetiche in essa contenute
In queste sequenze vi sono i geni veri e
le “istruzioni per l'uso”, ossia i regolatori
dell'espressione genica
C:\Documents and Settings\Utente\Documenti\progetto dior\Sequenziamento DNA.flv
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blastn\
Identificare un
microogranismo
Helicobacter pylori
Identificare più di un gene target
la multiplex PCR
Escherichia coli O157:H7
Studiare l’espressione dei geni:
La RT PCR
Con questa tecnica possiamo:
• identificare microrganismi vivi e
vitali
• Verificare se un gene è “acceso”
• misurare l’espressione genica
La PCR quantitativa
La PCR quantitativa
eae
Std 10000 pg/ul
Std 1000 pg/ul
1
Std 100 pg/ul
Std 10 pg/ul
Fluorescence
Std 1 pg/ul
0,1
Std 0,1 pg/ul
C0
C4
C7
0,01
c8
0,001
5
10
15
20
25
cycle n.
30
35
40
La DGGE: denaturing gradient gel
electrophoresis
Ci permette di studiare
intere comunità
microbiche
Non richiede la
coltivazione dei
microrganismi
È possibile identificare
nuove specie e seguire
l’evoluzione delle
comunità microbiche
LA DGGE
La DGGE
La FISH
fluorescence in-situ
hybridization
La FISH
Applicazioni in campo
forense - criminologia
Paleontologia e archeologia
L'uomo di Similaun (Otzi)
pare appartenere a un ceppo
evolutivo di homo sapiens
senza discendenti attuali
Indegno finale....
The PCR Song by Scientists for Better PCR
C:\Documents and
There was a time when to amplify DNA,
You had to grow tons and tons of tiny cells.
Settings\Utente\Documenti\progetto
dior\DIVULGAZIONE
(Oooh)
Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,
Said you can amplify in vitro just as well.
SCIE
Just mix your template with a buffer and some primers,
Nucleotides and polymerases too.
Denaturing, annealing, and extending,
Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.
[Chorus]
PCR when you need to detect mutation (detect mutation)
PCR when you need to recombine (recombine)
PCR when you need to find out who the daddy is (who’s your
daddy?)
PCR when you need to solve a crime (solve a crime)
[x2]