S UNIVERSITA` POLITECNICA DELLE MARCHEFACOLTA` DI

UNIVERSITA’ POLITECNICA DELLE MARCHE
FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA
Dottorato di Ricerca in Medicina e Chirurgia 14o ciclo
Curriculum in Medicina Clinica e Molecolare
ASSOCIAZIONE TRA STATO MUTAZIONALE
DI KRAS E PATTERN DI ESPRESSIONE
GENETICA NEL CARCINOMA DEL
PANCREAS
Relatore: Chiar.mo
Tesi di Dottorato di:
Prof.ssa Rossana Berardi
Dott. Alessandro Bittoni
Anno Accademico 2014 - 2015
0
INDICE
Riassunto analitico e parole chiave
Pag. 2
English abstract and keywords
Pag. 4
1 Introduzione
Pag. 5
1.1 Epidemiologia
Pag. 5
1.2
1.3
1.4
1.7
Pag. 7
Pag. 10
Pag. 15
Pag. 38
Fattori di rischio e predisposizione genetica
Anatomia Patologica
Patogenesi del carcinoma pancreatico
Razionale e obiettivi dello studio
2 Pazienti e Metodi
2.1
2.2
2.3
2.4
Pag. 39
Selezione dei pazienti
Elaborazione dei campioni e analisi PCR quantitativa
Sequenziamento del DNA e valutazione di KRAS
Elaborazione dei dati ed analisi statistica
3 Risultati
Pag. 39
Pag. 40
Pag. 44
Pag. 45
Pag. 47
3.1 Caratteristiche dei pazienti
3.2 Analisi dell’espressione genica
3.3 Correlazione tra stato mutazionale di KRAS e
sopravvivenza
Pag. 47
Pag. 49
Pag. 54
4 Discussione
Pag. 56
5 Bibliografia
Pag. 63
1
Riassunto analitico
Introduzione: Mutazioni attivanti del gene KRAS svolgono un ruolo
fondamentale nella carcinogenesi pancreatica. Tuttavia recenti studi hanno
dimostrato come la mutazione di KRAS non sia presente in tutti i casi di
adenocarcinoma del pancreas, mettendone in discussione l’ubiquità in
questa patologia. In questo studio, abbiamo valutato la presenza di
differenze a livello molecolare tra adenocarcinomi del pancreas con
mutazione di KRAS e senza mutazione; abbiamo valutato inoltre il ruolo
prognostico delle diverse mutazioni di KRAS in pazienti affetti da
adenocarcinoma pancreatico.
Pazienti e metodi: Abbiamo analizzato l’espressione di un panel di 29 geni
in 42 carcinomi pancreatici KRAS wild type (WT) confrontandoli con 42
carcinomi KRAS mutati (MT). Inoltre, abbiamo valutato gli effetti della
mutazione di KRAS e dei livelli di espressione genica sulla sopravvivenza
dei pazienti.
Risultati: L’analisi di espressione genica ha mostrato che MUC6
(p=0.009), VEGFR-2 (p=0.020), VEGFB (p=0.026) e HGF (p= 0,011)
risultavano significativamente più espressi e SMAD4 meno soppresso
(p=0.003) nei carcinomi KRAS wild type. Al contrario, SHH (p=0.012) and
IHH (p=0.031) sono risultati maggiormente espressi nei tumori KRAS
mutati. Non sono state evidenziate differenze significative in termini di
sopravvivenza tra pazienti con carcinomi KRAS wild type e mutati o tra le
diverse mutazioni di KRAS.
2
Conclusioni: Lo stato mutazionale di KRAS sembra identificare due
sottotipi di adenocarcinoma del pancreas con prognosi simile ma con
caratteristiche molecolari distinte e verosimilmente con diversi bersagli
molecolari.
3
Abstract
Background: KRAS mutation is one of the most frequent genetic alteration
in pancreatic adenocarcinoma. However, recent studies have questioned the
assumption that KRAS mutation is an ubiquitous event in pancreatic
carcinogenesis.
Aim of our study was to evaluate potential differences at a molecular level
between KRAS mutant tumors (MT) and KRAS wild-type (WT) pancreatic
tumors and the biological and prognostic significance of different KRAS
mutations.
Materials & methods: We analyzed the expression of a panel of 29 genes
in KRAS WT tumors and we compared them with those observed in 42
KRAS MT tumors. Furthermore, we assessed the effects of KRAS mutation
and gene expression levels on patients’ survival.
Results: MUC6 (p = 0.009), HGF (p = 0.011), VEGFR-2 (p = 0.020) and
VEGFB (p = 0.026) were significantly more expressed and SMAD4 was
less suppressed (p = 0.003) in WT KRAS. Contrariwise, SHH (p = 0.012)
and IHH (p = 0.031) were more expressed in MT KRAS patients. No OS
difference was found between WT and MT KRAS tumors.
Conclusion: KRAS mutation status seems to identify two different
subtypes of pancreatic ductal adenocarcinoma with similar outcome but
distinct molecular features and probably different therapeutic targets.
4
1. INTRODUZIONE
1.1 Epidemiologia
Il carcinoma pancreatico rappresenta la quarta causa di morte per neoplasia
nei paesi occidentali con oltre 300.000 nuovi casi e decessi all’anno nel
mondo [1] di cui 12.700 in Italia dove causa il 7% dei decessi per causa
tumorale con un’incidenza e una mortalità che permangono in aumento in
entrambi i sessi [2].
Il picco di maggior incidenza del carcinoma pancreatico si colloca tra la
sesta e la settima decade di vita con un aumento di incidenza in entrambi i
sessi. Per quanto riguarda la prognosi, il carcinoma del pancreas
rappresenta una malattia ad elevata letalità con una mortalità che
approssima
l’incidenza
della
patologia;
infatti,
la
probabilità
di
sopravvivenza a 5 anni si attesta intorno al 7-9%, senza sensibili
scostamenti di prognosi negli ultimi decenni [3].
I fattori che contribuiscono a rendere così severa la prognosi di questa
patologia includono l’aggressività biologica della malattia, la diagnosi
spesso tardiva e la resistenza ai trattamenti disponibili [4].
5
Al momento della diagnosi della malattia, solo il 20% circa dei pazienti
presenta una malattia localizzata a livello del pancreas, suscettibile di
resezione chirurgica; per questi pazienti la chirurgia resettiva rappresenta la
migliore opzione di trattamento. Purtroppo, anche in caso di resezione
radicale il rischio di recidiva è molto elevato, intorno all’80%, con una
sopravvivenza mediana dei pazienti resecati che si attesta intorno ai 2 anni e
con una percentuale di pazienti vivi a 5 anni dall’intervento chirurgico
intorno al 20% [5]. Circa il 30% dei pazienti con carcinoma pancreatico
presenta alla diagnosi una malattia localmente avanzata, prevalentemente
per infiltrazione extrapancreatica loco-regionale con coinvolgimento dei
tessuti retroperitoneali, dei vasi venosi e arteriosi della regione, delle
stazioni linfonodali e degli organi vicini. In questo stadio di malattia viene
solitamente suggerito un approccio combinato che possa includere un
trattamento chemioterapico seguito da chirurgia o chemio-radioterapia.
Anche per questi pazienti la prognosi è infausta con una sopravvivenza
mediana compresa tra 1 e 2 anni [5]. Il rimanente 50% dei pazienti con
carcinoma del pancreas presenta una malattia metastatica al momento della
diagnosi; le sedi più frequenti di diffusione della malattia sono il fegato e il
peritoneo, seguiti da polmone e linfonodi extra-regionali. Per questi pazienti
l’unica terapia capace di prolungare l’aspettativa di vita è un trattamento
medico di tipo chemioterapico. In questo stadio di malattia gli schemi
chemioterapici attualmente disponibili permettono di raggiungere, in casi
selezionati, una sopravvivenza mediana di circa 11 mesi [5].
6
In considerazione della prognosi sfavorevole oltre che delle tossicità dei
trattamenti medici disponibili, appare indispensabile valutare strategie
alternative che possano consentire di migliorare i risultati del trattamento
del carcinoma del pancreas. In questa prospettiva è indispensabile una più
approfondita conoscenza della biologia molecolare di questa patologia che
possa consentire di individuare fattori prognostici e predittivi di efficacia
per i trattamenti disponibili allo scopo di personalizzare la terapia nel
singolo paziente oltre a consentire la messa a punto di trattamenti
innovativi.
1.2 Fattori di rischio e predisposizione genetica
Il carcinoma pancreatico presenta una eziologia di tipo multifattoriale e non
sono attualmente completamente chiariti tutti i meccanismi patogenetici alla
base dello sviluppo del tumore.
Tra i più importanti fattori di rischio riscontriamo quelli legati alle
abitudini di vita :
-
FUMO. Il fumo di sigaretta è il fattore di rischio più chiaramente
associato all’insorgenza del carcinoma pancreatico [6]. L’uso di
tabacco aumenta da 2,5 a 3,6% il rischio, il quale aumenta in
relazione alla quantità e alla durata di esposizione all’agente [7].
Sembra che la somministrazione prolungata di nitroderivati
contenenti nel tabacco possano provocare alterazione genetiche quali
la mutazione attivante dell’oncogene K-ras [8];
7
-
ALCOOL. Anche l’abuso di alcool sembra favorire lo sviluppo del
tumore associandosi ad una incidenza più elevata [9];
-
DIETA. Una diretta correlazione tra assunzione di grassi alimentari,
uso eccessivo di carni rosse ed insorgenza di carcinoma pancreatico
è stata descritta in alcuni studi [10]. Inoltre, l’incremento dell’indice
di massa corporea sembra associarsi ad un maggior rischio di
sviluppo della neoplasia [11];
-
AGENTI
OCCUPAZIONALI.
L’esposizione
ad
agenti
occupazionali come la beta-naftilamina e la benzidina si associa ad
un maggior rischio di sviluppare il tumore del pancreas [12].
-
PATOLOGIE CORRELATE. Tra le patologie d’organo, la
pancreatite cronica è considerata una condizione di rischio per
questo tumori (fino a 10 volte di più rispetto alla popolazione
generale) [13], cosi come il diabete mellito (1,5-2 volte) e la
pregressa gastrectomia (3-5 volte) [14,15].
Inoltre, in circa il 10% di pazienti con tumore pancreatico è possibile
riscontrare una familiarità [16,17] che in alcuni casi è possibile spiegare nel
contesto di sindromi note [18], tra cui:
-
la sindrome di Peutz Jeghers legata a mutazione germinale del gene
SKT11 (rischio di oltre 100 volte) [19];
8
-
la “sindrome del melanoma familiare” legata nel 35% dei casi alla
mutazione germinale del gene CDKN2A (rischio relativo compreso
tra 2 e 5) [20];
-
carcinoma pancreatico familiare associato a mutazione germline del
gene BRCA-2 o dei geni dell’Anemia di Fanconi (3-10 volte) [2123];
-
la pancreatite ereditaria autosomica dominante (70 volte) [24-26];
-
la sindrome di Lynch [27].
Anche la presenza di varianti dei loci genomici dei gruppi sanguigni AB0
(in particolare nei gruppi non 0) si è dimostrata associata ad una maggiore
tendenza a sviluppare tumori pancreatici [28].
9
1.3 Anatomia Patologica
1.3.1 Istotipi
I tumori del pancreas si distinguono in base alle loro caratteristiche
morfologiche, fenotipiche e molecolari. Queste proprietà riflettono la
tendenza alla differenziazione nella direzione di una o più delle tre linee di
differenziazione, riscontrabili nel pancreas normale: duttale, acinare ed
endocrina. La differenziazione di linea è l’elemento cruciale che determina
sia le caratteristiche biologiche sia il comportamento clinico di una
determinata neoplasia pancreatica [29].
I tumori del pancreas esocrino possono essere suddivisi in due categorie:

Tumori a prevalente struttura solida
Adenocarcinoma duttale: tumore epiteliale maligno che rappresenta circa
il 90% delle neoplasie del pancreas esocrino, sebbene il sistema duttale
costituisca solo una piccola parte del parenchima pancreatico (2-3%). Tale
discrepanza trova oggi spiegazione con l’ipotesi di una derivazione comune
da cellule staminali, che si localizzerebbero nel comparto “duttale” [30].
Caratteri macroscopici: In due terzi dei casi il carcinoma si localizza alla
testa del pancreas e in un terzo nel corpo-coda. Il coinvolgimento
dell’intero organo e la presentazione multifocale rappresentano una rarità. Il
tumore della testa pancreatica, più frequentemente localizzato nella
10
porzione anteriore rispetto al processo uncinato, si associa di solito a stenosi
del coledoco terminale (ittero) e del dotto del Wirsung (pancreatite cronica).
Il tumore del corpo e della coda tende a invadere il retro peritoneo, lo
stomaco, il colon, l’omento, la milza ed i surreni. All’atto della diagnosi le
dimensioni del carcinoma della testa sono sensibilmente inferiori (2-3 cm)
rispetto a quelle del corpo-coda (5-7 cm). Il carcinoma è caratterizzato da
una massa solida, a margini infiltranti, di colorito biancastro e consistenza
duro-lignea; nelle fasi avanzate può presentare un aspetto disomogeneo e
talora “cistico”.
Caratteri microscopici: Le caratteristiche istopatologiche salienti sono la
presenza di strutture simil-duttali infiltranti, la ricca componente stromale
desmoplastica e la frequente invasione perineurale (Figura 1) [31].
Figura 1: istologia del tumore del pancreas ed evoluzione da lesione
benigna a maligna.
11
Varianti istologiche: Sono considerate quelle neoplasie che presentano una
seppur minima componente di adenocarcinoma duttale classico; i caratteri
clinici e la sopravvivenza sono sovrapponibili. Queste varianti sono
rappresentate da:
-
Carcinoma mucinoso non-cistico, caratterizzato da una massiccia
produzione di muco e da una componente papillare mucinosa
intraduttale [32].
-
Carcinoma
adenosquamoso,
caratterizzato
da
aspetti
misti
adenocarcinomatosi e di carcinoma squamoso, con frequenti aree
simil-sarcomatose.
-
Carcinoma anaplastico, caratterizzato da aspetti istologici variabili
con presenza di cellule giganti pleomorfe.
-
Carcinoma a cellule giganti di tipo simil-osteoclastico, caratterizzato
dalla presenza di numerose cellule giganti plurinucleate, simili agli
osteoclasti [33].
-
Carcinoma a cellule chiare, composto prevalentemente da cellule
pleomorfe a citoplasma chiaro ricco di glicogeno [34].
-
Carcinoma misto duttale-endocrino caratterizzato dalla presenza di
una componente ghiandolare che mostra una cospicua presenza di
elementi endocrini strettamente commisti alle cellule duttale ,
positive viceversa per le mucine.
12
-
Carcinoma con i caratteri morfologici del tipo midollare,
caratterizzato
da
crescita
espansiva,
da
spiccato
infiltrato
infiammatorio peritumorale e da scarsa differenziazione cellulare
[35].
Carcinoma acinare: tumore che rappresenta solo l’1% di tutte le neoplasie
del pancreas esocrino anche se l’epitelio acinare costituisce più dell’80%
dell’intera struttura del pancreas. Prevale nel sesso maschile e nell’età
avanzata [36].

Tumori cistici: Le neoplasie cistiche rappresentano circa il 5-10% di
tutte le neoplasie del pancreas. Sono classificate in base al grado di
displasia epiteliale in adenomi, lesioni borderline e carcinomi.
Caratteristica comune è la prognosi più favorevole.
Neoplasie sierose cistiche: forme quasi esclusivamente benigne che
rappresentano il 30-40% dei tumori cistici del pancreas. Sono lesioni di
grandi dimensioni, ben circoscritte, che si riscontrano in entrambi i sessi,
con prevalenza nelle donne di età compresa tra i 60 e 70 anni [31]. Si
distinguono cinque varianti clinico-patologiche:

Cistoadenoma sieroso (CAS) microcistico

CAS macrocistico o oligocistico

CAS solido
13

Cistoadenocarcinoma sieroso

Neoplasie cistiche sierose associate a sindrome di Von
Hippel Lindau-VHL [37].
Neoplasie mucinose cistiche: neoplasie con spiccata prevalenza nel sesso
femminile, capsulate, senza rapporto con il sistema duttale, caratterizzate da
epitelio colonnare muco-secernente e da stroma di tipo ovarico [38,39].
Esiste infine una quota di neoplasie che origina dalla componente endocrina
della ghiandola stessa. I tumori neuroendocrini rappresentano un gruppo
eterogeneo di neoplasie con andamento clinico estremamente variabile
correlato al grado di differenziazione ed alla eventuale secrezione di ormoni
con conseguenti sindromi correlate.
1.3.2 Grading
Un’importante caratteristica istologica da prendere in considerazione,
soprattutto per la sua valenza prognostica è il grado di differenziazione
cellulare. Il grading dell’adenocarcinoma duttale, definito secondo i criteri
WHO (World Health Organization) è basato sulla produzione di mucina,
numero di mitosi per campo, atipie nucleari. Si distinguono tre gradi diversi
[40] di differenziazione istologica (Figura 2):

G1: presenza di strutture ghiandolari ben differenziate;

G2: presenza di strutture ghiandolari moderatamente differenziate;
14

G3:
presenza
di
strutture
scarsamente
differenziate,
di
differenziazione mucoepidermoide o di strutture pleomorfe;
Figura 2: campioni di carcinoma pancreatico con diversi gradi di
differenziazione: ben differenziato (A); moderatamente differenziato
(B); scarsamente differenziato (C).
1.4 Patogenesi del carcinoma pancreatico
L’adenocarcinoma pancreatico si sviluppa a seguito dell’accumularsi di
mutazioni a carico di geni appartenenti a diverse pathways molecolari che
svolgono funzioni chiave nel controllo della proliferazione cellulare, come
la regolazione dell’apoptosi, del ciclo cellulare o il mantenimento
dell’integrità genomica. Molte delle anomalie genetiche riscontrate nel
carcinoma pancreatico invasivo sono già presenti a livello delle lesioni premaligne da cui il carcinoma pancreatico si sviluppa.
15
1.4.1 Precursori del carcinoma pancreatico
Studi genetici suggeriscono che il carcinoma pancreatico possa svilupparsi
da una di tre distinte lesioni pre-invasive: le neoplasie pancreatiche
intraepiteliali (PanIN), le neoplasie papillari mucinose intraduttali (IPMN) e
le neoplasie cistiche mucinose (MCN) [41].
Tutte queste lesioni seguono una progressione neoplastica multifasica che
porta allo sviluppo del carcinoma invasivo parallelamente all’accumulo
progressivo di mutazioni genetiche (Figura 3) [42].
Figura 3: PanIN ed alterazioni genetiche associate (lo spessore delle
linee sta ad indicare la frequenza della lesione; mentre il colore indica il
tipo di alterazione) (da Hanahan et al, 2000)43.
Una migliore conoscenza delle alterazioni genetiche e delle caratteristiche
dei precursori del carcinoma pancreatico potrebbe avere ricadute in termini
16
di strumenti di diagnosi precoce, fondamentale per migliorare la prognosi di
questa patologia.

Neoplasia pancreatica intraepiteliale (PanIN)
Le PanINs sono neoplasie epiteliali dei dotti di piccole dimensioni, visibili
solo microscopicamente, di diametro < 0.5 cm, caratterizzate da epitelio
colonnare frequentemente mucosecernente, piatto o con proliferazioni
micropapillari che presentano un ampio ventaglio di modificazioni
morfologiche con diversi gradi di atipia citologica e di alterazioni
architetturali [44-46].
Le lesioni PanINs sono suddivise in:
-
PanIN-1A-B: costituite da epitelio colonnare piatto o micropapillare con
nucleo basale ed abbondante citoplasma producente mucina, privo di
evidente atipia [47,48];
-
PanIN-2:
caratterizzata da una proliferazione epiteliale piatta o
micropapillare con pseudostratificazione nucleare, atipia citologica di grado
moderato;
-
PanIN-3: caratterizzata da proliferazione frequentemente micropapillare,
cribriforme, con necrosi intraluminale, atipia citologica di alto grado e con
frequenti mitosi.
Attualmente, solo le lesioni di tipo PanIN-3 sembrano comportare un
rischio significativo di progressione. Infatti, le lesioni di tipo PanIN-1 sono
17
presenti nel 40% del pancreas di pazienti non portatori di carcinoma,
mentre quelle di tipo PanIN-3 sono associate alla presenza di carcinoma
invasivo nel 30-50% dei casi. La progressione dal basso grado di displasia
(PanIN 1a e PanIN 2b) all’alto grado di displasia (PanIN 2, PanIN 3) e
infine al carcinoma invasivo è concomitante ad alterazioni geniche, con una
frequenza che riflette i diversi gradi di atipia [43].
Le mutazioni nel codone 12, ed eccezionalmente nei codoni 13 e 61, del
gene KRAS si osservano in gran parte di queste lesioni pre-invasive (75100%) [49]. Il gene HER-2/neu non è espresso nell’epitelio del pancreas
normale, ma è altamente espresso in concomitanza della progressione dei
gradi di PanIN (PanIN-1A: 30%, PanIN-1B: 55%, PanIN-2 and PanIN3:
92%) [50]. Invece, l’inattivazione dell’oncosoppressore CDKN2A (p16) è
un evento più tardivo rispetto alla mutazione del gene KRAS [51]. Simili
osservazioni riguardano anche la perdita della funzione del l’inattivazione
dell’oncosoppressore p53 e della delezione del gene SMAD4, che sono
assenti nei PanIN-1 e PanIN-2, mentre cominciano a presentarsi nelle
lesioni PanIN-3 [52].

Neoplasia papillare mucinosa intraduttale (IPMN)
Le IPMN rappresentano l’1-3% delle neoplasie esocrine pancreatiche e il
20-50% di tutte le neoplasie cistiche del pancreas anche se la reale
incidenza non è nota data la frequente asintomaticità [46].
18
Le IPMN sono neoplasie mucinose frequentemente papillari, che si
sviluppano nel dotto principale o nei dotti di secondo ordine sempre
associate ad ectasia duttale macroscopicamente visibile.
Poiché le neoplasie IPMN che crescono nel dotto pancreatico principale
sono associate a un più alto potenziale maligno, vengono suddivise in tre
sottotipi:
1.
“centrali” o del dotto principale, con coinvolgimento del
dotto di Wirsung
2.
“periferiche” o dei dotti collaterali, con coinvolgimento
esclusivo dei dotti di secondo ordine;
3.
“miste”, con coinvolgimento di entrambi.
La classificazione WHO 2010 suddivide le neoplasie IPMN, in relazione
alla loro trasformazione maligna, dal basso o intermedio ad alto grado di
displasia e IPMN con carcinoma invasivo.
Insieme alle lesioni PanINs, le lesioni IPMN sono i più importanti
precursori del carcinoma pancreatico duttale.
Le neoplasie IPMN si distinguono molecolarmente dal carcinoma duttale
per una ridotta incidenza di mutazioni a carico dei geni KRAS, p53, p16 e
conservazione dell’espressione di SMAD4 e per l’inattivazione in un terzo
dei pazienti del gene STK1/LKB1 [53].
19
Il monitoraggio delle neoplasie IPMN che non richiedono resezione, è
subordinata dalla distinzione tra il sottotipo periferico e centrale.
Infatti, il sottotipo centrale delle IPMN costituisce sempre un’indicazione
chirurgica, mentre il trattamento di quello periferico dipende da criteri
clinici, morfologici e di imaging. Le lesioni periferiche IPMN di diametro
<10 mm devono essere controllati annualmente, mentre quelle con diametro
di 10-20 mm ogni 6-12 mesi. Per quanto riguarda invece le lesioni
periferiche di diametro > 20 mm, l'indicazione chirurgica dovrebbe essere
considerata, a seconda della situazione clinica e discussa singolarmente con
il paziente. In presenza di sintomi, interessamento linfonodale, diametro>
30 mm, o riscontro di un condotto principale dilatato, è indicato un
intervento chirurgico. Se non sono intervenuti cambiamenti dopo due anni
di monitoraggio, l'intervallo può essere prorogato [54].
Attualmente, non ci sono ulteriori prove su trattamento adiuvante per
IPMN. Pertanto, il ruolo della terapia adiuvante nel trattamento di IPMN
rimane poco chiaro [55]. Dopo la resezione di IPMN invasivo, la recidiva si
verifica nel 40% -65% dei pazienti. [56,57].
Diversi studi hanno dimostrato che, in termini di resecabilità, la chirurgia è
l'unica opzione terapeutica anche per neoplasie IPMN non invasive [58].

Neoplasie cistiche mucinose (MCN)
Rappresentano circa il 30% delle neoplasie cistiche del pancreas, con
spiccata prevalenza nel sesso femminile, capsulate, senza rapporto con il
20
sistema duttale, prevalentemente localizzate nella coda del pancreas e
caratterizzate dalla presenza di stroma ovarico [38,47].
Le neoplasie vengono suddivise in base al grado di displasia dell’epitelio in
adenomi (atipia di grado lieve), forme borderline (atipia di grado moderato)
ed adenocarcinomi non invasivi (atipia severa) [59].
All’immunoistochimica, la componente epiteliale presenta positività per le
citocheratine (CK7, CK8, CK18, CK19), EMA e, meno frequentemente,
CK20, CEA, DUPAN-2 e CA 19-9 [53]. Le cellule dello stroma di tipo
ovarico presentano positività per la vimentina, l’actina muscolo specifica,
per i recettori degli estrogeni, del progesterone e per l’alfa-inibina [60].
Le modificazioni molecolari comprendono mutazioni del gene KRAS,
presenti
fino
dalle
fasi
iniziali
di
sviluppo
della
neoplasia
e
progressivamente aumentate di pari passo con l’incremento del grado di
displasia.
D'altra parte, l’inattivazione dei geni oncosoppressori p53, SMAD4 / DPC4,
p16 caratterizzano invece le fasi avanzate di malattia, con maggior
espressività nei focolai carcinomatosi invasivi [61,62].
1.4.2 Carcinogenesi molecolare
La carcinogenesi del carcinoma pancreatico (PDAC) è riconducibile a
modificazioni genetiche ed epigenetiche multiple, tra cui la disattivazione
21
di geni onco-soppressori e l’attivazione di proto-oncogeni, che si
accumulano
durante
l’evoluzione
dalle
lesioni
pre-invasive
fino
all’adenocarcinoma.
Tra i geni chiave nella patogenesi del carcinoma pancreatico e che risultano
mutati nella maggior parte delle neoplasie troviamo: KRAS, CDKN2A,
TP53 e SMAD4.

KRAS: mutazioni di KRAS vengono riportate, sebbene non in
maniera univoca, nel 65-90% dei carcinomi pancreatici [63,64].
L’attivazione del pathway Ras è un requisito indispensabile per lo
sviluppo del carcinoma duttale del pancreas, come dimostrato da
modelli murini geneticamente modificati [65].
Il KRAS codifica per una proteina di membrana che fa parte della
famiglia delle proteine leganti il GTP. Le mutazioni in questo gene
risultano in una forma costituzionalmente attiva della proteina
capace di stimolare una serie di vie di segnale (Figura 4), tra cui
“Mitogen Activated Protein Kinase” (MAPK) ed il pathway di
PI3K/Akt che portano alla proliferazione cellulare, alla soppressione
dell’apoptosi e alla sopravvivenza tumorale. Le mutazioni a carico
dell’oncogene KRAS si osservano anche nelle lesioni pre-invasive
come precedentemente descritto [66].
Un’ altro membro della cascata RAS è il gene BRAF, situato sul
cromosoma 7q, una serina / treonina chinasi coinvolta nel pathway di
22
RAS-RAF-MEK-ERK-MAP. La frequenza della mutazione del gene
BRAF nel carcinoma pancreatico KRAS wild type è del 30% [66]. È
interessante notare che tutti gli studi negli ultimi anni hanno
riscontrato che le mutazioni di KRAS e BRAF si escludono a vicenda
e tumori con forme mutanti di uno dei questi due geni
invariabilmente non presentano mutazioni a carico dell’altro. Il
requisito dell’oncogene KRAS o del pathway di BRAF sembrano
essere di fondamentale importanza per la maggior parte dei casi nella
carcinogenesi pancreatica e per questo motivo vari studi stanno
valutando questi oncogeni come potenziali target terapeutici [67].
Il pathway di PI3K-AKT è un effettore chiave della trasformazione
RAS-dipendente di molti tipi cellulari e svolge anche un ruolo nella
sopravvivenza cellulare e altri processi legati alla crescita [68].
Questo pathway è attivo nella maggior parte dei tumori pancreatici
[69]. Un terzo pathway attivato da RAS e quello di RalGDS che
agisce tramite attivazione di Ral A e Ral B, due proteine che
sembrerebbero svolgere un ruolo importante nei processi di
iniziazione e progressione tumorale.
23
Figura 4: Pathways molecolari a valle di RAS (Raf/MAP chinasi),
PI3K-Akt e RalGDS. (da Hezel, 2006)29.
 p16INK4a/CDKN2A: CDKN2A, situato sul braccio corto del
cromosoma 9 (9p), è il gene oncosoppressore più frequentemente
inattivato nei tumori pancreatici [70]. La proteina p16 appartiene alla
famiglia degli inibitori delle chinasi dipendenti da ciclina ed in
quanto tale inibisce la progressione lungo il ciclo cellulare a livello
della transizione G1-S [71]. La perdita di p16INK4a / CDKN2A
risulta in una inadeguata fosforilazione di Rb-1, facilitando in tal
modo la progressione del ciclo cellulare attraverso la transizione G1
/ S [84]. In un piccolo gruppo di pazienti, le mutazioni ereditarie del
gene p16INK4a / CDKN2A causano la sindrome del melanoma
familiare (FAMM) [72].
24
 P53: p53 è un gene oncosoppressore alterato nel 50-70% dei tumori
del pancreas. Il prodotto del gene p53 è una proteina che svolge un
ruolo chiave nel regolare la risposta cellulare allo stress citotossico,
contribuendo all’arresto del ciclo cellulare ed alla morte cellulare
programmata. La perdita di p53 durante la carcinogenesi determina
inappropriata crescita cellulare, aumentata sopravvivenza cellulare
ed instabilità genetica [73].
 SMAD4: SMAD4 è inattivato da mutazioni nel 50% dei carcinomi
pancreatici [74]. SMAD4 codifica per una proteina che gioca un
ruolo importante nella trasduzione del segnale dei recettori della
famiglia del TGF-β. La funzione di SMAD4 è quella di sopprimere la
crescita cellulare e di promuovere l’apoptosi. La perdita di SMAD4
pertanto abolisce due importanti sistemi di controllo sulla
popolazione cellulare. L’inattivazione di questo gene è inoltre poco
frequente in neoplasie non duttali e rarissima in malattie
extrapancreatiche [75]. Questo fa sì che l’analisi dell’espressione
immunoistochimica della proteina sia una tecnica diagnostica molto
efficace in clinica, soprattutto nel caso di metastasi sospette da un
tumore pancreatico primario occulto.
25
La complessità genetica del cancro del pancreas è stata dimostrata in
diversi studi basati sull’utilizzo di tecnologie di sequenziamento di nuova
generazione che hanno suggerito che ciascun carcinoma pancreatico
presenti alterazioni che riguardano componenti di 12 diverse vie di
trasduzione del segnale (signalling pathway) e processi cellulari, con una
media di 63 alterazioni genetiche in ciascun tumore. In particolare, sei
diversi pathways risultano alterati nel 100% dei casi a causa di mutazioni a
Figura 5: Signalling pathways alterati nella maggioranza dei tumori
pancreatici (da Hidalgo, 2015)76.
carico di almeno uno dei suoi diversi componenti. Questi pathways sono:
KRAS-MAPK, apoptosi, transizione G1-S, Hedgehog, TGF, Wnt/Notch
(Figura 5).
26
1.4.3 Il pathway di Hedgehog
Tra le vie di segnale maggiormente studiate nella patogenesi del carcinoma
pancreatico negli ultimi anni c’è sicuramente il pathway di Hedgehog (HH).
Il pathway di Hedgehog, che comprende tre ligandi, Indian (IHH), Desert
(DHH) e Sonic (SHH), svolge un ruolo importante nella regolazione dei
processi di sviluppo embrionale [77]. La molecola-chiave del sistema è il
recettore Smoothened (SMO) che è il trasduttore del segnale. La sua
funzione recettoriale è inibita da un’altra proteina transmembrana, Patched
(PTCH), in assenza del ligando. I ligandi di Hedgehog sono molecole
secrete dalla cellula e che possono agire sia per un meccanismo autocrino
che paracrino. Prima della secrezione, la proteina HH deve subire una serie
di modificazioni post-traduzionali, che sono necessarie per la secrezione. Il
legame del ligando HH al recettore PTCH1, avvia la trasmissione del
segnale attraverso il blocco dell’inibizione della proteina SMO. Una volta
attivata, la proteina SMO attiva una cascata di segnali intracellulari che
portano all’attivazione dei fattori di trascrizione Gli e al blocco della
produzione dei loro inibitori. Di fatto quindi il pathway di Hedgehog regola
la funzione delle proteine Gli e la loro attivazione. Le proteine Gli sono
fattori di trascrizione contenenti domini zing finger; nei mammiferi ne
esistono 3 (Gli1, Gli2, Gli3). I fattori Gli possono funzionare da attivatori o
inibitori della trascrizione anche in base al tipo di modificazione posttraduzionale che subiscono. Le proteine Gli2 e Gli3 hanno un dominio C
terminale che modificato, li rende attivatori della trascrizione e un dominio
27
N terminale che modificato li rende repressori della trascrizione. Nella
proteina Gli1 manca del dominio N-terminale; inoltre è il fattore
trascrizionale terminale e quindi l’attivatore critico del pathway.
L’equilibrio tra le funzioni collettive di attivatori e repressori del Gli-3
determina lo stato del programma trascrizionale di Hedgehog e quindi
anche il comportamento delle cellule target di questa via di trasmissione del
segnale (Figura 6). L’espressione aberrante di Sonic Hedgehog è frequente
negli adenocarcinomi pancreatici e nelle lesioni PanIN, con incrementata
espressione durante la progressione tumorale.
L'attivazione del pathway di Hedgehog risulta implicata sia nelle fasi
iniziali di sviluppo del carcinoma pancreatico che nella malattia avanzata
[78]. L'espressione dei ligandi di Hedgehog, di PATCH, e la componente
essenziale del pathway SMO è rilevabile nel normale pancreas. Al
contrario, un aumento relativo nell'espressione di queste proteine si osserva
durante la carcinogenesi pancreatica [79]. Inoltre, è stato confermato che il
pathway Hedgehog svolge un ruolo nel processo di formazione di metastasi.
L’inibizione di Hedgehog ha dimostrato di ridurre l'incidenza di metastasi
in modelli murini [80]. Recentemente, Ji et al. [81] hanno dimostrato che vi
è un cross-talk tra KRAS ed Hedgehog nel carcinoma pancreatico su linee
cellulari. Il loro studio suggerisce che KRAS, attraverso la via
Raf/MEK/MAPK, sopprime la degradazione di Gli1 e di conseguenza
svolge un importante ruolo nell'attivazione di Hedgehog in assenza di
ulteriori ligandi specifici durante la carcinogenesi pancreatica.
28
Figura 6: Rappresentazione dell’attivazione del pathway di Hedgehog.
A: in assenza del ligando, PTCH previene l’attivazione di SMO e la
successiva attivazione dei fattori di trascrizione Gli. B: in presenza del
ligando, PTCH viene disattivato con conseguente sblocco di SMO ed
attivazione dei fattori trascrizionali Gli che migrano nel nucleo ed
attivano la trascrizione dei geni bersaglio di Hedgehog. Nei riquadri
alcuni degli inibitori di Hedgehog attualmente in fase di studio
Recentemente, è stato evidenziato il ruolo del pathway di Hedgehog nello
sviluppo dello stroma tumorale pancreatico. Nei modelli murini di cancro
pancreatico, così come in campioni di carcinoma del pancreas umano,
l'attivazione della via Hedgehog è stata osservata principalmente nelle
29
cellule stromali circostanti cellule tumorali che esprimono ligandi di HH.
Inoltre, ma SHH sembra giocare un ruolo nel promuovere la crescita dello
stroma. Impiegando un modello di xenotrapianto ortotopico di PDAC, è
stato dimostrato come cellule Capan-2 iperesprimenti SHH, fossero in
grado di indurre una reazione desmoplastica più intensa di quella osservata
in tumori derivanti da cellule di controllo [82].
1.4.4 Il pathway di NOTCH
Il pathway Notch è una via di segnale di grande importanza per il normale
sviluppo e la rigenerazione del tessuto pancreatico e risulta attivato sia in
modelli preclinici che nel carcinoma pancreatico umano, dove agisce
promuovendo la progressione della neoplasia pancreatica intraepiteliale in
adenocarcinoma pancreatico [83]. Il pathway è rappresentato da un gruppo
di quattro recettori di superficie cellulare (Notch 1 - 4) che sono attivati da
cinque ligandi (Delta 1, 3, 4 e Jagged 1, 2). Il legame del ligando Notch al
suo recettore attiva la via di segnale attraverso una cascata di clivaggi
proteolitici, mediata dalla γ-secretasi (presenilina) che produce una forma
attivata, ICN (Intra Cellular Notch). ICN viene traslocato nel nucleo dove
diviene parte di un grande complesso trascrizionale che regola l’espressione
di diversi geni con ruoli chiave nei processi di proliferazione e
differenziazione cellulare. Inoltre, l'attivazione di Notch mantiene le cellule
in uno stato indifferenziato in modo da favorire la proliferazione tumorale,
mentre l'inibizione di questa via di segnale porta alla differenziazione delle
30
cellule tumorali. Buchler et al [84] hanno dimostrato una iperattivazione di
NOTCH2 in linee cellulari di carcinoma del pancreas, insieme con
l'espressione del ligando Jagged. Analisi di RT-PCR ed immunoistochimica
su campioni di carcinoma resecato hanno rivelato un aumento di epressione
di Notch3 e -4, Jagged-2 e Delta-1. Notch1 risultava iperespresso nei nervi;
NOTCH-2 e -3 a livello della muscolatura liscia vascolare e Notch4 a
livello dell’endotelio vascolare. Jagged-1 ha mostrato una elevata
espressione nei siti di invasione perineurale e nel il tessuto circostante.
Inoltre, studi preclinici, hanno dimostrato come Notch1 nella forma attivata
(ICN) e Jagged-1 determinino un aumento dell’espressione del Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF), mentre Jagged-1 ha dimostrato di
incrementare in maniera significativa l'invasività delle cellule tumorali.
Questi risultati confermano un ruolo rilevante di Notch nello sviluppo del
carcinoma pancratico sia in termini di invasione che di stimolo
nell'angiogenesi.
1.4.5 SPARC e stroma
Un'altra caratteristica del PDAC è la presenza di abbondante stroma
tumorale, che costituisce l’80-90% del volume del tumore. Lo stroma
contiene tessuto fibroso denso composto da matrice extracellulare (ECM),
proteine, cellule stellate pancreatiche (PSC), cellule immunitarieinfiammatorie, adipociti, vasi ematici e linfatici [85]. Questo microambiente
tumorale svolge un ruolo fondamentale nelle fasi di iniziazione,
31
progressione, invasione e formazione di metastasi. Inoltre, le cellule
stromali esprimono molteplici proteine e fattori di crescita associati alla
resistenza
ai
trattamenti,
inibizione
dell’immunità
antitumorale
e
aggressività della malattia. Le cellule stellate pancreatiche sono
miofibroblasti attivati responsabili dello sviluppo stromale e del turnover.
Queste cellule contribuiscono alla scarsa vascolarizzazione che è
caratteristica del carcinoma pancreatico. Inoltre, le PSC producono fattori
solubili che stimolano vie di segnale correlate alla proliferazione ed alla
sopravvivenza di PDAC [86]. Cellule dell’immunità innata e adattativa,
come le cellule T e macrofagi, sono in grado di creare un microambiente
tumorale immunosoppressiva nel carcinoma pancreatico.
SPARC, noto anche come osteonectina o BM-40 (membrana basale 40), è
una glicoproteina legante il calcio, polifunzionale, appartenente ad un
gruppo di proteine della matrice. SPARC è transitoriamente secreto nella
ECM e non diventa una parte della rete della ECM.20 Il gene SPARC è
localizzato sul cromosoma umano 5q31.3-Q32, e la trascrizione consiste in
un singolo polipeptide (285 amminoacidi) che può essere diviso in 3 diversi
domini strutturali.
SPARC è coinvolto in molti processi biologici, tra cui lo sviluppo, la
riparazione delle ferite, il rimodellamento tissutale, l’angiogenesi,
l'adesione delle cellule della matrice, la differenziazione cellulare, la
proliferazione e la migrazione cellulare. Le funzioni di SPARC possono
essere in parte mediate da interazioni con metalloproteinasi della matrice
32
(MMP) e diversi fattori di crescita, come ad esempio il Transforming
Growth Factor-beta (TGF-beta) ed il Fibroblast Growth Factor (FGF)
[87]. E’ interessante notare come non ci siano recettori di SPARC noti, e la
parte proteica è rapidamente oggetto di proteolisi da parte di diverse
proteasi.
In campioni di tessuto di PDAC, l’espressione SPARC viene segnalata sia
nelle cellule tumorali che a livello stromale [88-89]. Nel tessuto pancreatico
normale, SPARC è debolmente espresso. Nelle cellule duttali normali,
SPARC viene segnalato come principalmente assente o debolmente
espresso. Nel carcinoma pancreatico viene riportata una espressione 31
volte maggiore di SPARC rispetto al tessuto pancreatico sano. Allo stesso
modo, un incremento di 16 volte è stato osservato nella pancreatite cronica
rispetto al normale [90]. Tuttavia, SPARC è altamente espresso nello
stroma del tumore, principalmente a livello dei fibroblasti peritumorali, e la
sovraespressione di SPARC in questo compartimento è associata ad una
prognosi meno favorevole. Complessivamente, gli studi in vitro mostrano
che SPARC possa avere sia proprietà oncogeniche che oncosoppressive.
Questo duplice ruolo di SPARC nel PDAC può essere spiegato dagli effetti
che la proteina ha su diverse popolazioni cellulari del microambiente
tumorale. È interessante notare come SPARC si trovi non solo nei tumori
primari ma anche nelle metastasi. Come mostrano i modelli murini, SPARC
sembra essere un soppressore tumorale nelle cellule di carcinoma tumorale
ma dato il valore prognostico sfavorevole di SPARC si può presumere che
33
le funzioni oncogeniche svolte a livello delle cellule stromali siano
prevalenti nel carcinoma pancreatico umano.
1.4.6 Famiglia di VEGF e neoangiogenesi nel carcinoma pancreatico
Lo sviluppo di nuovi vasi, quindi la neoangiogenesi, rappresenta un
passaggio chiave nella crescita tumorale. Il carcinoma pancreatico è una
neoplasia notoriamente ipovascolarizzata.
Studi su campioni di PDAC
umano hanno confermato che questo è scarsamente vascolarizzati rispetto al
pancreas umano normale o al tessuto pancreatico normale adiacente, e
possiede un minor numero di vasi di grande diametro rispetto al tessuto
sano. Tuttavia, come tutte le altre neoplasie, anche le cellule tumorali
pancreatiche richiedono l’afflusso di ossigeno e nutrienti e la loro crescita è
limitata in assenza di neoangiogenesi. VEGF-A è uno dei più importanti
induttori dell’angiogenesi e risulta espresso tra il 60 e il 65% dei campioni
di PDAC analizzati in immunoistochimica [91]. Il suo effetto si esplica
principalmente tramite il legame con il recettore VEGFR-2 ed il corecettore Neuropilina-1 (Figura 7). In termini di espressione genica, Itakura
et al. hanno riscontrato un aumento di 5,2 volte nell’espressione di VEGF-A
in campioni di PDAC (n = 7) rispetto ai normali campioni di pancreas
umano (n = 4) [92]. Studi preclinici hanno valutato l’effetto del blocco di
VEGF nel carcinoma pancreatico, dimostrando complessivamente una
elevata attività di riduzione della crescita tumorale. Ad esempio, l'iniezione
di cellule di tumore pancreatico umano che esprimono un VEGF antisenso
34
nei fianchi di topi nudi ha portato ad una riduzione dell'80% delle
dimensioni del tumore rispetto ai controlli [93]. Tuttavia questi risultati non
sono stati riprodotti invece nella clinica e tutti gli studi clinici che hanno
valutato l’associazione di farmaci antiangiogenetici alla terapia standard,
nonostante alcuni risultati preliminari incoraggianti, sono risultati fin’ora
negativi.
Figura 7. Angiogenesi nel carcinoma pancreatico. (mod da Craven et al
2015).
1.4.7 Cancer Stem Cells e carcinoma pancreatico
35
Recenti studi hanno messo in evidenza come nell’ambito del carcinoma
pancreatico sia presente una quota di cellule con caratteristiche di
staminalità, le cosiddette Cancer Stem Cells (CSCs). Queste cellule, che
compongono solo dall’1 al 5% del tumore, sono capaci di autorinnovamento illimitato, e tramite la divisione asimmetrica, possono dar
luogo a cellule indifferenziate. Le CSCs, pur numericamente poco
rappresentate, rivestono grande importanza come potenziale bersaglio
terapeutico in quanto resistenti alla chemioterapia ed alla radioterapia, e
pertanto in grado di spiegare la resistenza del carcinoma pancreatico a
questi trattamenti. Diversi markers di superficie sono stati proposti come
marcatori per identificare le cellule staminali del carcinoma del pancreas,
tra cui CD44, CD24, l'antigene di superficie epidermica (ESA), CD133,
CXCR4, c-Met, aldeide deidrogenasi 1 (ALDH1) e OCT3/4. Infatti, nel
2007, due gruppi di ricerca hanno isolato ed identificato cellule staminali
tumorali pancreatiche, utilizzando due diversi set di marcatori di superficie
cellulare. Con analisi FACS, Li et al [94] hanno isolato una
sottopopolazione di cellule staminali tumorali pancreatiche con espressione
di CD44, CD24 ed ESA che aveva un potenziale tumorigenico di 100 volte
maggiore rispetto alle cellule tumorali CD44 - / CD24 - / ESA -. Diverse
evidenze suggeriscono un legame tra le cellule staminali tumorali ed il
processo di transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nel carcinoma
pancreatico. Il rapporto tra queste due entità non è però semplice. In
particolare, sembra che le CSCs siano più inclini a subire EMT, mentre
dall’altra parte EMT potrebbe conferire alle cellule tumorali caratteristiche
36
di staminalità. È pertanto difficile determinare se si verifichi prima la
generazione di CSCs o l’acquisizione di EMT. Le alterazioni a carico di
geni associati con i pathways come quello di Hedgehog, WNT e NOTCH
sono comuni nel carcinoma del pancreas [95], e potrebbero facilitare
l’EMT.
37
1.5 Razionale e Obiettivo dello studio
Obiettivo del nostro studio è stato valutare la presenza di differenze a
livello clinico e molecolare tra campioni di adenocarcinoma pancreatico
KAS mutato e KRAS wild type. Abbiamo pertanto confrontato
l’espressione di un panel di 29 geni, appartenenti ai pathways molecolari
più frequentemente alterati nel carcinoma del pancreas, tra questi due
sottogruppi. Abbiamo inoltre valutato il significato biologico e prognostico
di diversi tipi di mutazioni di RAS.
38
2. PAZIENTI E METODI
2.1 Selezione dei pazienti
Nello studio sono stati valutati in maniera retrospettiva 84 casi di pazienti
affetti da carcinoma del pancreas, trattati presso l’Azienda OspedalieroUniversitaria Ospedali Riuniti Ancona nel periodo compreso tra il gennaio
2003 ed il dicembre 2013. In particolare sono stati presi in esami 42 casi di
carcinomi pancreatici KRAS wild type e confrontati con 42 casi KRAS
mutati con analoghe caratteristiche cliniche.
Tutti gli 84 pazienti sono stati sottoposti ad intervento resettivo al termine
degli accertamenti radiologici preoperatori (ecografia addome, TC total
body, RMN addome, eco-endoscopia duodenopancreatica), volti ad
escludere la non resecabilità della neoplasia (malattia metastatica o
localmente avanzata con infiltrazione vascolare maggiore).
I pazienti sono stati sottoposti in una resezione “en-bloc” del tumore con
associata linfoadenectomia loco-regionale.
Le caratteristiche demografiche, i dati intra-operatori e post-operatori, le
caratteristiche istopatologiche del tumore, il follow-up oncologico dei
pazienti sono stati registrati dalle cartelle cliniche in appositi database ed
anonimizzati prima di essere crociati con i rispettivi materiali biologici
mediante un codice alfanumerico non riconducibile poi ai dati dei pazienti.
I criteri di selezione per l’inclusione dei pazienti nello studio sono stati:
39
- diagnosi istologica di adenocarcinoma del pancreas
- stadio di malattia I-II
- malattia sottoposta a resezione chirurgica
- disponibilità del materiale istologico
- consenso informato del paziente
- ECOG performance status 0-2
- età >18 anni
- assenza di comorbidità di rilievo che potessero modificare la prognosi
- disponibilità dei dati di follow up sull’eventuale progressione e decesso.
2.2 Elaborazione dei campioni e analisi PCR quantitativa
I campioni tumorali sono stati ottenuti da interventi chirurgici di
duodenocefalopancreasectomia,
splenopancreasectomia
sinistra
o
pancreasectomia totale o eseguite presso la Chirurgia Generale e
Pancreatica
dell’Azienda
Ospedaliero-Universitaria-Ospedali
Riuniti
Ancona.
Subito dopo il prelievo del materiale, i campioni tissutali sono stati
processati per l’inclusione in paraffina. Al prelievo è seguita la riduzione in
pezzi di piccole dimensioni e la fissazione per almeno 24 ore in soluzione di
formalina (Sigma-Aldrich) al 4% in acqua milliQ. Al termine della
fissazione i pezzetti sono stati lavati in acqua distillata per eliminare i
residui di formalina che potevano interferire con la successiva colorazione e
quindi disidratati in etanolo al 100% e xylene. Al termine della
40
disidratazione i pezzetti sono stati posti in paraffina preriscaldata a 60°C
per almeno 2 ore al fine di impregnare tutto il tessuto di paraffina e quindi
inclusi e lasciati raffreddare a temperatura ambiente. Al microtomo
(Histoslide 2000, Reichert-Jung), sono state ottenute sezioni dello spessore
di 4 um, che sono state fatte aderire su vetrini portaoggetti SuperFrost Plus
(Menzel-Glaser).
I carcinomi del pancreas sono stati classificati e stadiati secondo le
raccomandazione della World Health Organization (WHO).
La gestione dei campioni tumorali, la loro diagnosi e classificazione e le
analisi di sequenziamento per la ricerca delle mutazioni di KRAS sono state
effettuate presso i laboratori dell’Anatomia Patologica dell’Azienda
Ospedaliero-Universitaria-Ospedali Riuniti Ancona.
Multiple sezioni da blocchetti di tessuto fissati in formalina ed inclusi in
paraffina (da 25 a 30 mg di tumore primario) sono state raccolte e
successivamente deparaffinate tramite due passaggi in xilene, ciascuno di 5
minuti e idratate tramite passaggi di 5 minuti ciascuno in una scala
discendente di concentrazioni di etanolo in acqua distillata: etanolo
assoluto, etanolo 95%, etanolo 80% ed etanolo 70%. L’idratazione si è
conclusa quindi con un passaggio di almeno 10 minuti in acqua distillata.
Per l'estrazione di RNA da campioni di tessuto fissato in formalina ed
incluso in paraffina (FFPE) è stato utilizzato il kit RT2 FFPE RNA
Extraction Kit (SABiosciences Corporation, Frederick, MD, USA), in
accordo con le istruzioni del produttore. La quantità dei campioni di RNA
41
estratto è stata determinata allo spettrofotometro mediante l'utilizzo dello
strumento NanoDrop.
Cinquecento nanogrammi di ogni campione sono stati retrotrascritti in
cDNA e preamplificati impiegando il Kit RT2 FFPE PreAMP cDNA
Synthesis e utilizzando un mix specifico di primers per il personalizzato
Stem Cell RT2Profiler PCR Array (SABiosciences Corporation).
Tutte le procedure sono state eseguite in ambiente ad uso esclusivo per
RNA al fine di evitare contaminazioni.
I campioni di RNA totale così ottenuti sono stati analizzati mediante una
7300 Real-Time PCR (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA)
utilizzando il SYBR Green (Quiagen) come indicatore di fluorescenza e
verifica della specificità dei prodotti amplificati mediante curva di melting.
L’analisi dell’espressione genica è stata condotta sui campioni per i
seguenti geni: ALCAM, B2M, BMP4, BRCA1, BRCA2, CD24, CD44
CDKN2A, DHH, FLT1, GUSB, HGF, HPRT1, IHH, LGR5, MET, MUC6,
NOTCH1, OCT3/4, PDGFRB, PGF, PROM1, PTCH1, PTCH2, SHH,
SMAD4, SMO, SPARC, VEGFA, VEGFB, VEGFR-2, WNT1. B2M, GUSB e
HPRT1 sono geni housekeeping utilizzati per la normalizzazione dei valori.
I geni testati e le loro funzioni sono indicati in Tabella 1.
42
Tabella 1. Geni testati e loro funzioni principali
Gene ID
Gene name
Biological process
ALCAM
CD166 antigen
Cell adhesion
B2M
Beta-2-microglobulin
Housekeeping
BMP4
BRCA1
BRCA2
CD24
CD44
Bone morphogenetic protein 4
Breast cancer type 1 susceptibility
Breast cancer type 2 susceptibility
protein
Signal transducer CD24
protein
CD44 antigen
normalization
Cell differentiation
Cell cycle
Cell cycle
Cell proliferation
Cell adhesion
CDKN2A
Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
Cell cycle regulation
DHH
FLT1
Desert hedgehog protein
Cell differentiation
Vascular endothelial growth factor Cell differentiation
GUSB
Beta-glucuronidase
receptor 1
Housekeeping gene
angiogenesis
HGF
Hepatocyte growth factor
Cell
HPRT1
Hypoxanthine-guanine phosphoRT
Housekeeping gene
chemotaxis and apoptosis
IHH
LGR5
MET
MUC6
NOTCH1
OCT3/4
PDGFRB
PGF
PROM1
PTCH1
PTCH2
SHH
Indian hedgehog protein
Leucine-rich repeat-containing GHepatocyte growth factor receptor
protein coupled receptor 5
Mucin-6
Neurogenic locus notch homolog
POU domain, class 5, transcription
protein 1
Platelet-derived growth factor receptor
factor 1
Placenta growth factor
beta
Prominin-1
Protein patched homolog 1
Protein patched homolog 2
Sonic hedgehog protein
Mothers
against
decapentaplegic
Cell differentiation
Cell development, stem cell
Cell proliferation, scattering,
marker
Maintenance of epithelium
morphogenesis and survival
Cell differentiation and
Cell differentiation
angiogenesis
Cell
proliferation,
Cell differentiation and
chemotaxis and migration
Cell differentiation
angiogenesis
Cell differentiation
Cell differentiation
Cell differentiation
Cell differentiation
and
homolog
4 homolog
Smoothened
Secreted protein acidic and rich in
Vascular endothelial growth factor A
cysteine
Vascular endothelial growth factor B
Vascular endothelial growth factor
Proto-oncogene Wnt-1
receptor 2
43
signal
transduction
Cell differentiation
Cell growth
Cell differentiation
Cell differentiation
angiogenesis
Cell differentiation
angiogenesis
Cell differentiation
angiogenesis
SMAD4
SMO
SPARC
VEGFA
VEGFB
VEGFR-2
WNT1
gene
for
and
proliferation,
and
and
and
2.3 Sequenziamento del DNA e valutazione KRAS
I campioni tumorali fissati in formalina ed inclusi in paraffina sono stati
analizzati per la ricerca di mutazioni di KRAS a livello dell’esone 2, nel
codone 12 e 13. Il DNA è stato estratto da 5 sezioni in paraffina di spessore
10 micron contenenti cellule tumorali almeno il 50%, utilizzando il DNA
QIAamp Mini kit (Qiagen). Dopo la purificazione mediante kit di
purificazione QIAquick PCR, i prodotti della PCR (20ng) sono stati
aggiunti alla soluzione di reazione di sequenziamento composta da 2μL
BigDye® Terminator V1.1 Ready Mix di reazione (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA), 2μL Sequencing Buffer, 5 micron di primer inverso
in avanti, 3_l acqua distillata). La soluzione di reazione di sequenziamento
è stato sequenziata su ABI Prism 3100 sequenziatore di DNA (Applied
Biosystems). I primer utilizzati per KRAS sono stati i seguenti: codoni 12 e
13, forward: 5'-AAG GCC TGC TGA AAA TGA CTG-3' e reverse: 5'CAA AGA ATG GTC CTG CAC CAG-3'. L'analisi delle sequenze
prodotte per ogni campione è stata ottenuta dal sequenziamento tramite
Analisis Software 3.7.
44
2.4 Elaborazione dei dati ed analisi statistica
L'espressione genica relativa è stata quantificata con il metodo ΔCt
comparativo. Abbiamo utilizzato lo strumento ''PCR Array Data Analysis
Web Portal'' (http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis. Php)
sul sito del produttore per effettuare controlli di qualità dei dati, calcoli sui
dati qPCR e la normalizzazione dei dati. In particolare, tutti i cicli con
valori di soglia maggiore di 35 o non rilevati, sono stati considerati come
negativi. Abbiamo mantenuto i campioni di controllo negativi e positivi,
secondo le indicazioni del produttore.
Le caratteristiche cliniche e istopatologiche dei pazienti arruolati sono stati
analizzati nello studio. I dati sono stati raccolti in modo retrospettivo dalle
cartelle cliniche da database elettronici. La sopravvivenza globale (OS) è
stata definita come l’intervallo di tempo tra la diagnosi e l’evento (morte o
progressione). L'analisi di sopravvivenza è stata condotta con il metodo di
Kaplan-Meier mentre il Mantel-Haenszel log-rank test è stato impiegato per
confrontare la sopravvivenza tra i gruppi.
L'assunzione di proporzionalità dei rischi è stata verificata con analisi
grafica dei residui Schoenfeld in scala. Le variabili risultate non
significative all'analisi univariata sono state escluse dall’analisi multivariata.
La non-multicollinearità delle co-variate raggruppate è stata verificata. Il
livello di significatività all’analisi univariata per l'inclusione nel analisi
finale multivariata è stato più liberamente fissato a un livello di 0,2,
secondo Hosmer et al. Il test rapporto di verosimiglianza è stato condotto
45
per valutare il miglioramento delle prestazioni di previsione maturata dalla
eliminazione a ritroso di variabili dal modello prognostico.
Tutti gli altri livelli di significatività sono stati fissati ad un valore 0,05 e
tutti i valori P a due code. L'analisi statistica è stata condotta con la "R"
software statistico versione 2.15.2.
46
3. RISULTATI
3.1 Caratteristiche dei pazienti
Un totale di 42 pazienti sottoposti a resezione per carcinoma pancreatico
KRAS wild type presso l’Azienda Ospedaliero-Universitaria-Ospedali
Riuniti di Ancona, nel periodo 2002-2013. I pazienti includevano 15
femmine (36%) e 27 maschi (64%) di età media 67 anni (range 47-81 anni).
All’esame istologico, la maggior parte dei pazienti presentava uno stadio
pT3 (81%), mentre il 14% dei pazienti presentava stadio pT2 e il restante
5% uno stadio pT1.
Trentadue pazienti (76%) presentavano coinvolgimento linfonodale (pN1)
mentre nei restanti 10 (24%) non erano presenti metastasi linfonodali. La
maggior parte dei pazienti presentava un grading istopatologico
scarsamente o moderatamente differenziato ed in particolare nel 43% dei
pazienti si riscontrava una grading G2 e nel 21% un grading G3.
Altri quarantadue pazienti sottoposti a resezione per carcinoma pancreatco
KRAS mutato e con caratteristiche clinico-patologiche analoghe sono stati
inclusi nello studio come gruppo di controllo.
Tutte le caratteristiche demografiche e clinico-patologiche dei pazienti sono
riportate nella Tabella 2.
47
Tabella 2. Caratteristiche dei pazienti
Pazienti
KRAS WT
KRAS MUT
N°
42 (%)
42 (%)
Maschio
27 (64)
22 (52)
Femmina
25 (36)
20 (48)
Età Mediana
67
68
Range
(47-81)
(53-83)
T1
2 (5)
0 (0)
T2
6 (14)
7 (17)
T3
34 (81)
35 (83)
N0
10 (24)
11 (26)
N1
32 (76)
31 (74)
G1
3 (8)
5 (12)
G2
18 (43)
16 (38)
G3
9 (21)
10 (24)
Gx
12 (29)
11 (26)
Genere
Stadio TNM
Grading
48
3.2 Analisi dell’espressione genica
I campioni relativi ai 42 pazienti con carcinoma pancreatico KRAS WT
sono stati analizzati in relazione all’espressione genica del panel di 29 geni
riportati in Tabella 1. Questi dati sono stati quindi confrontati con i livelli di
espressione degli stessi geni nei 42 campioni di carcinoma pancreatico
KRAS MUT.
L'analisi dei dati di espressione genica ha mostrato che MUC6 (p = 0,009),
VEGFR-2 (p = 0,020) e VEGFR (p = 0.026) risultano significativamente
più espressi nei campioni di carcinoma pancreatico KRAS WT. Al
contrario, Sonic Hedgehog (p = 0.012) e Indian Hedgehog (p = 0,031) sono
risultati più espressi nei tumori KRAS MUT. Inoltre, SMAD4 è risultato
essere meno soppresso nel carcinoma del pancreas KRAS WT (p = 0,003)
ed HGF è risultato maggiormente espresso (p= 0.011). Tutti le altri
caratteristiche cliniche analizzate sono risultati ben bilanciate tra i due
gruppi. Un confronto tra le differenti espressioni geniche tra carcinomi
pancreatici KRAS WT e MUT è mostrato in Figura 8 e 9.
Inoltre, abbiamo studiato la correlazione tra l'espressione di ciascuno dei
sette geni che sono risultati espressi in modo diverso nei tumori mutati e
wild type e l'espressione degli altri geni analizzati in questo studio.
L'espressione di VEGFR-2 è risultata significativamente correlata con
l'espressione di SPARC (rho = 0,613; p <0.001). Per quanto riguarda
VEGFB, questo è risultato correlato all’espressione in modo statisticamente
significativo all’espressione di VEGFR-1 (rho = 0,744; p <0,001) e
49
PDGFR-beta (rho = 0.680; p <0,001). Inoltre, una correlazione significativa
è stata dimostrata tra espressione di SHH e di NOTCH1 (rho = 0,613; p
<0.001). Nessuna correlazione significativa è stata trovata invece per
MUC6, SMAD4 e IHH. I dati relativi gene correlazione sono mostrati nella
Figura 10.
50
Figura 8. Geni espressi maggiormente nei carcinomi KRAS MT
51
Figura 9. Geni espressi maggiormente nei carcinomi KRAS WT
52
Figura 10. Grafico a dispersione della correlazione tra i livelli di
espressione di diversi geni in tumori KRAS WT e MT
53
3.3 Correlazione tra stato mutazionale di KRAS e sopravvivenza
L’analisi della sopravvivenza ha evidenziato una sopravvivenza globale
(OS) mediana di 11,1 mesi (95% CI 10.1-17.3 mesi) nella popolazione
generale. Nessuna differenza significativa è stata trovata all’analisi di
Kaplan-Meier stratificando i pazienti per età alla diagnosi (log-rank p = 0,1)
o genere (log-rank p = 0,44).
I dati sulle mutazioni di KRAS sono riportati nella Tabella 3. Non sono
state riscontrate differenze significative in termini di sopravvivenza tra
pazienti con carcinoma pancreatico WT o MT (log-rank p = 0.94).
Tabella 3. Frequenza delle diverse mutazioni di KRAS riscontrate
KRAS mutations
Patients (%)
GGTGAT
15 (36 )
GGTGTT
17 (40)
GGTCGT
6 (14)
GGTAGT
1 (2.5)
GGTTGT
1 (2.5)
GGTGAC
2 (5)
Nessuna significativa differenza in termini di sopravvivenza globale è stata
evidenziata confrontando i diversi tipi di mutazioni KRAS tra loro (Arg vs
Val + Asp + Cys log rank p = 0,37, Asp vs Val + Arg + Cys p = 0,33, Val
vs Asp + Arg + Cys di log-rank p = 0,53, Asp vs Val di log-rank p = 0.39,
54
Arg vs Asp log-rank p = 0,22, Arg vs Val di log-rank p = 0,66, Asp vs Val
log-rank p = 0,67) o verso il KRAS WT (Arg vs WT log-rank p = 0,44, Asp
vs WT log-rank p = 0,36, Val vs WT log-rank p = 0,70).
55
4. DISCUSSIONE
Nonostante recenti progressi ottenuti nel trattamento della malattia, in
particolare per quanto riguarda la chemioterapia, il carcinoma pancreatico
resta ancora oggi un problema medico non risolto; la malattia infatti
purtroppo continua ad avere una prognosi infausta sia dopo resezione
chirurgica che in caso di malattia avanzata. Una migliore conoscenza dei
meccanismi biomolecolari alla base del processo di carcinogenesi
pancreatica appare indispensabile per la formulazione e la messa a punto di
strategie ottimali di prevenzione, diagnosi e terapia del carcinoma
pancreatico.
La mutazioni attivanti del gene KRAS sono considerati tra le anomalie
genetiche più comuni nel carcinoma del pancreas e costituiscono anche un
evento precoce nella carcinogenesi pancreatica, anche se la loro influenza
sulla prognosi dei pazienti rimane ancora poco chiara.
Una recente revisione della letteratura ha riportato tassi variabili di
mutazioni di KRAS, dal 33% al 88%, mettendo in discussione l'ipotesi che
la mutazione di KRAS sia un evento ubiquitario nel carcinoma del pancreas
[96]. Tutto ciò trova conferma in una recente analisi retrospettiva su 136
pazienti affetti da tumore del pancreas avanzato trattati con chemioterapia a
base di gemcitabina. In questa serie, sono stati rilevati mutazioni di KRAS
56
ai codoni 12, 13 e 61, solo su 71 tumori pancreatici, con un tasso di
mutazione complessivo del 52,2% [97].
Considerando la scarsità di dati disponibili sulle alterazioni molecolari del
carcinoma del pancreas KRAS wild type, abbiamo studiato le differenze a
livello molecolare tra carcinomi pancreatici KRAS WT e MT.
È interessante notare come siano emerse differenze significative
nell'espressione di diversi geni, tra quelli riconosciuti come più importanti
nella carcinogenesi pancreatica, tra tumori KRAS WT e tumori KRAS MT.
SHH e IHH, due elementi del pathway di Hedgehog (HH), sono risultati
significativamente più espressi nelle neoplasie KRAS MT rispetto a quelle
KRAS WT. Questi risultati sono in accordo con i dati pre-clinici che
mostrano come l’aberrante attivazione Hedgehog collabori con la
mutazione del gene KRAS nel promuovere la formazione di lesioni
preneoplastiche (Pan-In) [98]. Inoltre recenti studi su linee cellulari e
modelli murini [99] hanno confermato come la mutazione di KRAS sia in
grado di indurre l’espressione di SHH e di conseguenza attivando il fattore
di trascrizione Gli-1. Questi dati supportano l’ipotesi che l’attivazione del
pathway di Hedgehog rappresenti un passaggio chiave della carcinogenesi
pancreatica mediata da KRAS e che pertanto possa rappresentare un driver
di progressione nel sottogruppo di pazienti con tumori pancreatici KRAS
MT. Questo ruolo nello sviluppo delle neoplasie pancreatiche rende
Hedgehog un potenziale bersaglio per il trattamento antitumorale. In un
recente studio di fase Ib/II [100], l’aggiunta di vismodegib, un inibitore di
57
SMO, a gemcitabina non ha dimostrato alcun beneficio in termini di tasso
di risposte obiettive, sopravvivenza libera da progressione (PFS) o
sopravvivenza globale (OS) in una popolazione non selezionata di pazienti
affetti da carcinoma pancreatico avanzato
Questi risultati scoraggianti potrebbero trovare parziale spiegazione nei
nostri dati. Infatti, il blocco del pathway di hedgehog potrebbe risultare
efficace non su tutta la popolazione di pazienti con carcinoma pancreatico
ma in maniera selettiva sui pazienti con mutazione di KRAS, nei quali,
come abbiamo visto questa via di segnale sembra rappresentare uno dei
driver della progressione tumorale.
Nei pazienti KRAS MT abbiamo evidenziato una correlazione significativa
tra espressione di Notch1 e SHH. Come abbiamo visto, sia la via di segnale
di Notch che quella di Hedgehog hanno dimostrato di promuovere la
proliferazione neoplastica e sono coinvolte nel cross-talk tra cellule
epiteliali maligne del pancreas e stroma. Tuttavia, la relazione gerarchica
tra queste due vie di segnale non è ancora chiara. Infatti, potrebbe
verificarsi una iperattivazione del pathway di Notch a valle della via di
Hedgehog durante la progressione tumorale, tuttavia non è possibile
escludere che Notch possa attivare il pathway Hedgehog, come riportato in
altri contesti [101].
Nei tumori KRAS WT abbiamo trovato livelli di espressione più elevati di
VEGFR-2, VEGFB, HGF e MUC6 rispetto ai tumori MT. Questa
osservazione fornisce alcuni elementi riguardo le alterazioni molecolari più
58
rilevanti nel carcinoma pancreatico KRAS WT. Il VEGF ha un forte effetto
mitogenico sulle cellule tumorali pancreatiche e questo effetto è mediato
principalmente da VEGFR-2 [102]. VEGFR-2 ha dimostrato di essere
sovraespresso in una percentuale significativa di pazienti affetti da
carcinoma del pancreas. In uno studio su 24 neoplasie del pancreas,
VEGFR-2 mRNA è risultato essere sovraespresso nel 63% dei campioni ed
è risultato correlato con una scarsa differenziazione del tumore. Inoltre, i
pazienti con sovraespressione di VEGFR-2 hanno mostrato una
sopravvivenza globale significativamente inferiore. I nostri risultati
confermano che la via di segnalazione del VEGF può rappresentare un
driver di progressione tumorale nel sottogruppo di carcinomi del pancreas
KRAS WT. È interessante a questo proposito ricordare come un anticorpo
monoclonale che blocca VEGFR-2, ramucirumab, si sia recentemente
dimostrato efficace nel trattamento del carcinoma gastrico avanzato
pretrattato, sia in monoterapia che in combinazione con paclitaxel [103].
Questi dati, se ulteriormente confermati, potrebbero suggerire la
valutazione di ramucirumab anche nel trattamento del carcinoma del
pancreas KRAS WT.
Un altro risultato interessante del nostro lavoro è l'osservazione che il gene
SMAD4 risulta significativamente meno soppresso nei tumori KRAS WT.
SMAD4 è un gene oncosoppressore frequentemente inattivato nei tumori
pancreatici [104]. SMAD4 è un mediatore fondamentale della via di segnale
del fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e la perdita di SMAD4 nelle
59
cellule tumorali pancreatiche consente di superare l’inibizione della crescita
TGF β - indotta. I nostri risultati suggeriscono che la perdita di SMAD4
possa rappresentare un evento frequente nei carcinomi pancreatici KRAS
MT ma non in quelli KRAS WT. Una possibile ricaduta clinica di questo
dato deriva dal fatto che la perdita di SMAD4 è stata correlata sia con la
prognosi che con il pattern di progressione del carcinoma pancreatico. In
particolare, la perdita di SMAD4 è stata correlata ad una maggior tendenza
della malattia alla diffusione sistemica con una maggior tendenza alla
progressione esclusivamente locoregionale per le neoplasie che esprimono
tale molecola [105].
Anche HGF (Hepatocyte Growth Factor) è risultato maggiormente espresso
nelle neoplasie KRAS WT rispetto a quelle con mutazione di KRAS nella
nostra analisi. L’asse HGF/c-MET rappresenta un meccanismo di
progressione tumorale in numerose neoplasie, tra cui il carcinoma
pancreatico. In particolare, nel carcinoma pancreatico il pathway di HGF/cMET appare svolgere un ruolo chiave nella relazione tra elementi stromali
ed elementi epiteliali della neoplasia [106]. E’ interessante notare come
dagli studi sia emerso come HGF svolga un ruolo anche nell’attivazione dei
processi di angiogenesi, insieme agli elementi della famiglia del VEGF,
anch’essi risultati iperespressi nelle neoplasie KRAS WT nel nostro studio.
Anche l’espressione di MUC6 è risultata significativamente maggiore nelle
neoplasie KRAS WT rispetto a quelle mutate. MUC6 è un componente
della famiglia delle mucine, glicoproteine di membrana espresse dalle
60
cellule epiteliali normali o tumorali. E’ stato dimostrato come l’espressione
delle mucine subisca variazioni durante il processo di carcinogenesi a
livello pancreatico e MUC6 sembra essere tra quelle maggiormente
coinvolte nella progressione tumorale con meccanismi non ancora del tutto
chiariti [107].
Sebbene lo stato mutazionale di KRAS sia risultato associato all’attivazione
di diverse vie molecolari nella nostra analisi, non sono emerse differenze
significative in termini di sopravvivenza tra i due sottogruppi di pazienti
(WT vs MT). Questo dato sembra essere in accordo con controversi
presenti in letteratura. In effetti, il ruolo prognostico della mutazione di
KRAS nel carcinoma del pancreas resta ancora controverso. Nel corso degli
ultimi anni diverse analisi sul ruolo delle mutazioni KRAS come
biomarcatori in questa neoplasia sono stati pubblicati con risultati
contraddittori. Alcuni studi suggeriscono un valore prognostico negativo in
termini di sopravvivenza per le mutazioni del gene KRAS [108-110]. In una
delle più grandi serie di casi pubblicati su pazienti affetti da carcinoma del
pancreas resecabile, è stata osservata una miglior sopravvivenza per i
pazienti KRAS WT sia in analisi univariata (26,4 vs 14,3 mesi, p = 0.001)
che in analisi multivariata (odds ratio, 1.63, p = 0.011) [111]. Tuttavia, altri
studi non hanno confermato questo dato [112], ed altri autori hanno
osservato che la presenza della mutazione KRAS da sola non era correlata
con la sopravvivenza, mentre la sopravvivenza variava in maniera
significativamente sulla base del tipo di mutazione di KRAS [113].
61
Complessivamente la sopravvivenza mediana osservata nel nostro
campione (circa 11 mesi) è piuttosto bassa se paragonata a quanto riportato
negli studi clinici. Tuttavia è importante sottolineare come gran parte dei
pazienti presentasse malattie in stadio avanzato, pT3 e N1, e come la
casistica includesse anche pazienti in età molto avanzata (fino ad 83 anni) e
pertanto a maggior rischio di mortalità perioperatoria.
In conclusione, i nostri risultati forniscono alcune indicazioni circa
l'eterogeneità molecolare del carcinoma del pancreas con possibili
conseguenze sul disegno di futuri studi clinici. Studi recenti, in accordo con
la nostra analisi, suggeriscono che le mutazioni di KRAS sono eventi
comuni ma probabilmente non ubiquitari nella carcinogenesi pancreatica.
Lo stato mutazionale del gene KRAS sembra poter individuare due diversi
sottotipi di carcinoma del pancreas con caratteristiche molecolari distinte e
quindi con possibili differenti bersagli terapeutici. L'elevata espressione di
SHH e IHH dimostrato nel carcinoma del pancreas KRAS MT suggerisce
che questo possa rappresentare un sottogruppo di tumori in cui l'uso di
inibitori di Hedgehog potrebbe essere maggiormente efficace. D'altro canto,
l'elevata espressione di geni correlati alla angiogenesi, come VEGFR-2 e
VEGFB, nei tumori KRAS WT, suggerisce la possibile attività di farmaci
anti-angiogenici in questo sottotipo di tumori pancreatici. Queste
osservazioni, se confermato da ulteriori studi, potranno essere utili nella
progettazione, oltre che nella selezione dei pazienti, di futuri studi clinici
che valuteranno terapie a bersaglio molecolare nel carcinoma del pancreas.
62
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