INFINITI KRAS-BRAF Metodica Ad Uso diagnostico

AutoGenomics
INFINITI® KRAS-BRAF
Metodica
Ad Uso diagnostico in Vitro
Prodotto da AutoGenomics, Inc., 2251 Rutherford Road, Carlsbad CA USA 92008
Rappresentante EU autorizzato:
BÜHLMANN Laboratories AG
Baselstrasse 55 CH-4124, Schönenbuch, Svizzera
Doc. EM-34045 I (Italiano) - Rev. A (CO 2149) Maggio 2012
AutoGenomics, 2980 Scott St, Vista, CA 92081 Tel: 760 477 2248 Fax: 760 477 2252
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AutoGenomics
USO
The INFINITI KRAS-BRAF è un test diagnostico in vitro per la rilevazione e l’identificazione dei più
diffusi cambiamenti degli aminoacidi KRAS e BRAF in posizioni note per influenzare la funzione delle
proteine. Queste mutazioni sono identificate per rilevare le loro varianti nei codoni o le modifiche nei
nucleotidi. Il test INFINITI KRAS-BRAF è progettato per rilevare queste mutazioni in campioni di tessuto
fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE).
Il test INFINITI KRAS-BRAF è un test qualitativo per l’uso in laboratori clinici su prescrizione del medico
curante.
INFORMAZIONI
KRAS
Il prodotto proteico del gene KRAS normale svolge una funzione essenziale di segnale nei tessuti normali,
e la mutazione di un gene KRAS è un passaggio essenziale nello sviluppo di molti tumori, tra cui
l’adenocarcinoma polmonare, l’adenoma mucinoso, il carcinoma duttale del pancreas e il carcinoma
colonrettale. La mutazione KRAS - cancro colonrettale è predittiva di una risposta molto scarsa alla
panitumumab (Vectibix®) e al cetuximab (Erbitux®) nella terapia del cancro del colon-retto.[1] Attualmente,
il modo più affidabile per prevedere se un malato di cancro colonrettale risponderà ad uno dei farmaci
inibitori dell’EGFR è testare alcune mutazioni "attivanti" nel gene che codifica KRAS, che si verificano nel
40% dei tumori colonrettali. Gli studi dimostrano che i pazienti i cui tumori esprimono la versione mutata
del gene KRAS non rispondono al cetuximab o al panitumumab.[2]
Cancro al polmone - Se un paziente è positivo o negativo per una mutazione nel recettore del fattore di
crescita epidermico (EGFR) sarà prevedibile la risposta dei pazienti ad alcuni farmaci EGFR come
Tarceva. I pazienti EGFR positivi hanno un tasso elevato di risposta del 60% a Tarceva. Tuttavia, la
positività KRAS e la positività EGFR generalmente si escludono a vicenda. [3] [4] [5] I malati di cancro ai
polmoni, KRAS positivi, hanno un basso tasso di risposta a Tarceva stimato al 5% o meno.[3]
Nel luglio 2009, la US Food and Drug Administration (FDA) ha aggiornato le etichette di due farmaci
anticorpo monoclonale anti-EGFR (panitumumab (Vectibix) e cetuximab (Erbitux)) indicato per il
trattamento del cancro colonrettale metastatico includendo informazioni sulle mutazioni del gene KRAS.[ 6]
BRAF
BRAF è un gene umano che produce una proteina chiamata B-Raf. La proteina B-Raf è coinvolta nella
trasmissione dei segnali all'interno delle cellule, a loro volta coinvolti nella crescita cellulare. Nel 2002, è
stato dimostrato che questo gene è difettoso (mutato) nei tumori umani. [6]
Le mutazioni acquisite in questo gene sono stati riscontrate nei tumori, tra cui il linfoma non-Hodgkin, il
cancro colon-rettale, il melanoma maligno, il carcinoma papillare della tiroide, il carcinoma non a piccole
cellule del polmone, e l’adenocarcinoma del polmone. [7]
Sono stati identificate più di 30 mutazioni del gene BRAF associate a tumori umani. La frequenza di
mutazioni BRAF varia ampiamente nei tumori umani da oltre il 80% nei melanomi e nevi, a soli 0-18% in
altri tumori, come 1-3% in tumori polmonari e 5% nel cancro colonrettale.[10] Nel 90% dei casi, la timina
viene sostituita con l’adenina al nucleotide 1799. Questo porta a valina (V) che viene sostituita da
glutammato (E) in corrispondenza del codone 600 (ora indicato come V600E) nel segmento di attivazione
che è stato trovato nei tumori umani. [11] Questa mutazione è stata ampiamente osservata nel carcinoma
papillare della tiroide , nel cancro colon rettale, nel melanoma e nel cancro a cellule non-piccole del
polmone. [8][9][10][11][12][13][14]
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PRINCIPIO DEL DOSAGGIO
Il dosaggio INFINITI® KRAS-BRAF è stato progettato per rilevare i più diffusi cambiamenti degli
aminoacidi KRAS e BRAF nelle posizioni note ad influenzare la funzione delle proteine. Queste mutazioni
sono state identificate per rilevare le loro varianti del codone o le modifiche del nucleotide.
Gene
Codone
KRAS
12
13
61
BRAF
600
Analita
G12A
G12C
G12D
G12F
G12R
G12S
G12V
G13A
G13C
G13D
G13R
G13S
G13V
Q61E
Q61H1
Q61H2
Q61K
Q61L
Q61P
Q61R
V600A
V600D
V600E1
V600E2
V600KRM
Mutazioni rilevate
Gly12Ala
Gly12Cys
Gly12Asp
Gly12Phe
Gly12Arg
Gly12Ser
Gly12Val
Gly13Ala
Gly13Cys
Gly13Asp
Gly13Arg
Gly13Ser
Gly13Val
Gln61Glu
Gln61His
Gln61His
Gln61Lys
Gln61Leu
Gln61Pro
Gln61Arg
Val600Ala
Val600Asp
Val600Glu
Val600Glu
Val600Lys
Val600Arg
Val600Met
c.35G>C
c.34G>T
c.35G>A
c.34_35GG>TT
c.34G>C
c.34G>A
c.35G>T
c.38G>C
c.37G>T
c.38G>A
c.37G>C
c.37G>A
c.38G>T
c.181C>G
c.183A>C
c.183A>T
c.181C>A
c.182A>T
c.182A>C
c.182A>G
c.1799T>C
c.1799_1800TG>AT
c.1799T>A
c.1799_1800TG>AA
c.1798_1799GT>AA
c.1798_1799GT>AG
c.1798G>A
GGT>GCT
GGT>TGT
GGT>GAT
GGT>TTT
GGT>CGT
GGT>AGT
GGT>GTT
GGC>GCC
GGC>TGC
GGC>GAC
GGC>CGC
GGC>AGC
GGC>GTC
CAA>GAA
CAA>CAC
CAA>CAT
CAA>AAA
CAA>CTA
CAA>CCA
CAA>CGA
GTG>GCG
GTG>GAT
GTG>GAG
GTG>GAA
GTG>AAG
GTG>AGG
GTG>ATG
Il protocollo di dosaggio comprende i seguente cinque passaggi principali:
a) Multiplex PCR amplificazione del DNA.
b) Incorporazione del marcato fluorescente usando l’estensione del primer analita specifico
c) (ASPE).
d) Ibridazione dei primer ASPE su un microarray e successivo lavaggio.
e) Scansione del microarray.
f) Rilevazione del segnale e analisi.
I passaggi da (b) a (e) sono automatizzati dall’analizzatore INFINITI marchiato CE.
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Di seguito uno schema dei passaggi.
Multiplex PCR
ASPE Rxn
a bordo dell’
INFINITITM
Campione paziente
(25-50 ng, DNA)
Ibridazione agli oligo
adesi
ai BioFilm Chip
Analisi Dati
&
Report Risultati
Lavaggio &
Asciugatura
Scansione Chip
DESCRIZIONE DEL DISPOSITIVO
Il test INFINITI KRAS-BRAF utilizza una tecnologia con microarray basata su pellicole brevettata da
AutoGenomics combinata con una automazione del processo, una gestione dei reagenti ed una tecnologia
software per la rilevazione multipla dei più diffusi cambiamenti di aminoacidi KRAS e BRAF in posizioni
note per influenzare la funzione delle proteine. Queste mutazioni sono identificate rivelando le loro
varianti nei codoni o modifiche nei nucleotidi.
Il test INFINITI KRAS-BRAF comprende il BioFilmChip® Microarray, il Modulo Reagente Intellipac® ed
il Mix di Amplificazione PCR.
Il BioFilmChip Microarray consiste di un film di poliestere rivestito con componenti multistrato
proprietarie progettato per analisi del DNA. Gli strati sono stati progettati per fornire una superficie
versatile per migliorare le prestazioni del test. Il test INFINITI KRAS-BRAF utilizza un microarray chip
che ha sonde di cattura coattate sulla superficie della pellicola. Un campione può essere eseguito su un
microarray. Dodici (12) microarray sono alloggiati in un caricatore.
L’ Intellipac Reagent Module che funziona come collegamento della comunicazione contiene quattro
serbatoi che alloggiano i reagenti e ha un chip di memoria integrato. Le informazioni sul reagente quali
numero di lotto, data di scadenza, e volume sono memorizzate nel chip di memoria. Intellipac Reagent
Module comunica con l'analizzatore INFINITI e fornisce le informazioni sul reagente che compaiono sul
referto e la stampa del dosaggio. Intellipac Reagent Management Module fornisce il reagente sufficiente
per 24 campioni.
PCR Amplification Mix comprende i reagenti necessari per il passaggio di amplificazione PCR del
dosaggio. Ciascuna confezione di PCR Amplification Mix comprende 4 x 250µl flaconi di PCR
Amplification.
L’ Analizzatore INFINITI automatizza il test INFINITI KRAS-BRAF ed integra tutti i processi discreti
di manipolazione del campione (prodotto di reazione PCR), gestione dei reagenti, ibridazione, rilevamento
e analisi dei risultati. I dosaggi vengono elaborati automaticamente e letti dal microscopio confocale
incorporato. I risultati sono analizzati e presentati come positivi o negativi in caso di presenza e/o assenza
delle mutazioni.
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Le istruzioni su come usare l’Analizzatore INFINITI sono fornite nel Manuale dell’Operatore
dell’Analizzatore INFINITI.
L’Analizzatore INFINITI è marchiato CE.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Requisiti per manipolazione
Ad uso diagnostico in vitro. Da utilizzarsi da personale di laboratorio qualificato.
Questo test
deve essere usato soltanto con sangue intero prelevato con EDTA.
Non
congelare/scongelare campioni ematici. I campioni devono essere dosati appena possibile.
Tutti i campioni dei pazienti sono potenzialmente pericolosi e si deve prestare attenzione quando si
manipolano materiali di origine umana. Nessuna procedura può offrire la certezza assoluta che HCV,
HIV o altri agenti infettivi siano assenti.
Seguire le Linee Guida CLSI (Molecular Diagnostics Methods for Infectious Diseases;
Approved Guidelines; MM3-A).
Al ricevimento dei campioni, controllare visivamente le condizioni del campione stesso. In particolare,
cercare i segni anomali che stiano ad indicare che l'integrità del campione è stata compromessa (per
esempio, evaporazione, riduzione in volume, precipitazione, fuoriuscite, decolorazione,
sedimentazione, separazione, torbidità, ecc.). Se si osserva o si sospetta qualche anomalia, non
eseguire alcun test.
I campioni devono essere manipolati con estrema cautela per evitare contaminazione, fuoriuscita,
mescolanza di campioni. I contenitori del campione devono essere identificati chiaramente con
etichetta per evitare mescolamenti.
Conservare i campioni nelle condizioni specifiche.
Per limitare al minimo il rischio delle contaminazioni crociate, la preparazione del campione,
l’impostazione della reazione di PCR e l’analisi del prodotto della PCR devono essere eseguiti secondo
le linee guida approvate come CLSI (Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases: Approved
Guideline).
Non unire/mescolare reagenti di lotti diversi.
Non usare kit o reagenti oltre la data di scadenza.
Conservare kit e reagenti come indicato sull’etichetta del prodotto.
Procedure di laboratorio
Seguire le normali precauzioni per la manipolazione dei reagenti in laboratorio.
Seguire le procedure di sicurezza in laboratorio: non pipettare con la bocca; indossare indumenti
protettivi (ad es. guanti monouso e camici da laboratorio) e protezione per gli occhi; non mangiare,
bere o fumare in laboratorio nelle aree di lavoro del laboratorio; lavare le mani accuratamente dopo
aver manipolato campioni e reagenti.
Smaltimento rifiuti
Smaltire i reagenti inutilizzati, i campioni ed i rifiuti in base alle disposizioni vigenti nazionali,
federali, statali e locali.
Le Schede di Sicurezza (MSDS) sono disponibili su richiesta.
Preparazione del Campione
Fare riferimento alle istruzioni di sicurezza sulla metodica fornita con il kit di estrazione del DNA in
uso.
Il prodotto della PCR non può essere conservato prima di caricarlo sul microarray. Usare
immediatamente.
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Analizzatore INFINITI
Leggere il Manuale dell’Operatore dell’Analizzatore INFINTI prima di usare lo strumento.
Attenzione particolare alle “Note”.
Seguire Avvisi di sicurezza e Precauzioni presenti nel Manuale dell’Operatore.
Fare riferimento alla Sezione Requisiti per l’installazione durante l’installazione dello strumento.
Fare riferimento alla Sezione Errori quando si presentano errori durante l’operatività del sistema.
Fare riferimento alla Sezione Help quando si riscontrano problemi.
CONSERVAZIONE / STABILITÀ
BioFilmChip Microarray:
12 mesi refrigerati (da 2 a 8oC)
Intellipac Reagent:
12 mesi refrigerati (da 2 a 8oC)
Nota: Non usare se Intellipac è aperto da tre settimane
Amplification Mix:
18 mesi congelato (-10oC)
Nota: la data di scadenza specifica del prodotto è stampata sull'etichetta del prodotto
MATERIALI FORNITI (SUFFICIENTI PER 24 TEST)
Catalogo Numero 02-1110-02 INFINITI KRAS-BRAF BioFilmChip® Microarray Magazine
Catalogo Numero 02-2110-02 INFINITI KRAS-BRAF Intellipac® Reagent Module
24 tests per modulo che contiene
1.1 ml ASPE Master Mix:
dNTPs
Labeled-dCTP
Allele Specific Primers
Extension Reaction Buffer
2.6 ml Hybridization Buffer
SSC
Hybridization Positive Control
Sodium Azide Preservative 0.08%
Catalogo Numero 02-3110-02 INFINITI KRAS-BRAF Amplification Mix
4 x 250µl vials di PCR reaction master mix contenente
dNTPs
PCR Primer Mix
MgCl2
PCR Reaction Buffer
Catalogo Numero 12-0010-00 Tampone lavaggio
REAGENTI RICHIESTI MA NON FORNITI DA AUTOGENOMICS
Kit Estrazione DNA – Il test INFINITI KRAS-BRAF può rilevare le mutazioni target KRAS e BRAF
usando DNA genomico, isolato su campioni di tessuto fissato con formalina ed incluso in paraffina
(FFPE), grado di purezza sufficiente, ad es. con un rapporto di assorbanza da 260 nm a 280 nm ≥
1.60, ed una concentrazione di 15ng DNA/μl. Può essere usato qualsiasi metodo di estrazione del
DNA che soddisfa questi requisiti. Il test INFINITI KRAS-BRAF è stato testato con molti kit
disponibili in commercio. L’utilizzatore può contattare il Servizio Prodotti per ulteriori informazioni.
Titanium Taq DNA Polymerasi (Clontech, Catalogo N: 639209 )
Esonucleasi I (USB, Catalogo N: 70073X)
Fosfatasi Alcalina di Gamberetto (USB, Catalogo N: 70092)
Acqua distillata (DNAsi e RNAsi libera)
ATTREZZATURA
Attrezzature necessarie ma non fornite con i reagenti del test
AutoGenomics Catalogo Numero 10-0010-99 INFINITI Analizzatore
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AutoGenomics Catalogo Numero 11-0020-00 INFINITI Waste Tray Liners
AutoGenomics Catalogo Numero 11-0030-00 INFINITI micropiastre da 24 pozzetti/coperchi
AutoGenomics Catalogo Numero 11-0050-00 INFINITI Piastra Temp Cycle
AutoGenomics Catalogo Numero 11-0060-00 INFINITI Waste tray / Stir Bars
AutoGenomics Catalogo Numero 11-0080-00 INFINITI Puntali per pipette
8-well Flat Strip Caps - tappini in strip da 8 (Genesee Scientific, Catalogo N. 22-623)
Pipette
Mini Centrifuga
Rack per provette da microcentrifuga
Termociclatore
Vortex
Provette da 1.5 ml per Microcentrifuga
Controlli DNA Consigliati
Si consiglia di inserire in ogni seduta controlli positivi. Inoltre, inserire anche un controllo negativo (ad es.
un controllo tipo wild). Le linee cellulari o DNA disponibile in commercio con mutazioni KRAS-BRAF
note possono essere usate come controlli positivi (www.atcc.org). Se si acquistano linee cellulari, dovranno
essere coltivate e poi dovrà essere isolato il DNA genomico. Contattare il Servizio Prodotti per ulteriori
informazioni.
Procedura del dosaggio
Estrazione DNA
Seguire le istruzioni fornite con il kit di estrazione del DNA in uso.
Reazione PCR
Nota: Mantenere la Platinum Taq DNA polimerasi su ghiaccio.
Lasciare scongelare completamente i reagenti su ghiaccio.
Per evitare contaminazione, si consiglia di eseguire la reazione PCR in un’area separate.
Decontaminare pipette e tutte le superfici di lavoro con ipoclorito di sodio (candeggina) 0.5%
preparato fresco in acqua deionizzata o distillata.
Quando si manipolano campioni e controlli si devono utilizzare puntali con filtro e guanti .
1.
Lasciare scongelare Amp mix su ghiaccio, centrifugare brevemente, vortex da 2 a 5 secondi e
centrifugare brevemente.
2.
Preparare il PCR master mix.
PCR master mix di reazione
Titanium Taq DNA polymerasi
Volume totale di PCR master mix
17.8 µl
0.2 µl
18.0 µl
Nota: Calcolare la quantità di ciascun reagente necessario in base al numero di reazioni.
3.
Vortex delicatamente la PCR master mix quindi dispensare 18 µl di master mix nei pozzetti della
micropiastra.
4.
Aggiungere 2 µl di campione di DNA in ciascun pozzetto.
PCR master mix
Campione di DNA
Volume totale per la reazione di amplificazione
18.0 µl
2.0 µl
20.0 µl
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5.
Posizionare la micropiastra, sigillata, in un termociclatore e comincia immediatamente la reazione
di Amplificazione usando il programma che segue.
Step N.
1
2
3
4
Nota:
Temperatura °C
94
94
67 – 57 (-1.0/ciclo)
94
57
94
4
Tempo (sec)
120
15
15
15
15
15
Hold
N. di cicli
1
10
30
1
Dopo ogni ciclo nel passaggio 2 la temperatura diminuisce di 1.0°C. Utilizzando un Mastercycler
PE Eppendorf con una ramp rate regolata al 75%, il tempo totale dell’amplificazione è di 1 ora e 4
minuti (+5 min). Se si utilizzano altri modelli di termociclatore si consiglia di regolare la ramp
rate in maniera tale da ottenere un tempo totale equivalente.
Trattamento SAP ed Esonucleasi I
La purificazione del campione dopo la PCR è un passaggio fondamentale per garantire che i substrati
rimanenti non interferiscano con l'amplificazione del segnale.
1.
Preparare una miscela di enzimi come la master mix. Ad esempio, se ci sono 9 reazioni PCR,
preparare una master mix sufficiente per 10 reazioni pipettando 15μl di SAP, 3.75μl di
Esonucleasi, e 1.25μl di Titanium Taq.
Miscela enzimi (per reazione):
SAP
Esonucleasi I
Titanium Taq
Volume totale di reazione
1.500 μl
0.375 μl
0.125 μl
2.000 μl
2.
Vortex da 2 a 5 secondi e centrifugare brevemente.
3.
Dispensare 2 μl della miscela enzimi per reazione nella reazione PCR completa, sigillare con i
tappini.
4.
Vortex da 1 a 2 secondi e Centrifugare brevemente.
5.
Incubare in termociclatore usando le condizioni che seguono.
Step N.
1
2
3
Temperatura °C
37
94
4
Tempo (min)
60
20
Hold
Caricamento Campioni – Analizzatore INFINITI
Seguire le istruzioni riportate nel Manuale dell’Operatore Dell’Analizzatore INFINITI (Numero Parte
EM 34000).
Dispensare 20 µl di prodotto della PCR nelle piastre a pozzetti 3x8 e caricare sull’analizzatore
INFINITI.
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Caricare i caricatori specifici per il test e Intellipac, puntali e tampone di lavaggio.
Operazioni sull’Analizzatore INFINITI
Fare riferimento al Manuale dell’Operatore Dell’Analizzatore INFINITI (Numero Parte EM 34000).
CONTROLLO DI QUALITÀ
Il termociclatore utilizzato deve essere regolarmente mantenuto e calibrato con uno standard per la
temperatura esterna, secondo i requisiti normativi e di controllo di qualità del laboratorio.
Mantenere la calibrazione dell’Analizzatore INFINITI ® secondo le indicazioni di AutoGenomics.
LIMITAZIONI
I risultati ottenuti dal test KRAS-BRAF INFINITI devono essere utilizzati e interpretati soltanto nel
contesto di una diagnosi clinica globale. AutoGenomics non è responsabile di eventuali decisioni cliniche
che vengono prese.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Quando l'integrità di un campione è in discussione a causa della quantità di DNA non ottimale e/o alla
qualità, un amplicone potrebbe non riuscire a soddisfare la soglia minima del software per la rilevazione
della mutazione con conseguenti blanked out calls. In questo caso, compare un asterisco nella colonna dell’
analisi e la seguente dicitura: "Le calls non sono fatte per ampliconi che non soddisfano i requisiti minimi
per l'identificazione della mutazione" viene stampata nella parte inferiore della pagina dei risultati. In
questi casi, può essere necessario ripetere un campione utilizzando più DNA (fino a 4μl) nella reazione
PCR.
Se ci sono positivi multipli imprevisti all'interno dello stesso esone da un campione di DNA, allora si
riducono le probabilità che sia stato ottenuto il prodotto della PCR, o che le prestazioni del test non sia stata
ottimale. In questo caso, il test per quel campione deve essere ripetuto.
Quando il dosaggio non è completata, e nessuna “genotype call” è stata ottenuta, il test dovrà essere
ripetuto. Il report visualizza un messaggio che indica il motivo per cui non è stata ottenuta nessuna
“genotype call”. Quando si verifica un errore (ad esempio, "DNA basso"), un registro degli errori che
identifica il problema viene generato. Si prega di fare riferimento alla sezione Risoluzione dei problemi del
Manuale dell'Operatore dell’Analizzatore INFINITI.
CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
Specificità Analitiche
Studi relativi alla specificità sono stati condotti durante lo sviluppo del test. Ci sono tre livelli di specificità
richiesti nel test.
PCR primers
ASP – target binding region
ASP – chip binding region
La specificità del PCR primer è stata determinata dalla misura dell’amplicon su gel ed il sequenziamento
dell’amplicon. La specificità dell'ASP primer è stata determinata dalle correct calls effettuate mediante il
test utilizzando campioni noti (ad es. Coriell). La specificità della sonda di cattura è determinata mediante
ibridazione di oligonucleotidi differenti dimostrando che solo l'oligo corretto ibridizza allo spot noto..
Limite di Rilevazione
Uno studio sul limite di rilevazione è stato condotto per dimostrare il range ottimale di rilevazione per il
test INFINITI KRAS-BRAF. Due campioni noti di DNA sono stati diluiti a 30ng, 15ng e 5ng. Questo è
equivalente a 60, 30 e 10ng per test. L’ input DNA target/raccomandato è 30ng per test. Otto (8) replicati
di ciascun campione diluito è stato dosato.
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I due campioni sono HTB-26D positivo per G13D, e HTB-38D positivo per V600E1.
Tutti e 24 i test per HTB-26D hanno dato correct call.
Tutti e 24 HTB-38D sono positivi per V600E1, tuttavia, tre (3) di questi campioni sono positivi
anche per Q61E, ed uno positivo per G13D e Q61K. Ciò può essere dovuto ad un DNA
amplificato in maniera non completa.
Los tudio ha dimostrato che il range di rilevazione ottimale per il test INFINITI KRAS-BRAF è compreso
fra10 e 60ng DNA input per test.
Riproducibilità
Uno studio è stato effettuato per dimostrare l'efficacia del test utilizzando diversi lotti di reagenti, diversi
strumenti e diversi operatori e in giorni diversi. Lo studio è stato condotto per dimostrare che i reagenti
INFINITI KRAS-BRAF possono essere fabbricati in modo che rispettino regolarmente le specifiche di test
e dare le corrette genotype calls.
I dati di riproducibilità rappresentava sei (6) lotti di reagente Intellipac, cinque (5) lotti di AMP Mix, sei
(6) lotti di microarray chips e quattro (4) Analizzatori INFINITI. I test sono stati eseguita da (3) operatori
e in giorni diversi. Gli stessi due campioni noti di DNA sono stati testati: uno positivo per G13D ed uno
positivo per V600E1.
I dati hanno dimostrato che i reagenti del test INFINITI KRAS-BRAF possono essere prodotti in modo da
soddisfare sistematicamente le specifiche del test. Ad eccezione di un test, tutti i test hanno dato correct
calls. Un test fallito aveva un elevato background derivante da un problema strumentale sospetto. I dati
grezzi del segnale (RFU) per questo test indicano una corret call.
Carry-over Campioni
Gli studi sul carry-over campioni sono stati eseguita usando linee cellulari ATCC ed un campione DNA
Coriell. HTB-26D (positivo per G13D), HTB-38D (positivo per V600E1), e NA 17017 (campione wild
type) sono stati dosati a diverse concentrazioni per determinare se un campione “trascina” sul successivo. I
risultati di questi studi hanno indicato l’assenza di carry-over fra i campioni.
Interferenza Potenziale da Farmaci/Sostanze Chimiche
I test KRAS-BRAF disponibili in commercio usano gli stessi campioni e metodi di estrazione ed hanno
dimostrato che la qualità del DNA non viene alterata da alcuna sostanza potenzialmente interferente.
Specificità Analitica – Confronto fra metodi
Gli studi di validazione clinica sono stati eseguita per validare i risultati del test INFINITI KRAS-BRAF
mediante sequenziamento o mediante un metodo di prova attualmente in uso in laboratorio (metodo di
confronto). Quanto segue sono le condizioni per gli studi clinici:
Campioni: campioni di tessuto fissati in formalina ed inclusi in paraffina (FFPE)
Metodo di estrazione: QIAmp DNA Kit
Concentrazione del DNA estratto: 15ng/μl
Criteri di accettabilità: ≥ 90% di concordanza con i metodi della concorrenza.
Studi di validazione clinica per la rilevazione della mutazione del gene KRAS compreso un riesame dei
due studi pubblicati (peer-reviewed) e i dati clinici reali dei laboratori clinici. Nel complesso, il test
INFINITI KRAS-BRAF ha fatto rilevare il 96.6% (201/208) di correct KRAS call e 1.4% (3/208) di
incorrect KRAS calls rispetto ai metodi di confronto, e ha ottenuto 1.4% (3/208) di no calls. Una (0.5%)
INFINITI call non era chiara.
Doc. EM-34045 I (Italiano) - Rev. A (CO 2149) Maggio 2012
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Gli studi di validazione clinica per la rilevazione della mutazione BRAF è stata fatta usando i risultati
clinici attuali. Il test INFINITI KRAS-BRAF ha rilevato 93.5% (43/46) correct calls e 2.2% (1/46)
incorrect calls confrontato ad altri metodi, e ha 4.3% (2/46) incorrect calls.
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Wikipedia KRAS web page April 24, 2012
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