Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains/FITC
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Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains/FITC
Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains/FITC, Rabbit F(ab’)2 Polyclonal Rabbit Anti-Human Lambda Light Chains/RPE, Rabbit F(ab’)2 Uso previsto Codice N. F0435 Codice N. R0437 Per uso diagnostico in vitro. F0435 e R0437 sono finalizzati per l’utilizzo nella citometria a flusso. Nella citometria a flusso, gli anticorpi anticatene leggere lambda sono utili per la dimostrazione delle catene leggere lambda di superficie cellulare e, pertanto, per l’identificazione di monoclonalità (eccesso clonale) nelle malattie linfoproliferative delle cellule B con un insieme di altri anticorpi (1-4). L’interpretazione dei risultati deve essere effettuata da patologi qualificati, nel contesto dell’anamnesi clinica del paziente e di altri test diagnostici. Introduzione La maggior parte delle cellule B, ad esclusione delle cellule pre-B e pre-B progenitrici e delle cellule plasmatiche mature, esprime immunoglobuline di superficie. Ogni cellula esprime soltanto un tipo di catena leggera. Nel sangue periferico e nei linfonodi normali c’è un insieme di cellule kappa positive e lambda positive, con due terzi delle cellule che esprimono le kappa e un terzo che esprime le lambda (5). Siccome i neoplasmi linfoidi sono normalmente espansioni clonali di una cellula singola, le cellule maligne esprimono uniformemente lo stesso isotopo di catena leggera. Le malattie linfoproliferative croniche neoplastiche delle cellule B possono spesso essere identificate utilizzando la dimostrazione di una predominanza marcata di cellule che esprimono un singolo tipo di catena leggera (4). Sono stati descritti rari casi di linfoma non-Hodgkin con cellule B lambdanegative o kappa-negative (4, 6). Reagente fornito I coniugati anti-catene leggere lambda, F0435 e R0437 sono stati prodotti da un frammento F(ab')2 di anticorpo policlonale di coniglio isolato per affinità. I coniugati vengono forniti in forma liquida in tampone contenente 1% di albumina sierica di bovino (BSA) e 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Utilizzare 10 µL di prodotto per la colorazione di un numero di leucociti da sangue periferico umano normale fino a 106. Concentrazione del coniugato g/L: Vedere l’etichetta della fiala Anticorpo Codice n. Fluorocromo Reagente Ig Codice n. F0435 Isotiocianato di fluorescina isomero 1 (FITC) X0929 R0437 R-ficoeritrina (RPE) X0930 Preparazione 1. L’anticorpo usato per la coniugazione dell’isotiocianato di fluorescina isomero 1 (FITC) e del coniugato di R-ficoeritrina è stato assorbito in fase solida con proteine del plasma umano per rimuovere gli anticorpi indesiderati. 2. L’anticorpo assorbito è stato ulteriormente purificato per cromatografia di affinità su una colonna con catene leggere lambda umane immobilizzate. 3. L’anticorpo isolato per affinità è stato poi degradato con pepsina e il frammento F(ab')2 è stato isolato tramite filtrazione su gel. 4. Infine, il frammento F(ab')2 è stato coniugato con isotiocianato di fluorescina isomero 1 o con Rficoeritrina. Immunogeno Catene leggere di immunoglobulina policlonale di tipo lambda isolate da un pool di sieri umani Specificità L’anti-catene leggere lambda reagisce con le catene libere lambda e con le catene lambda nelle molecole intatte di immunoglobulina.La specificità è stata accertata come descritto qui di seguito. Per ottenere la sensibilità massima, i test di specificità con immunoelettroforesi crociata e ELISA sono stati eseguiti prima della purificazione per affinità e della degradazione con pepsina. Immunoelettroforesi crociata. Quando l’anticorpo viene testato con il plasma umano appaiono soltanto precipitati relativi a lambda. Colorazione Coomassie Brilliant Blue. Citometria a flusso: Quando l’anti-catene leggere lambda viene applicato come descritto nella procedura di colorazione insieme a anti-CD19/RPE, HD37, o anti-CD19/FITC, HD37, su sangue intero umano lisato, si osserva una colorazione specifica di una parte dei linfociti B CD19-positivi che corrisponde alla gamma di espressione prevista della catena leggera lambda. L’analisi mediante citometria a flusso di sospensioni di cellule singole da campioni di tessuti fissati in formalina, inseriti in paraffina ha dimostrato che l’anti-catene leggere lambda marca i nodi linfatici iperplastici reattivi (10/10 casi). Nei linfomi non Hodgkin l’anticorpo marcava 5/10 casi (5). I casi rimanenti sono risultati positivi per le catene leggere kappa (4/10 casi) o non mostravano alcuna espressione di catene leggere (1/10 casi) (4). L’analisi flusso-citometrica dei linfociti del sangue periferico dimostra che l’anti-catene leggere lambda marca una proporzione di leucemie linfocitiche croniche delle cellule B. Pertanto in uno studio di 121 casi (2), 17 sono risultati positivi per lambda. In un altro studio di 165 casi (3), 68 sono risultati positivi per lambda. Precauzioni 1. Per operatori specializzati. 2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma la sodio azide potrebbe reagire con le tubature in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Per lo smaltimento del prodotto è consigliabile sciacquare abbondantemente per prevenire la formazione di azidi metalliche nelle tubature. 3. Come per ogni prodotto di derivazione biologica, utilizzare procedure di manipolazione adeguate. 4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle. (104073-003) F0435/R0437/IT/LHP/2013.01 p 1/2 Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR N. 33 21 13 17 5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia. Conservazione Conservare al buio ad una temperatura compresa tra 2-8 C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Qualora i reagenti venissero conservati in condizioni diverse da quelle specificate, le condizioni devono essere verificate dall’utente. Questo prodotto non mostra segni visibili evidenti di instabilità. Pertanto, vanno eseguiti controlli positivi e negativi contemporaneamente ai campioni del paziente. Durante il periodo di conservazione si potrà sviluppare una piccola quantità di precipitato che causa una colorazione non specifica sottile e granulare. Tramite un filtraggio semplice (filtro di acetato di cellulosa da 0,22 µm), verrà ripristinata la qualità elevata del coniugato. I coniugati non devono essere conservati in forma diluita. Qualora si osservasse una colorazione anormale che non può essere attribuita a variazioni di procedure di laboratorio e si sospettasse un problema relativo all’anticorpo, mettersi in contatto con il nostro Servizio Tecnico. Nota procedurale Prima di colorare i campioni di sangue periferico, le cellule mononucleari devono essere isolate mediante centrifugazione su un mezzo di separazione o il campione di sangue deve essere lavato per eliminare le proteine sieriche solubili. Siccome i monociti umani legano le immunoglobuline sieriche tramite i loro ricettori Fc di superficie, queste cellule devono essere rimosse mediante deplezione o devono essere identificate. Procedure di colorazione 1. 2. 3. 4. Raccogliere sangue venoso in una provetta contenente un anticoagulante Trasferire 100 µL del sangue anticoagulato nella provetta. Aggiungere 2 mL di 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. Miscelare delicatamente usando un agitatore vortex. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti, poi aspirare il surnatante, lasciando circa 50 µL di liquido. 5. 6. Ripetere le istruzioni riportate ai passi 3 e 4 ancora due volte. Aggiungere 10 µL di frazione immunoglobulinica di coniglio, codice n. X0903, per bloccare la reazione. Miscelare delicatamente utilizzando un agitatore vortex e incubare al buio a 37 °C per 30 minuti. 7. Aggiungere 10 µL di anti-catene leggere lambda coniugato con il fluorocromo. Miscelare delicatamente. 8. Usare un frammento F(ab’)2 non reattivo di immunoglobulina di coniglio, coniugato con lo stesso fluorocromo, come controllo negativo (vedere la tabella). 9. Incubare al buio a 4 °C per 30 minuti. 10. Aggiungere 1-2 mL di reagente lisante d’eritrociti ad ogni provetta e miscelare delicatamente. Seguire le raccomandazioni del produttore per il tempo e la temperatura d’incubazione. 11. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti. 12. Aspirare il surnatante, lasciando circa 50 µL di liquido. 13. Aggiungere 2 mL di 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. Miscelare delicatamente usando un agitatore vortex. 14. Ripetere le istruzioni riportate ai passi 11 e 12. 15. Risospendere il pellet in un liquido adatto per citometria a flusso e cioè 0,3 mL di paraformaldeide (fissativo) all’1% in 0,01 mol/L PBS, pH 7,4. 16. Analizzare su un citometro a flusso. Per il controllo del reagente e della preparazione, si raccomanda di includere un campione idoneo di controllo positivo e negativo adatto ad ogni test. Va notato che i coniugati di fluorocromo sono sensibili alla luce, pertanto i campioni vanno protetti dalla luce durante la procedura di colorazione e fino all’analisi. Riferimenti bibliografici 1. Johnson A, Olofsson T. Flow cytometric clonal excess analysis of peripheral blood, routine handling, and pitfalls in interpretation. Cytometry 1993;14:188-95. 2. Cartron G, Linassier C, Bremond JL, Desablens B, Georget MT, Fimbel B, et al. CD5 negative B-cell chronic lymphocytic leukemia: clinical and biological features of 42 cases. Leuk Lymphoma 1998;31:20916. 3. Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica 1993;78:18-24. 4. Leers MPG, Theunissen PHMH, Ramaekers FCS, Schutte B, Nap M. Clonality assessment of lymphoproliferative disorders by multiparameter flow cytometry of paraffin-embedded tissue: an additional diagnostic tool in surgical pathology. Hum Pathol 2000;31:422-7. 5. Deegan MJ. B lymphocytes and plasma cells: their development and identification. In: Keren DF, editor. Flow cytometry in clinical diagnosis. Chicago: ASCP Press; 1989. p. 139-63. 6. Kaleem Z, Zehnbauer BA, White G, Zutter MM. Lack of expression of surface immunoglobulin light chains in B-cell non-Hodgkin lymphomas. Am J Clin Pathol 2000;113:399-405 Le ge nda dei s im boli Nu mero di ca ta log o L imiti di tempe ratura Di sposi tivo medi co-di agn ostico in vitro Co nse rvare al riparo d alla luce so lare Co nsul ta re le istruzioni p er l’ uso Co di ce del l otto (104073-003) Util izzare e ntro Fab brica nte F0435/R0437/IT/LHP/2013.01 p 2/2 Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR N. 33 21 13 17