baini m., giannetti m., maltese s., caliani i., carletti

Biol. Mar. Mediterr. (2012), 19 (1): 245-248
M. Baini, M. Giannetti, S. Maltese, I. Caliani, L. Carletti, T. Campani,
D. Coppola, M.C. Fossi, T. Renieri1,2, L. Marsili
Dipartimento di Scienze Ambientali, Università di Siena, Via Mattioli, 4 - 53100 Siena, Italia.
[email protected]
1
Dipartimento di Scienze Biomediche, Sezione di Biologia Applicata, Università di Siena,
Policlinico Santa Maria alle Scotte, Viale Bracci - 53100 Siena, Italia.
2
Centro Interdipartimentale per la ricerca e la terapia dell’infertilità maschile, Università di Siena,
Policlinico Santa Maria alle Scotte, Viale Bracci - 53100 Siena, Italia.
NANOTOSSICOLOGIA: EFFETTI DI NANOPARTICELLE DI ORO
(AuNP) SU FIBROBLASTI DI CETACEI
NANOTOXICOLOGY: EFFECTS OF GOLD NANOPARTICLES
(AuNPS) IN CETACEAN FIBROBLASTS
Abstract - Nanoparticles (NPs) are produced intentionally with the aim of developing new materials
that exhibit certain specific properties. Their use has been proposed in many fields of science and
industry. Although the various toxicological aspects and the diversity of the NPs assessed are just
beginning, many deleterious effects have been documented, particularly in animals. No data are available
for marine top predators of conservational interest, such as toothed whales (Odontoceti). Gold (Au)
NPs are the most stable metal nanoparticles and they present fascinating aspects such as their assembly
of multiple types. The aim of this study was to evaluate the toxicological effects of the ingegnerized
AuNPs in fibroblast cell cultures of two free-ranging specimens of toothed cetaceans: striped dolphin
(Stenella coeruleoalba) and bottlenose dolphin (Tursiops truncatus), sampled in Mediterranean Sea by
non destructive method represented by subcutaneous biopsy. Immunofluorescence technique was used for
qualitative and quantitative evaluation of CYP450 1A1, CYP450 2B and MICA expression. Genotoxicity
of AuNPs in cetacean fibroblasts was detected by the alkaline Comet assay. This experiment confirms
the AuNPs capacity to pass through the cellular barrier and to accumulate in cetacean fibroblasts.
Moreover, their toxicity seems to be related especially to the genotoxic effects, while no induction of
metabolic (CYP1A1 and CYP2B) and immune system related proteins (MICA) has been detected.
Key-words: cetology, nondestructive testing, cell culture, pollution, biological stress.
Introduzione - Con il termine nanoparticelle (NP) si identificano normalmente
delle particelle formate da aggregati atomici o molecolari con un diametro inferiore
a 100 nanometri (nm). Le nanoparticelle possono essere costruite con materiali molto
diversi, ma particolarmente importanti per le applicazioni biologiche risultano essere
quelle composte da metalli inerti come il platino e l’oro. Le nanoparticelle sono di
grande interesse sia per il mondo industriale che per quello scientifico; i campi di
applicazione, in particolare delle nanoparticelle di oro (AuNP), chiamate anche oro
colloidale, sono sempre più numerosi: elettronica, nanotecnologia e sintesi di nuovi
materiali con proprietà uniche. Alcune tecniche di imaging usano le AuNP come
marcatori, grazie alla loro particolare interazione con la luce a diverse lunghezze
d’onda. Recentemente la proprietà di conversione fototermica delle AuNP ha destato
l’interesse dell’intero mondo scientifico; infatti, se vengono irradiate da un raggio
laser, possono convertire efficientemente l’energia luminosa in energia termica, e ciò
può portare alla distruzione delle cellule tumorali e dei batteri (West e Halas, 2003;
Zharov et al., 2006). Spesso sono utilizzate anche come mezzo di contrasto per la
visualizzazione di tessuti o organi in vivo, ma la loro applicazione più interessante
è legata al trasporto mirato di molecole all’interno delle cellule, ad esempio di
farmaci antitumorali. Tutto ciò ci presenta le AuNP e le nanoparticelle in generale
come sistemi dalle potenzialità infinite. In realtà le loro interazioni con i sistemi
biologici sono alquanto sconosciute e già sono stati documentati degli effetti negativi
negli animali (Nowack e Bucheli, 2007). Tuttavia non vi sono dati riguardanti i top
246
M. Baini
et al.
predators marini di interesse conservazionistico, come i cetacei odontoceti. Una delle
principali caratteristiche delle nanoparticelle è la loro capacità di passare attraverso le
varie barriere protettive degli organismi viventi, compresa la barriera dell’epidermide
(Oberdörster et al., 2005). Nei cetacei, la pelle è un importante tessuto non soltanto
come barriera fisica di protezione, ma anche come sede di componenti del sistema
immunitario che provvedono ad una difesa iniziale contro agenti patogeni, stimoli nocivi
e cellule neoplastiche residenti. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare
i potenziali effetti tossicologici delle nanoparticelle di oro ingegnerizzate in colture
cellulari di fibroblasti di due specie di cetacei odontoceti, la stenella striata (Stenella
coeruleoalba) ed il tursiope (Tursiops truncatus), campionati nel Mar Mediterraneo
tramite il metodo non distruttivo della biopsia cutanea (Fossi e Marsili, 2011).
Materiali e metodi - Per il campionamento non invasivo degli esemplari freeranging di cetacei è stata utilizzata la tecnica della biopsia cutanea, effettuata dalla
prua dell’imbarcazione quando gli esemplari facevano bow-riding, utilizzando un palo
lungo 2,5 m con punta modificata in modo da fungere da raccoglitore di tessuto.
Gli operatori erano autorizzati al campionamento con permesso CITES Cod. Ident.
Nazionale IT 025IS ed Internazionale IT 007. La metodica utilizzata per ottenere le
colture cellulari di fibroblasti è quella descritta da Marsili e collaboratori (Marsili
et al., 2000). I fibroblasti, raggiunta la confluenza in una fiasca T182 Celestar, sono
stati trattati con 2 ml di Tripsina EDTA 1X (Gibco) e sono stati fatti crescere per 24
ore su vetrini coprioggetto inseriti in piastre a pozzetti (PBI). Le cellule sono state in
seguito incubate a 37 °C per 4 e 24 ore con una concentrazione di AuNP pari a 250
µM. Le AuNP sono state prodotte, caratterizzate e fornite dalle Industrie Colorobbia,
Sovigliana (Vinci, Firenze, Italia). La tecnica dell’immunofluorescenza indiretta è
stata usata per un’analisi qualitativa e quantitativa del CYP450 1A1 e del CYP450
2B e dell’espressione del MICA. Le prime due proteine sono da sempre utilizzate
come biomarker di esposizione rispettivamente a composti planari (es. idrocarburi
policiclici aromatici, diossine, PCB e PBDE non-orto e i mono-orto sostituiti) e
globulari (es. DDT, PCB e PBDE orto-sostituiti), mentre il MICA è utilizzato come
biomarker di stress tossicologico del sistema immunitario. É stata inoltre verificata
la genotossicità delle AuNP nei fibroblasti di cetacei mediante la tecnica del comet
assay (Speit e Hartmann, 2006; Burlinson et al., 2007).
Risultati - I principali risultati ottenuti da questo studio preliminare sono: tutte
le proteine prese in esame: CYP450 1A1, CYP450 2B e MICA, rilevate con la tecnica
dell’immunofluorescenza indiretta nei fibroblasti dei cetacei indagati, non hanno
mostrato un’induzione in seguito al trattamento con le AuNP . Questo indicherebbe
un’inerzia tossicologica di tali nanoparticelle nei confronti di questi biomarker nei
fibroblasti di cetaceo (Fig. 1); invece il test di mutagenesi della cometa, ha mostrato
che le AuNP causano un incremento delle percentuali di code di DNA rispetto al
controllo ed in funzione del tempo di esposizione (4 e 24 ore), mettendo in allarme
sulle potenzialità genotossiche di questi composti (Fig. 2).
Conclusioni - Le conclusioni tratte da questo studio sui fibroblasti di cetacei
odontoceti sono le seguenti:
- abbiamo validato l’utilizzo di metodologie di campionamento non-distruttive sia
su esemplari di Stenella coeruleoalba che di Tursiops truncatus;
- le colture cellulari si confermano un materiale importantissimo in quanto
rappresentano quello che può essere chiamato il “cetaceo in provetta”, cioè un
sistema “in vitro” che può essere utilizzato per moltissime indagini ecotossicologiche;
- le AuNP mostrano effetti genotossici non trascurabili sui fibroblasti di cetaceo e
ciò deve far riflettere sul loro vasto utilizzo sull’uomo, in particolare nel campo medico.
mostrato un’induzione in seguito al trattamento con le AuNP . Questo indicherebbe
un’inerzia tossicologica di tali nanoparticelle nei confronti di questi biomarker nei
fibroblasti di cetaceo (Fig. 1); invece il test di mutagenesi della cometa, ha mostrato
che le AuNP causano un incremento delle percentuali di code di DNA rispetto al
Nanotossicologia: effetti di nanoparticelle di oro su fibroblasti di cetacei
controllo ed in funzione del tempo di esposizione (4 e 24 ore), mettendo in allarme
sulle potenzialità genotossiche di questi composti (Fig. 2).
Bianco
247
AuNP 250 µM
CYP1A1
AUF/nuclei = 32543
AUF/nuclei= 18531
AUF/nuclei = 36498
AUF/nuclei = 27458
AUF/nuclei = 31928
AUF/nuclei = 29000
CYP2B
MICA
Fig. 1 - Immunofluorescenza
(AUF/nuclei)
del del
CY1A1,
neifibroblasti
fibroblasti
di stenella
Fig. 1 - Immunofluorescenza
(AUF/nuclei)
CY1A1,CYP2B
CYP2B ee MICA
MICA nei
di stenella
trattati con
AuNP.
trattati
con AuNP.
Immunofluorescence
(AUF/nucleus)
of CY1A1,
CYP2B
and and
MICA
in cultured
fibroblasts
Immunofluorescence
(AUF/nucleus)
of CY1A1,
CYP2B
MICA
in cultured
fibroblastsofofstriped
dolphin treated
AuNPs.
stripedwith
dolphin
treated with Au NPs.
% di DNA nella coda
Trattamenti a 4h e 24h
35
30
25
20
15
10
5
0
8,3
%
Controllo
4
24
Fig. 2 (%)
- Percentuale
(%)
di DNA
nella coda
in fibroblasti
di tursiope
trattati con AuNP.
Fig. 2 - Percentuale
di DNA nella
coda
in fibroblasti
di tursiope
trattati con
AuNP.SIBM
46_Congr
form testi v. 11_feb_2010
DNA tail
(%)dolphin
in bottlenose
dolphin
fibroblasts
treated with AuNPs.
DNA tail percentage
(%) percentage
in bottlenose
fibroblasts
treated
with AuNPs.
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