Struttura genetica del gambero di fiume
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Struttura genetica del gambero di fiume
Dottorato di ricerca in Scienze Ambientali “Ambiente e uomo in Appennino” Università degli Studi de L’Aquila Tesi realizzata con il cofinanziamento della Comunità Europea Curriculum: Ecologico – Ecologia delle acque interne – Struttura genetica del gambero di fiume Austropotamobius italicus e strategie di conservazione della specie in Italia centrale con particolare riguardo all’Abruzzo. Tutor Prof. Bruno Cicolani Dottorando Marcello Iaconelli Coordinatore Prof. Valter Rossi XIV Ciclo: 1999 - 2001 Struttura genetica del gambero di fiume Austropotamobius italicus e strategie di conservazione della specie in Italia centrale con particolare riguardo all’Abruzzo. INDICE INTRODUZIONE i-iii CAPITOLO 1: SISTEMATICA ED ECOLOGIA 1.1 Sistematica 1 1.2 Distribuzione geografica 5 1.3 Ecologia 8 1.4 Patologie 11 CAPITOLO 2: MATERIALI E METODI 2.1 Materiali 14 2.2 Analisi elettroforetica di sistemi gene-enzima 19 2.3 Analisi del DNA Mitocondriale 24 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 Estrazione del DNA Amplificazione mediante PCR Sequenziamento Analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione 2.4 Analisi Statistiche 2.4.1 Dati allozimici 2.4.2 Analisi delle sequenze 24 25 25 26 27 27 29 CAPITOLO 3: RISULTATI 3.1 Status attuale delle popolazioni italiane 31 3.2 Analisi genetica a livello nucleare: loci enzimatici 36 3.3 Analisi genetica a livello mitocondriale 67 3.3.1 Citocromo-Ossidasi I 3.3.2 Subunità 16S del RNA ribosomiale 67 78 3.4 Allevamenti sperimentali e ripopolamenti 85 CAPITOLO 4: DISCUSSIONI E CONCLUSIONI 88 BIBLIOGRAFIA 97 i INTRODUZIONE Dalla fine dell’800 la distribuzione e l’abbondanza dei gamberi di fiume italiani (genere Austropotamobius) sono andate drasticamente riducendosi per cause molteplici: alterazione degli habitat favorevoli, per inquinamento chimico e organico delle acque, prelievi idrici, cementificazione degli argini fluviali; sovrasfruttamento delle popolazioni; esclusione competitiva da parte di specie alloctone, introdotte a scopo commerciale, quali il gambero turco (Astacus leptodactylus) e quelli americani (Procambarus clarkii, Pacifastacus leniusculus); epidemie da patogeni e parassiti, come la “peste del gambero”, micosi causata da Aphanomyces astaci, introdotto da gamberi alloctoni. Oggi i gamberi di fiume sono estinti in molte parti del loro areale e sono presenti in Europa con popolazioni medio-piccole, frammentate e isolate, generalmente in piccoli corsi d’acqua . Cio’ ha portato quasi tutti i paesi europei, compresa l’Italia, a istituire norme di protezione per i gamberi di fiume autoctoni, vietandone la pesca o limitandola a periodi molto brevi. Sono in considerazione programmi per la reintroduzione e il ripopolamento di aree naturali. Tali misure, se oculate, potrebbero favorire il reinstaurarsi di corridoi biotici che consentano flusso genico tra popolazioni e contrastino l’erosione genetica. E’ ormai ben dimostrato che un importante rischio di estinzione di popolazioni piccole e frammentate e’ determinato dalla perdita di variabilita’ genetica, causata da deriva genetica e inbreeding, che ne riduce le capacita’ di rispondere adattativamente a fluttuazioni ecologiche nel tempo e nello spazio. (Van Valen, 1973: Frankel & Soule’, 1981: Avise, 1994; Avise & Hamrick, 1995). Premessa fondamentale a qualsiasi programma di reintroduzione e di restocking e’ una conoscenza della struttura genetica delle popolazioni. Le popolazioni che si intende introdurre devono essere infatti sufficientemente differenziate da permettere un aumento della variabilita’ genetica delle popolazioni autoctone, ma non troppo da determinare una minore fitness ii degli ibridi (outbreeding depression) e/o fenomeni di esclusione competitiva, come puo’ avvenire nel caso di entita’ parzialmente o completamente isolate riproduttivamente. Andrebbero quindi preliminarmente identificate le ‘unita’ evolutivamente significative (ESU, Moritz, 1994: Avise & Hamrick, 1996) che si intendono salvaguardare e i livelli di variabilita’ genetica intra- e interpopolazionale. Ove possibile, andrebbe inoltre verificato in condizioni di laboratorio o seminaturali controllate il successo degli incroci tra le popolazioni che si intende rimescolare. Nel caso dei gamberi di fiume italiani i dati sono ancora preliminari e spesso controversi. Ricerche genetiche basate su allozimi hanno mostrato il differenziamento genetico e il sostanziale isolamento riproduttivo tra A. pallipes (Gran Bretagna, Francia, Italia nord-occidentale) e A. italicus (Italia, Penisola Iberica), precedentemente considerate come conspecifiche, cf Bott, 1950); in una zona di parapatria tra le due entita’ in Liguria e Piemonte occidentale e’ stata dimostrata assenza di sintopia e di ibridi di F1 (Santucci et al., 1997; Iaconelli, 1997; Bondanelli et al., in prep.); e’ stata inoltre evidenziata una eterogeneita’ genetica nell’ambito di A.italicus (Santucci et al., 1997). Tale eterogeneita’ e stata confermata da altri autori (Grandjean et al., 1997, Lörtscher et al., 1997, 1998) e ha portato al riconoscimento di una terza specie, A. berndhauseri, in Svizzera e in Italia settentrionale, pur in assenza di un chiaro differenziamento genetico da A. italicus (Largiader et al., 2000). I vari studi generalmente concordano nell’indicare valori generalmente molto bassi di variabilita’ genetica dei gamberi di fiume europei sia a livello nucleare che mitocondriale (Santucci et al., 1997; Grandjean et al., 1997, Lörtscher et al., 1997, 1998; Souty Grosset et al., 1997; Largiader et al., 2000). E’ da notare che nonostante i gamberi del genere Austropotamobius siano considerati “rari e vulnerabili” dall’Unione Internazionale per la Conservazione della Natura (IUCN: Baillie & Groombridge, 1996) e inseriti nell’Invertebrate Red Data Book, in queste liste vengono tuttora riconosciute solo A. pallipes (che include A. italicus) e A. torrentium. iii La presente tesi si inserisce in questa problematica con i seguenti obiettivi: • verificare la presenza e l’abbondanza in Italia dei gamberi di fiume, con particolare riguardo alle aree appenniniche, confrontando la situazione attuale con quella osservata all’inizio del novecento (Vinciguerra, 1899); • analizzare la struttura genetica di Austropotamobius italicus, allo scopo di definire le Unita’ Evolutivamente Significative (ESU) in questa specie. A questo scopo verra’ confrontata la diversita’ genetica a livello intra- e interpopolazionale sia nucleare (29 loci enzimatici) che mitocondriale (sequenziamento di regioni codificanti per la citocromo I ossidasi e l’RNA 16S) tra popolazioni dell’Italia, Spagna, Slovenia, e Svizzera; • verificare la presunta presenza di una specie distinta, A. berndhauseri, in Italia settentrionale; • caratterizzare i livelli di variabilita’ genetica delle popolazioni di A. italicus e identificare i possibili ‘reservoirs’ di variabilita’; • fornire linee guida per la conservazione della specie, con particolare riguardo alla scelta dei riproduttori, alle metodiche di allevamento e all'individuazione delle aree idonee per le introduzioni e/o i ripopolamenti. 1 CAPITOLO 1 SISTEMATICA ED ECOLOGIA 1.1 Sistematica Fino a pochi anni fa la sistematica dei gamberi d'acqua dolce europei era basata quasi esclusivamente su sottili criteri morfometrici quali la forma della punta del rostro, la forma dei gonopodi del maschio o il numero delle spine postorbitali, poco decisivi per la definizione tassonomica, tanto che numerose variazioni di nomenclatura si sono succedute nel tempo (Tab.1). Bott (1972) riconosceva due generi distinti, Astacus e Austropotamobius, con quattro specie: As. astacus, As. leptodactylus, A. pallipes (comprendente anche le popolazioni italiane, con la sottospecie A. p. italicus) ed A. torrentium. Karaman (1962, 1963) e Brodsky (1981) considerano invece le popolazioni iberiche, italiane e dalmate come appartenenti alla stessa specie, A. italicus, suddivisa a sua volta in tre sottospecie (carsicus, italicus e lusitanicus) di cui la nominale, ssp. italicus, presente in Italia. A. italicus veniva considerata ancestrale rispetto a A. pallipes e le due forme si sarebbero diffuse in Europa occidentale in epoche differenti. Albrecht (1981, 1982) ha riunito i gamberi europei riunendoli nell'unico genere Astacus. Astacus pallipes veniva suddivisa in varieta’: pallipes (Francia, Gran Bretagna), rhodanicus, della Francia meridionale, italicus dell’Italia centro-meridionale, lombardicus, del Ticino e Lombardia, trentinicus del Trentino Alto Adige, dalmatinicus della Dalmazia, carinthiacus della Carinzia (Austria). Tab. 1: Classificazione degli astacidi europei secondo Bott, Karaman, Albrecht e Brodsky. Bott (1950, 1972) Karaman (1962, 1963) Genere Sottogenere Specie Sottospecie Genere Astacus Astacus astacus - Astacus colchius - Sottogenere - Specie Sottospecie astacus astacus balcanicus colchius Pontastacus pachypus - pylzowi - kessleri - leptodactylus Pontastacus - leptodactylus - leptodactylus salinus leptodactylus boreorientalis cubanicus intermedius eichwaldi salinus eichwaldi danubialis bessarabicus Austropotamobius Austropotamobius Atlantoastacus torrentium pallipes torrentium macedonicus kessleri pallipes pylzowi italicus pachypus lusitanicus berndhauseri pachypus notabilis Austropotamobius Austropotamobius torrentium Atlantastacus pallipes pallipes bispinosus italicus italicus carsicus lusitanicus Tab. 1 (continua) Albrecht (1982) Brodsky (1983) Genere Sottogenere Specie Sottospecie Varietà Genere Astacus - astacus astacus Astacus Sottogenere - Specie Sottospecie astacus astacus balcanicus pachypus - leptodactylus - torrentium - pallipes - balcanicus Pontastacus - leptodactylus leptodactylus salinus pallipes boreorientalis italicus intermedius lombardicus trentinicus eichwaldi eichwaldi rhodanicus danubialis dalmatinicus bessarabicus carinthiacus kessleri pylzowi pachypus pachypus notabilis Austropotamobius Austropotamobius torrentium Atlantastacus pallipes pallipes bispinosus italicus italicus carsicus lusitanicus 4 A differenza di Karaman egli considerava A. pallipes come specie filogeneticamente più antica; essa si sarebbe evoluta dando origine alle forme attuali nella Tedide occidentale (odierna regione del basso Rodano) durante il medio Miocene. Cio’ sarebbe testimoniato dalla presenza nella regione (Vaucluse) di popolazioni morfologicamente molto simili alla forma italicus (Laurent & Suscillon, 1962). Piu’ recentemente sono stati condotti studi genetici, sulla base di marcatori sia nucleari che mitocondriali, con risultati in parte controversi. Tre gruppi distinti, corrispondenti alle sottospecie di Bott (1950) A. p. pallipes (con campioni della Francia, dell’Inghilterra e del Galles, risultati geneticamente geneticamente omogenei), A. p. italicus (un campione della Slovenia) e A. p. lusitanicus (un campione della Spagna), sono stati identificati sulla base di enzimi di restrizione del DNA mitocondriale totale (Souty-Grosset et al., 1997; Grandjean et al., 1998). D’altra parte Santucci et al. (1997), sulla base di sistemi gene-enzima hanno dimostrato il differenziamento genetico e l’isolamento riproduttivo in natura delle entita’ A. pallipes, A. italicus e A. torrentium , che vanno quindi considerate come specie distinte, confermando l’ipotesi di Karaman (1962, 1963); tali studi hanno inoltre confermato la sostanziale identita’ genetica in A. pallipes della Francia meridionale, Inghilterra e Italia nord-occidentale, mentre nell’ambito di A. italicus, geneticamente più eterogeneo, sono stati evidenziati quattro gruppi, distribuiti rispettivamente in: i) Appennini centro-settentrionali e penisola Iberica; ii) Lazio, Abruzzi, Italia meridionale: iii) Lombardia, Friuli, Croazia nord-occidentale e Slovenia; iv) confine italo-sloveno (un campione del bacino dell’Isonzo). Non viene quindi confermata la sottospecie iberica (“lusitanicus”). L’affinita’ genetica delle popolazioni spagnole con A. italicus e’ stata successivamente confermata a livello di DNA mitocondriale (Grandjean et al., 2001). Anche la distinzione a livello specifico tra A. pallipes e A. italicus e’ stata successivamente confermata da Grandjean et al. (2000) sulla base del sequenziamento di una regione mitocondriale codificante per l’RNA 16S. 5 Questi autori hanno inoltre suddiviso A. italicus nelle sottospecie A. i. italicus (aplotipi dell’Italia centrosettentrionale, Francia meridionale e Spagna), A. i. carinthiacus (Plansee, Austria), e A. i. carsicus (aplotipi della Slovenia e della Francia meridionale), evidenziando inoltre recenti trasporti passivi in Francia. Tali risultati, tuttavia, sono basati su un numero limitatissimo di campioni e di esemplari. Anche nell’arco alpino e’ stata evidenziata una notevole eterogeneita’ genetica (Lörtscher et al., 1997, 1998). Largiader et al. (2000) sulla base di allozimi e DNA mitocondriale (una regione di circa 1500bp compresa tra i geni per l’RNA 12S e 16S), distingue un gruppo settentrionale, corrispondente a A. pallipes, e uno meridionale, attribuito alla specie A. berndhauseri, presente in Svizzera e Italia settentrionale. Non emerge, tuttavia, un chiaro differenziamento genetico tra quest’ultimo taxon e A. italicus. 1.2 Distribuzione geografica Il genere Austropotamobius e’ distribuito in tutta l’Europa occidentale e centro-meridionale. A. pallipes e’ la specie presente nelle Isole Britanniche (a sud della Scozia), Francia, Italia nord-occientale, Svizzera settentrionale, di recente sono state osservate alcune popolazioni in alcuni tributari in Germania sud-occidentale (Trochel e Dehus, 1993). A. italicus (in cui provvisoriamente includiamo A.berndhauseri, non ancora chiaramente distinto a livello genetico) e’ distribuito nella Penisola Iberica, in Italia peninsulare, dalle Prealpi alla Calabria settentrionale, Svizzera, Austria (Carinzia), Slovenia occidentale, Istria e Dalmazia. A. torrentium si trova in Austria, Germania centromeridionale e paesi Danubiani fino all’Albania, Macedonia e Grecia settentrionale (Fig. 1). Fig. 1. Distribuzione geografica del genere Austropotamobius. 7 La distribuzione naturale di queste specie e’ stata notevolmente modificata, soprattutto ad opera delle attivita’ antropiche, che hanno da una parte alterato e distrutto gli habitat favorevoli, portando all’estinzione da parti piu’ o meno estese dell’areale; dall’altra ad introdurle in nuove aree, spesso per scopi commerciali. Il trasporto passivo ad opera dell’uomo e’ considerato un fenomeno molto diffuso (Albrecht, 1983; Holdich, 1988; Grandjean et al., 1997, 2000; Largiadièr et al., 2000). Per varie aree e’ stata ipotizzata una introduzione recente, come per esempio l’Austria, dove sono note solo poche popolazioni in Carinzia (Albrecht, 1981; Machino, 1997), o la Corsica, dove si trova un’unica popolazione introdotta dalla Francia meridionale (Laurent, 1988). Le popolazioni irlandesi sono apparentemente il risultato di introduzioni effettuate nel corso del XIX secolo (Gerdstfeldt, 1859). La dimostrazione di introduzioni da parte dell’uomo in un’area non permette tuttavia di escludere che la specie vi fosse originariamente presente. Ad esempio per la penisola iberica una colonizzazione recente ad opera dell’uomo e’ stata ipotizzata da Albrecht (1983) e Laurent (1988) sulla base dell’assenza di segnalazioni antiche della specie (cf per es. Aldrovandi 1642; Huxley, 1879). Secondo altri autori, tuttavia, popolazioni autoctone e introdotte coesisterebbero in quest’area (Balss, 1925; Matheus, 1937). In Portogallo, la presenza del gambero in pochi affluenti del Duero nella parte nordorientale del Portogallo sarebbe una conseguenza dell'introduzione negli anni ‘30 (Matheus, 1937). Una di tali popolazioni, relativamente abbondante nel 1996 (Machino, comunicazione personale), e’ risultata estinta nel 1999 (un solo esemplare morto rinvenuto, osservazione personale). La presenza attuale di A. italicus in Portogallo resta pertanto molto incerta. 8 1.3 Ecologia Il gambero di fiume puo’ essere definito un animale relativamente solitario, a volte caratterizzato da un certo territorialismo. Manifesta un’attivita’ prevalentemente crepuscolare e notturna, tuttavia esistono notevoli differenze per quanto riguarda le singole specie. A. pallipes, A. torrentium e As. astacus risultano essere esclusivamente crepuscolari mentre altre specie come ad esempio As. astacus leptodactylus e Procambarus clarkii (introdotto in Europa) sono attive anche di giorno. I gamberi mostrano la tendenza a concentrarsi in gran numero in siti favorevoli; anche laddove sono abbondanti, si possono osservare zone a forte popolamento alternate a zone a popolamento scarso o nullo (Arrignon, 1991). La preferenza per un particolare sito rispetto ad un altro avviene in funzione di fattori fisici quali la temperatura, l’illuminazione e la velocita’ della corrente, ma dipende anche dalla disponibilita’ di cibo e di rifugi. Durante il periodo dell’accoppiamento questa tendenza si modifica sensibilmente a causa dell'aumentare dell'aggressivita’ dei maschi. Durante questo periodo gli individui (soprattutto i maschi) si disperdono in misura notevole dai normali siti di stazionamento. A. pallipes preferisce acque limpide e fresche, a corrente moderata, con fondali rocciosi, ciottolosi o sabbiosi, ricoperti da lettiere di foglie morte e rami e con sponde ricche di anfratti formati da rocce e grovigli di radici, che possono offrire un’ottima rete di ripari. Si puo’ trovare da 0 ai 1200 metri sul livello del mare. La’ dove i rispettivi areali si sovrappongono, e’ possibile che gamberi appartenenti a specie diverse si incontrino. In particolare Laurent (1988) fornisce una descrizione sulle relazioni interspecifiche tra A. pallipes e altre specie. A. pallipes e A. torrentium sono sempre stati osservati in parapatria. In Dalmazia essi coesistono nello stesso fiume, ma occupano biotopi differenti: A. pallipes si trova nei fondali ciottoloso-sabbiosi e sugli 9 argini argillosi, mentre A. torrentium occupa i fondali rocciosi. A. pallipes e As. astacus sono stati osservati nello stesso corso d'acqua in Francia; anche in questo caso le due specie occupavano settori differenti. A. pallipes si trovava nel tratto a monte, dove la pendenza era maggiore, mentre As. astacus si trovava più a valle. Un tratto di 10 metri separava le due popolazioni che sembravano evitarsi. Non sono mai stati osservati fenomeni di ibridazione fra le due specie. La superiorita’ competitiva dei gamberi esotici (Orconectes limosus, Procambarus clarkii e Pacifastacus leniusculus) ha quasi sempre provocato, dove sono stati introdotti, la scomparsa delle specie autoctone (Mancini, 1986; Carral et al, 1993). Sono stati comunque osservati fenomeni di ibridazione a livello sperimentale tra maschio di P. leniusculus e femmina di A. pallipes; tuttavia non sono mai state ottenute progenie vitali (Hogger, 1988). Ibridazione interspecifica e’ stata anche osservata fra P. leniusculus e As. astacus. Anche in questo caso non si e’ mai osservata progenie vitale (Hogger, 1988). Cukerzis (1968), in un lavoro di ecologia comparativa fra As. astacus e As. leptodactylus, ha descritto su base morfologica l’esistenza di forme intermedie tra le due specie, ipotizzando che in natura avvengano incroci interspecifici. Tentativi di incrocio sono stati effettuati a livello sperimentale senza tuttavia ottenere progenie vitale (Guet & Roqueplo, 1995). I gamberi di fiume sono onnivori. Il loro modo di nutrirsi, sebbene opportunistico, evidenzia delle preferenze per alcuni tipi di cibo. Esse possono variare con l’eta’, la stagione e lo stato fisiologico dell’animale. Una certa differenza nelle preferenze alimentari esiste a livello interspecifico, sebbene siano stati condotti a proposito pochi studi comparativi. Essi si nutrono principalmente di molluschi ma anche di piccoli roditori, tricotteri, larve, vermi, girini e piccoli pesci. Le alghe come Chara ed Elodea costituiscono una parte importante della loro dieta, ma anche la vegetazione terrestre e’ ben apprezzata; A. pallipes mostra di preferire foglie cadute della vegetazione arborea. 10 Contrariamente all'opinione comune, i gamberi non mostrano una particolare predilezione per la materia animale in decomposizione. Si possono inoltre verificare fenomeni di cannibalismo in caso di scarsita’ di risorse alimentari o di densita’ eccessiva di una popolazione (Arrignon, 1991; Laurent, 1988). Una serie di prove effettuate sia sul campo che in laboratorio hanno rivelato che mentre i giovani si nutrono principalmente di invertebrati acquatici, gli adulti si cibano prevalentemente di alghe e di detriti vegetali. Si pensa che questo cambiamento nel regime alimentare sia legato alla crescita: le aumentate dimensioni rendono gli adulti meno agili con conseguente aumento delle difficolta’ nella cattura delle prede (Mason, 1974). Come precedentemente accennato, la temperatura ed il pH costituiscono due importanti fattori limitanti che condizionano notevolmente il ciclo vitale dei gamberi. I limiti massimo e minimo dei suddetti parametri variano sensibilmente secondo le specie. A. pallipes sopravvive entro un range di temperatura dell’acqua compreso tra 4°C e 23°C con un optimum compreso tra 15°C e 18°C; necessita in ogni caso di temperature estive dell’acqua superiori a 10°C in quanto sotto questa soglia diventa inattivo. A. torrentium sopporta un range di temperatura più ristretto; tuttavia non si conoscono i limiti esatti. As. astacus sopravvive a temperature comprese tra 4°C e 24°C mentre As. leptodactylus presenta un range compreso tra 4°C e 26°C (Cukerzis, 1968). Le crescenti emissioni di solfati e di ossidi di azoto derivati dalla combustione di combustibili fossili sono responsabili dell’incremento delle precipitazioni acide (pH 3-4) sull’Europa negli ultimi anni. Cio’ ha avuto un considerevole effetto sull’acidita’ dei corsi d’acqua e dei bacini lacustri (soprattutto scandinavi) con la conseguente progressiva scomparsa della fauna acquatica. Tali effetti sono stati meno evidenti in quelle regioni dove il potere tamponante delle rocce calcaree e’ riuscito a mantenere il pH dei corsi d’acqua entro limiti accettabili (Arrignon, 1991). In funzione di questa 11 problematica, sono stati condotti esperimenti di tolleranza a condizioni estreme di pH. La tollerabilita’ di A. pallipes si colloca entro limiti relativamente ristretti di acidita’ (6,5-8,5), sebbene riesca a sopportare condizioni estreme per brevi periodi. Le altre specie europee, As. astacus e As. leptodactylus, manifestano una tolleranza maggiore rispetto a A. pallipes: 4<pH<11 per As. astacus e 3<pH<12 per As. leptodactylus (Cukerzis, 1968). Il valore ottimale per entrambe le specie e’ pH = 7. Gli agenti inquinanti costituiscono un importante fattore di disequilibrio per le popolazioni astacicole. L’impatto di questi inquinanti sui gamberi si manifesta in diversi modi: morte improvvisa di un consistente numero di individui, diminuzione della resistenza alle malattie, basso tasso di riproduzione, bassa velocita’ di crescita. L’inquinamento meccanico, rappresentato dal deposito di sedimenti che occludono le tane e rimodellano il fondo, risulta tanto più importante quanto maggiore e’ il suo impatto. In casi estremi tale impatto puo’ essere tanto violento da eliminare completamente una intera popolazione, come ad esempio in seguito allo sbarramento di un corso d’acqua o alla cementificazione degli argini. I gamberi sono generalmente più resistenti all’inquinamento organico rispetto ai pesci; spesso la presenza di sostanze organiche in decomposizione risulta addirittura compatibile con la vita normale dell’animale. Tuttavia quando i valori superano una determinata soglia, i gamberi rispondono spostandosi a monte della fonte inquinante. L’inquinamento chimico risulta molto più dannoso. Sostanze come nitrati, fosfati, insetticidi, erbicidi e pesticidi risultano tossici per il gambero a concentrazioni appena superiori a quelle naturali (Arrignon, 1991). 1.4 Patologie Gli studi sulla patologia dei gamberi si sono notevolmente intensificati 12 in parallelo ai tentativi di allevamento a scopo commerciale (Smith & Söderhäll, 1986; Cerenius et al., 1987; Rantamäki et al., 1992). La concentrazione in spazi ristretti favorisce generalmente l’insorgenza di malattie. Gli agenti eziologici responsabili sono i più svariati; funghi, batteri, protozoi e parassiti metazoi. L’afanomicosi o “peste del gambero” rappresenta la più pericolosa malattia per i gamberi europei. La mortalita’ in caso di infezione, e’ elevatissima. Come gia’ accennato, essa comparve in Europa nel 1860 e precisamente in Italia probabilmente con l’introduzione di specie esotiche dagli Stati Uniti. In pochissimi anni essa si diffuse nel resto del continente. Essa colpì indiscriminatamente tutte le specie autoctone europee causandone la scomparsa in estese aree in poco tempo (Ninni, 1866; Mancini, 1986; Carral et al., 1993). L’agente patogeno (Aphanomyces astaci) é un micete della famiglia Saprolegniacee. L’infezione si propaga in acqua con le zoospore prodotte in gran numero in un intervallo di temperatura abbastanza ampio (da 2 a 25 °C) e ad un pH compreso tra 6 e 7,5. Cio’ significa che l’infestazione puo’ durare tutto l’anno (Arrignon, 1991; Cerenius et al., 1987). A. astaci e’ un parassita obbligatorio e le spore non resistono per più di due mesi nell’ambiente privo di gamberi (Arrignon, 1993). Attualmente non esiste alcun metodo efficace per combattere la malattia se non metodi di prevenzione, in quanto gli antimicotici risultano generalmente tossici anche per i gamberi .In caso di infezione l'unico rimedio resta l'isolamento e la distruzione degli individui malati. Altre micosi degne di nota sono quelle delle uova e la fusariosi causata da Fusarium solani, che colpisce i muscoli del gambero. La ruggine o “burn spot” si manifesta con delle delle ulcerazioni rosso-brune sulla parte superiore dell’esoscheletro; questa forma di micosi e’ causata da diversi miceti quali Ramularia astaci, Cephalosporium leptodactyli e Oidium astaci (Arrignon, 1991). 13 La Theolaniosi, comunemente nota come “malattia della porcellana” a causa della colorazione lattiginosa della muscolatura addominale, e’ causata dal microsporidio Thelohania contejeani. L’evoluzione della malattia puo’ perdurare per diversi mesi e i soggetti affetti mostrano riflessi rallentati a causa della rigidita’ della muscolatura infiltrata dai microsporidi. Le batteriosi setticemiche sono generalmente conseguenti alle micosi o a condizioni di stress ambientali. Gli agenti eziologici sono microorganismi del genere Proteus (P. vulgaris, P. morganii e P. aeruginosa); sono stati isolati anche Pseudomonas fluorescens e P. putrida. In gran parte delle infezioni i batteri sono stati trovati solo nell’emolinfa. Spesso si possono osservarere sulla superficie dei gamberi piccoli vermi simili a sanguisughe; si tratta di piccoli oligocheti appartenenti al genere Branchiobdella. Essi presentano un apparato boccale a ventosa col quale si attaccano all’ospite. Non si sa ancora bene se si tratta di parassiti o di commensali. Tuttavia, quando l’infestazione delle branchie diventa pesante, sembrano essere responsabili della morte dell’ospite (Arrignon, 1991; Gelder et al, 1994). 14 CAPITOLO 2. MATERIALI E METODI 2.1 MATERIALI Il campionamento di A. italicus ha interessato 80 località italiane più o meno uniformemente distribuite dal massiccio del Pollino all’arco alpino, cinque località iberiche, sei località elvetiche, una località austriaca, cinque slovene e sei croate Sono state inoltre campionate numerose popolazioni di A. pallipes dell’Italia nord-occidentale, due popolazioni francesi e una britannica. Al fine di stabilire le relazioni filogenetiche tra le varie specie appartenenti al genere Austropotamobius sono state incluse nella ricerca sei popolazioni di A. torrentium provenienti da località italiane, austriache, slovene e croate (Tab. 2 e Fig. 2). I campionamenti sono stati eseguiti in gran parte con la tecnica della pesca a mano di giorno oppure nelle ore notturne e con l'ausilio di luce artificiale; in alcune occasioni mediante l’uso di nasse. Ciascun esemplare prelevato subisce di norma l'asportazione sul posto dell'ultimo paio di pereiopodi, viene identificato per il sesso, misurato in lunghezza con l'ausilio di un calibro e quindi viene rilasciato. Le appendici sono immediatamente inserite in provette con tappo a vite di tipo Falcon, numerate e poi immerse in azoto liquido; con questa metodologia si è potuto evitare il sacrificio degli individui, appartenenti ad una specie minacciata. Il materiale raccolto viene infine trasferito in congelatori regolati a -80°C. 15 Tabella 2. Elenco delle popolazioni studiate Cod. Località di campionamento Corpo Idrico Lat Long msl N° A. italicus 1 Redipollos, Castilla y Leon (E) affuente del fiume Duero 43° 0’ N 5° 1’ W 1500 16 2 Orozco, Pais Vasco (E) Rio Altube 43° 2’ N 2° 5’ W 800 20 3 Roncesvalles, Navarra (E) Rio Tres Regatas 43° 1’ N 1° 2’ E 850 16 4 Santa Pau, Catalunya (E) Riera del Can Font 42° 8’ N 2° 38’ E 400 12 5 Beceite, Aragón (E) Rio Matarrana 40,5 N 0° 11’ E 800 52 6 Arroyo, Andalucia (E) Rio Genil 37° 12’ N 3° 58’ W 1000 23 7 Las Illas, Pyrénées Orientales (F) Las Illas 42° 31’ N 2° 47’ E 700 50 8 Claro, Canton Ticino (CH) affluente del Ticino 46°16' N 9°10' E 270 35 9 Cugnasco, Canton Ticino (CH) affluente del Ticino 46°10' N 8°53' E 350 11 10 Contone, Canton Ticino (CH) Canale Magadino 46°9' N 8°57' E 200 60 11 Meride, Canton Ticino (CH) Torrente Gaggiolo 45°54' N 8°57' E 500 40 12 Montecrestese,Alta Val d’Ossola affluente del Toce 46°10' N 8°20' E 300 38 46°5' N 8°18' E 300 31 13 Siberia,Alta Val d’Ossola affluente del Toce 14 Bracchio,Bassa Val d’Ossola affluente Lago di Mergozzo 45°58' N 8°28' E 250 32 15 Bieno, Fondo Toce Torrente Valle di Bieno 45°58' N 8°30' E 350 21 16 Casalzuigno,Prealpi Lombarde Torrente Le Marianne 45°54' N 8°43' 300 38 17 Borgo Ticino, Pianura Padana Rio affluente del Ticino 45°43' N 8°38' E 140 20 18 Trecate, Pianura Padana Rio affluente del Ticino 45°26' N 8°44' E 140 9 19 Valle Imagna, Prealpi Orobie Rio Santuario 45°50' N 9°31' E 450 70 20 S. Gregorio, Prealpi Bellunesi affluente del Piave 46°7' N 12°3' E 500 10 21 Avasinis, Carnia Torrente Leale 46°18' N 13°1' E 250 29 22 Vedronza, Prealpi Giulie Torrente Vedronsazza 46°15' N 13°12' E 500 45 23 Clodig, Prealpi Giulie Torrente Cosizza 46°10' N 13°35' E 200 16 24 Sterpo, Piana del Tagliamento affluente dello Stella 45°54' N 13°4' E 17 20 25 Bottazzo, Carso Triestino Torrente Rosandra 45°37' N 13°53' E 26 Rocchetta Tanaro, Monferrato Rio Ronsinaggio 44°54' N 8°27' E 190 14 27 Sagliano, Oltrepo’ Pavese affluente torrente Staffora 44°51' N 9°10' E 550 20 28 Casali, App. Ligure-Emiliano affluente del Torrente Arda 44°42' N 9°44' E 550 34 29 Iggio, Appennino Emiliano Torrente Rivarolo 44°46' N 9°51' E 450 27 30 Grognardo, Appennino Ligure Torrente Visone 44°37’ N 8°31’ N 460 15 31 Ottone, Appennino ligure Affluente Trebbia 44°38' N 9°20' E 510 20 32 Nirano, Appennino Emiliano Torrente Fossa 44°30' N 10°44' E 200 17 33 Palazzolo S., App. Romagnolo Torrente Senio 44°7’ N 11°33’ E 440 10 34 Badia di M., App. Romagnolo Affluente Santerno 44°5’ N 11°26’ E 569 30 300 45 (continua) 16 Tabella 2 (continua) Cod.Località di campionamento Corpo Idrico Lat 35 Ronta, Mugello Fosso Farfereta 36 Ferrano, Valdarno Long msl N° 44°0' N 11°35' E 350 30 Torrente Vicano 43°47' N 11°32' E 500 34 37 Papiano di Stia, Casentino Torrente Staggia 43°39' N 11°43' E 460 40 38 Gubbio, Appennino Umbro Torrente Chiascio 43°22' N 12°38' E 600 10 39 Bisignano, App. Marchigiano Torrente Fluvione 42°51' N 13°21' E 800 11 40 Acquapendente, Alta Tuscia Torrente Subbissone 42°44' N 11°52' E 425 12 41 Farnese, Alta Tuscia Fosso Faggeta 42°35' N 11°42' E 300 30 42 V. Castellana, Monti della Laga Torrente Castellano 42°45' N 13°30' E 630 30 43 Borbona, Monti Reatini affluente del Velino 42°31' N 13°9' E 950 11 44 Borgo Velino, Monti Reatini affluente del Velino 42°24' N 13°2' E 450 32 45 Campotosto, Monti della Laga Rio Fucino 42°34' N 13°21' E 1200 40 46 Torricella in S., Monti Sabini Fosso dei Molini 42°15' N 12°53' E 400 20 47 Oriolo Romano, Monti Sabatini Fosso Mignone 42°10' N 12°6' E 300 22 48 Val di Varri, Monti Carseolani Rio Val di Varri 42°11' N 13°8' E 750 3 49 Licenza, Monti Sabini Rio Corto 42°4' N 12°54' E 400 20 50 Tagliacozzo, Monti Carseolani Fosso Pratolungo 42°4' N 13°17' E 730 32 51 Rocca di Mezzo, Sirente-Velino Rio Gamberale 42°13' N 13°30' E 1100 14 52 Caramanico Terme, Majella affluente dell’Orfento 42°9' N 53 Roccaraso, App. Marsicano affluente del Sangro 41°50' N 14°0' E 650 30 14°5' E 1200 6 54 S. Antonio di Polla, Valli di Diano affluente del Tanagro 40°31' N 15°29' E 450 13 55 Paterno, Monti della Maddalena Torrente Cavolo 40°23' N 15°44' E 650 8 56 Pantano, Massiccio del Pollino Torrente Battintiero 39°58' N 16°0' E 800 8 57 Foce, Massiccio del Pollino Torrente Coscile 39°52' N 16°9' E 650 20 58 Gitchtal, Alpi della Gail (A) affluenti della Gail 46°4' N 13°16' E 750 30 59 Breginj, Prealpi Giulie (SLO) affluente del Natisone 46°16' N 13°25' E 500 40 60 Idrija, Carso (SLO) Torrente Idrija 46°8' N 13°38' E 150 110 61 Cehovini, Carso (SLO) affluente del Vipava 45°45' N 13°56' E 350 30 62 Odolina, Carso (SLO) Torrente Obrov 45°41' N 13°56' E 700 10 63 Buzet, Istria (HR) Torrente Rusnjak 45°25' N 13°55' E 250 47 64 Rijeka, Monti Fiumani (HR) Torrente Recina 45°23' N 14°27' E 480 20 65 Donje Postinje, Dalmazia (HR) Torrente Vrba 43°44' N 16°28' E 410 16 (continua) 17 Tabella 2 (continua) Cod. Località di campionamento Corpo Idrico Lat Long msl N° 52°50’ N 1°8’ E 20 10 44°5' N 3°40' E 600 21 45°37' N 8°3' E 550 8 44°7' N 8°2' E 343 24 A. pallipes 66 Norfolk, East Anglia (UK) Wenson River 67 M.gne de l’Esperou, (F) affluente del Coudoulous 68 Miagliano, Prealpi Biellesi affluente del Cervo 69 Castelbianco, Appennino Ligure Rio Pennavaira A. torrentium 70 Tarvisio, Alpi Carniche Rio dei Gamberi 46°32' N 13°36' E 900 10 71 Arnoldstein, Alpi Carniche (A) Steinbach 46°33' N 13°43' E 850 30 72 Smarse-Sap, Alpi Giulie (SLO) Torrente Zacurek 46°2' N 14°24' E 320 20 73 Lokve, Gorski Kotar (HR) Torrente Mrzlica 45°24' N 14°38' E 600 34 74 Cabar, Alpi Giulie (HR) Torrente Cabarna 45°36' N 14°38' E 500 4 75 Zagreb, Medvenica (HR) Torrente Mrzlak 45°51' N 15°51' E 250 29 $$ #& % & ' ! % " ' # $ % & $ % ! $% $& $' ! % " ! # %! #' %" $ $ $ %$ $! & ' ! ! !" !% % " " $" !! !# !$ !& " %# %% $# !' "" "! "# "$ "% "& # "' # " # #! # #" ## #$ $ Fig. 2. Localizzazione geografica delle popolazioni del genere Austropotamobius studiate. #% 19 2.2 ANALISI ELETTROFORETICA DI SISTEMI GENE-ENZIMA É stata studiata la variabilità di 22 enzimi codificati presumibilmente da 29 loci (Tab. 3) mediante elettroforesi orizzontale su gel di amido.Per la preparazione dei gel si e’ impiegato amido della Connaught Laboratories (Starch-hydrolyzed) disciolto in proporzione del 12% in un sistematampone specifico per ogni enzima. La soluzione veniva riscaldata fino all'ebollizione, quindi degassata tramite l'uso di una pompa a vuoto, versata in piastre di plexiglass di 16 cm x 21,5 cm x 0,7 cm. Il gel veniva poi fatto raffreddare per almeno 20 minuti. Sono state utilizzate per l'analisi elettroforetica le porzioni muscolari scheletriche presenti nelle appendici amputate e porzioni muscolari di altre parti corporee come l'addome o il torace degli animali sacrificati. Queste venivano omogeneizzate meccanicamente in due o tre gocce di un tampone di estrazione: tris 0,2 M, pH 7, mercaptoetanolo 14 mM, ditioeritritolo (DTT) 10-3 M, EDTA 2 mM (modificato da Soltis et al., 1983). L'omogenato così ottenuto veniva poi fatto assorbire da rettangolini (4x5 mm) di carta Whatman n°3 che venivano successivamente inseriti in pozzetti praticati nel gel mediante un pettine ad un'altezza variabile da 3 a 5 cm sul lato più lungo della piastra. Le piastre venivano quindi portate in una cella termostatata a 4°C dove veniva eseguita l'elettroforesi. Tempi e voltaggi applicati e sistema tampone utilizzato per i diversi enzimi utilizzati sono elencati in Tab. 4. Terminata l'elettroforesi, il gel veniva tagliato orizzontalmente mediante un filo di nylon; ciascuna fetta veniva quindi colorata per uno specifico enzima. Le tecniche di colorazione utilizzate sono riportate in Tab. 5. 20 Tab. 3. Enzimi analizzati con i relativi loci codificanti, la migrazione elettroforetica (+ = anodica; - = catodica), i sistemi tampone utilizzati e durata della corsa elettroforetica. Enzymes EEC Glicerolo-3-fosfato deidrogenasi 1.1.1.8 Lattato deidrogenasi 1.1.1.28 Malato deidrogenasi 1.1.1.37 Migrazione Sistema Loci V/cm Tampone codificanti + + + + + + + Corsa (ore) Ref. Isocitrato deidrogenasi 1.1.1.42 6-Fosfogluconato deidrogenasi Ottanolo deidrogenasi Glyceraldeide-3-fosfato deidrogenasi 1.1.1.44 G3pdh Ldh Mdh-1 Mdh-2 Idh-1 Idh-2 6Pgdh 1.1.1.73 Odh + 5 8 5 c 1.2.1.12 Gapdh + 8 4 d Xantina deidrogenasi NADH deidrogenasi Superossido dismutasi 1.2.1.37 1.6.99.3 1.15.1.1 + + + 8 8 8 4 4 4 c a c Aspartato aminotransferasi 2.6.1.1 5 8 6 b Alanina aminotransferasi Phosfoglicerato chinasi Esterasi 2.6.1.2 2.7.2.3 3.1.1.1 5 3 2 8 8 8 6 4 3 b f d Peptidasi (Leu-Ala) Peptidasi (Leu-Gly-Gly) 3.4.11 3.4.11 3 6 8 8 5 5 f f Aldolasi Anidrasi carbonica Mannoso fosfato isomerasi Glucosio fosfato isomerasi Fosfoglucomutasi 4.1.2.13 4.2.1.1 5.3.1.8 5.3.1.9 5.4.2.2 Xdh NADH-dh Sod-1 Sod-2 Aat-1 Aat-2 Aat-1 Pgk Est-1 Est-2 Pep-C Pep-B1 Pep-B2 Pep-B3 Ald Ca Mpi Gpi Pgm-1 Pgm-2 3 3 1 1,2,3 3 3 2 2 1 8 8 8 8 8 4 4 3 3 4 d e e c a + +,– + + + + + + + + + + + + + + 1,6 1 4 8 8 8 4 4 4 d a b 3,7 8 4 b 4 8 4 b *I sistemi tampone sono I seguenti: 1) Discontinous Ttris/Citrate (POULIK, 1957); 2) Continous Tris/Citrate (SELANDER et al., 1971); 3) Tris/Versene/Borate (BREWER and SING, 1970); 4) Tris/Versene/Maleate (BREWER and SING, 1970); 5) Discontinous Litium-Borate; SOLTIS et al. (1983); 6) Phosfate-Cytrate; Harris (1966). **Riferimenti per le colorazioni: a) BREWER & SING (1970); b) SHAW & PRASAD (1970); c) SELANDER & al. (1971); d) AYALA et al. (1972); e) HARRIS & HOPKINSON (1976); f) RICHARDSON et al. (1986). 21 Tab. 4. Sistemi tampone (quantita’ di reagenti per litro di soluzione) 1. Tris/citrato discontinuo (Poulik, 1957) Tris 0,076 M, acido citrico 0,005 M, pH 8.2 (18,55 g di ac. borico, 2,40 g di NaOH) Tris 0,076 M , ac. citrico 0,005 M, pH 8.7 ( 9,21 g di Tris, 1,05 g di ac. citrico) 2. Tris/citrato continuo (Selander et al., 1971) Tris 0,678 M, acido citrico 0,157 M, pH 8 (83,2 g di Tris, 30 g di ac.citrico monoidrato) Tris 0,023M , ac. citrico 0,005 M, pH 8 ( 2,77 g di Tris, 1,1 g di ac. citrico) 3. Tris/versene/borato I (Brewer e Sing, 1970) Tris 0,21 M, acido borico 0,15 M, EDTA 0,006 M, pH 8 (25,4 g di Tris, 9,27 g di ac. borico, 2,20 g di EDTA) Tris 0,021 M, ac. borico 0,02 M, EDTA 0,007 pH 8,6 (2,5 g di Tris, 1,24 g di ac. borico, 0,25 g di EDTA ) 4. Tris/maleato (Brewer e Sing, 1970, modificato) Tris 0,1 M, acido maleico 0,1 M, EDTA 0,01 M, MgCl2 0,015 Tampone elettrodi diluito 1:10, pH 7,2 M, NaOH 0,125 M, pH 7,2 (12,11 g di Tris, 11,61 g di ac. maleico,3,72 g di EDTA, 3,05 g di MgCl2, 5 g di NaOH 5. Litio/borato discontinuo (Soltis et al., 1985) LiOH 0,038 M, acido borico 0,188 M pH 8.1 (1,6 g di LiOH, 11,6 g di ac. borico) Tris 0,045 M, ac citrico 0,007 M, LiOH 0,004 M, ac. borico 0,019 M pH 8.3 (5,45 g di Tris,1,28 g di ac. citrico in 900 ml, portare a volume con 100 ml di tampone elettrodi 9:1). 6. Fosfato/Citrato Citrato di sodio tribasico 0,15 M, fosfato di sodio monobasico 0,24M pH 6,3 (44,11 g di citrato di sodio, 32,12 g NaH2PO4) Tampone elettrodi diluito 1:40, portare a pH 6,3 con acido citrico 1M). (Harris, 1966) Tab. 5. Tecniche di colorazione Enzima EC 1.1.1.8 G3PDH EC 1.1.1.28 LDH EC 1.1.1.37 MDH EC 1.1.1.42 IDH EC 1.1.1.44 6PGDH EC 1.1.1.73 ODH EC 1.2.1.12 GAPDH EC 1.2.1.37 XDH EC 1.6.99.2 NADHdh EC 1.15.1.1 SOD EC 2.6.1.1 AAT EC 2.6.1.2 ALAT Tamp. di colorazione coenzimi 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 50 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 50 ml NAD 15 mg 0,05 M Tris/HCl pH 8, 50 ml substrati attivatori e/o inibitori metodi di visualizzazione NAD 15 mg α-glicerofosfato 300 mg EDTA 50 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% NAD 15 mg idrossibutirrato 300 mg NaCl 200 mg NAD 15 mg malato di sodio 1M pH 7 NADP 7 mg NADP 7 mg NAD 15 mg DL-isocitrato 60 mg NAD 15 mg enzimi EC 4.1.2.13 ALD 0,4 ml gluconato-6- fosfato 20 mg ottanolo 4 ml etanolo 2 ml fruttosio-1,6-difosfato 125 mg incubato con ALD per 30' ipoxantina 50 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% MgCl2 10 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% MgCl2 10 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% MTT 10 mg, PMS 2 mg Na arseniato 50 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% MTT 1 mg Menadione 25 mg NADH 25 mg EC 1.1.1.28 LDH 0,1 ml ac. α-chetoglutarico 100 mg, ac. aspartico 200 mg, pH 7,5 con Tris 1M L-Alanina 200 mg, ac. αchetoglutarico 50 mg, NADH 10 mg piridossal-5'-P 10 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% Fast Blu BB 100 mg UV MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% Tab. 5 (continua) Enzima Tamp. di colorazione EC 2.7.2.3 PGK 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml EC 3.1.1.1 EST 0,1 M NaHPO4; 0,1 EC 3.4.11 PEP EC 3.4.11 P EP EC 4.1.2.13 ALD EC 4.2.11 CA EC 5.3.1.8 MPI EC 5.3.1.9 PGI EC 2.7.5.1 PGM coenzimi M KH2PO4 pH 5 150 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,1 M NaHPO4; 0,1 M KH2PO4 pH 5 150 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml 0,05 M Tris/HCl pH 8, 30 ml enzimi substrati attivatori e/o inibitori metodi di visualizzazione EC 1.2.1.12 G3PDH 0,1 ml EC 1.3.1.1 TPI 0,02 ml EC 2.7.1.1 HK 0,02 ml ac. 3-fosfoglicerico 30 mg ATP 30 mg NADH 10 mg α+β-naftilacetato 50 mg sciolto in 3 ml di acetone MgCl2 40 mg UV MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% Fast Garnet GBC 100 mg EC 1.11.1.7 PER 0,03 ml EC 1.2.3.1 L-AO 0,05 ml EC 1.11.1.7 PER 0,03 ml EC 1.2.3.1 L-AO 0,05 ml EC 1.2.1.12 G3PDH 0,1 ml L-Leu-Ala 20 mg O-dianisidina 10 mg L-Leu-Gly-Gly 20 mg O-dianisidina 10 mg fruttosio-1,6-difosfato 125 mg incubato con ALD per 30' 4-metil-umbelliferil-acetato 10 mg in 1 ml di acetone MnCl2 20mg agar 8% MnCl2 20mg agar 8% EC 1.11.1.7 PER 0,03 ml EC 1.2.3.1 L-AO 0,05 ml Na arseniato 50 mg MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% UV MgCl2 10 mg NADP 7 mg EC 1.1.1.43 6PGDH 0,02 ml mannosio-6-fosfato 25 mg EC 5.3.1.9 PGI 0,02 ml EC 1.1.1.43 6PGDH 0,02 ml fruttosio-6-fosfato 10 mg NADP 7 mg EC 1.1.1.43 6PGDH 0,02 ml glucosio-1-fosfato 160 mg MgCl2 10 mg, NADP 7 mg MgCl2 10 mg glucosio-1,6difosfato, tracce MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% MTT 10 mg,PMS 2 mg agar 8% 24 Come in un precedente lavoro, gli enzimi con la stessa funzione enzimatica, codificati da loci diversi (isozimi), sono stati numerati in ordine decrescente a partire da quello più anodico, ad esempio Aat-1, Aat-2, e così via. Per gli allozimi, cioè quegli enzimi che sono codificati da alleli diversi dello stesso locus, è stata adottata una nomenclatura che esprime la loro mobilità relativa in mm rispetto all’allele 100, ad esempio Odh85, ha una mobilita’ di 15mm inferiore a quella di Odh100.in una corsa standard). 2.3 ANALISI DEL DNA MITOCONDRIALE 2.3.1 Estrazione del DNA Il DNA totale è stato estratto da tessuto muscolare conservato a -80°C secondo il metodo CTAB/fenolo-cloroformio modificato. Circa 200 mg di tessuto per ogni individuo sono stati omogeneizzati in 500 µl di tampone di estrazione CTAB [Tris HCl 0,1 M, pH 8; NaCl 1,4 M; EDTA 0,02 M; CTAB (bromuro di hexadecyltrimetilammonio) 2%; 2-mercaptoetanolo 0,1%] e digeriti con 5 µl di proteinasi K (20 mg/µl) a 45°C per 12 ore. Successivamente si aggiungono 500µl di fenolo: cloroformio: alcol isoamilico (25: 24:1), si mantengono in agitazione per 5’ e poi si centrifugano per 15’, al fine di separare la fase più pesante contenente i prodotti proteici della digestione dalla fase acquosa che viene prelevata e messa in tubi puliti. Per assicurare una separazione accurata tale passaggio si ripete due volte, prima con fenolo: cloroformio: alcol isoamilico e poi in cloroformio assoluto. Gli acidi nucleici contenuti nella fase acquosa vengono fatti precipitare a – 20°C con 1000 µl di etanolo assoluto in presenza di NaCl (7mM) e successivamente sottoposti a centrifugazione (15’ per 13000 giri/minuto); un ulteriore passaggio in etanolo al 70% permette di allontanare i sali residui. Il pellet così ottenuto viene fatto asciugare e risospeso in 100 µl di TE (Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH 8). 25 Nelle metodiche applicate in seguito non ha interferito l’eventuale presenza di RNA, pertanto non è stato necessario sottoporre la soluzione ottenuta a trattamento con RNAasi. 2.3.2 Amplificazione mediante PCR Il DNA estratto è stato sottoposto ad una reazione a catena della DNA polimerasi (PCR, Saiki et al., 1988). Tale reazione permette di ottenere, a partire da una soluzione molto eterogenea di acidi nucleici, un elevato numero di copie di una specifica porzione di DNA. In questo studio sono state amplificate due regioni mitocondriali codificanti rispettivamente per un frammento di 490 bp per la citocromo I ossidasi individuata dai primers specifici COX1768 (5’ GGC TTT CCC CCG AAT AAA TA 3’) e COX2220 (5’ AAC CTC TGG GTG ACC AAA AA 3’), e un frammento di 510 bp per la subunità ribosomiale 16S, individuato dai primers degenerati modificati da Palumbi (1996): D16SAR (5' CGC CTG TTT AHY AAA AAC AT 3’) e D16SBR (5' CCG GTC TGA ACT CAG MTC AYG T 3’). La reazione della PCR è avvenuta utilizzando un "termal cycler" GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer), in 50 µl di soluzione con: 5-20 ng di DNA totale, 2,5 u di Taq DNA polymerase (Promega) con il tampone di reazione fornito dal produttore, i due primers 0,2 µM, MgCl2 2,5 mM, dNTP 0,2 mM. Il programma di reazione, preceduto da una fase iniziale di 2’ a 94°C, è il seguente: 30’’ a 94°C, 45’’ a 49°C, 1’ a 72°C per 35 cicli, 10’ a 72°C. Il prodotto di reazione è stato controllato sottoponendone 5 µl a migrazione elettroforetica su gel d’agarosio al 2% in TBE (0,045 M Trisborato;0,001 M EDTA, pH 8) contenente 0,01% di bromuro di etidio e visualizzato sotto luce ultravioletta. 2.3.3 Sequenziamento Per ciascun esemplare, i frammenti di PCR di alcuni individui sono stati purificati (PCR Purification kit, Qiagen), e sottoposti a sequenziamento 26 mediante sequenziatore automatico (modello A.B.I. Prisma 310, Perkin Elmer). La soluzione per la reazione di sequenza avviene in un volume finale di 10 µl e contiene 2 µl di ABI-mix per sequenziamento (Perkin Elmer), 1,2 µl di primer (10 µM) e circa 50 ng di prodotto di PCR purificato; sono utilizzati gli stessi primers della reazione di PCR. Per ogni esemplare entrambi i filamenti sono stati sequenziati, in modo da effettuare un accurato controllo della lettura della sequenza mediante la procedura dell’allineamento e del controllo reciproco. 2.3.4 Analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione Per estendere l’indagine a un maggior numero di individui rispetto a quelli sequenziati si è cercato un set di enzimi di restrizione che presentasse un pattern di digestioni polimorfico all’interno del frammento analizzato in modo da poter caratterizzare, all’interno dei campioni a disposizione, i principali aplotipi mitocondriali evidenziati sulla base delle sequenze. Tale analisi e’ stata limitata al frammento per la citocromo I ossidasi. Gli enzimi di restrizione utilizzati sono: Dde-I, Xsp-I e Acc-I (Tab. 6). La reazione di digestione è stata condotta in un volume finale di 10 µl del tampone di reazione fornito dal produttore, contenente 7,5 µl di prodotto di PCR, 1 µg di BSA (acetato di siero albumina bovina) e 5 u di enzima. Alla miscela di reazione sono state aggiunte alcune gocce di olio minerale per impedire eventuali fenomeni di evaporazione e conseguenti variazione nelle concentrazioni dei reagenti. Le digestioni sono avvenute in ambiente termostatato, alla temperatura consigliata dal fornitore dell’enzima, per circa 12 ore , in modo tale da garantire il completamento della digestione. Al termine della reazione sono stati aggiunti 2 µl di soluzione colorante avente anche il ruolo di bloccare ulteriori processi digestivi; i frammenti ottenuti sono stati separati ed individuati su gel d’agarosio al 3% e le rispettive dimensioni sono state inferite attraverso il confronto con le bande prodotte da un appropriato marcatore di peso. 27 Tabella 6. Enzimi di restrizione considerati e relativi siti di taglio. ENZIMA DI RESTRIZIONE SITO DI TAGLIO Dde I C’TNAG Xsp I C’TAG Acc I GT’(A/C) 2.4 ANALISI STATISTICHE 2.4.1 Dati allozimici I dati ottenuti dalle analisi elettroforetiche sono stati utilizzati per calcolare la variabilità genetica all’interno e tra le popolazioni e il differenziamento genetico. L’elaborazione è stata eseguita mediante i programmi Biosys (Swofford & Selander, 1981) e Genepop 2 (Raymond & Rousset, 1995). Equilibrio di Hardy-Weinberg Per ogni campione (o gruppo di campioni), l’equilibrio di Hardy-Weinberg e’ stato verificato con il metodo del χ2e con il test esatto di Fisher (1970)- Stime di linkage disequilibrium tra genotipi sono state ottenute tramite test esatti di Fisher (1970) calcolati su tavole di contingenza costruite per coppie di loci. L’ipotesi nulla che è stata verificata è che non ci fosse associazione tra genotipi a loci diversi. Mediante il programma GENEPOP sono state elaborate le tavole di contingenza su cui è stato applicato il test esatto di Fisher per la stima della probabilità dell’associazione di ogni coppia di loci attraverso tutti i campioni. 28 Parametri di variabilità genetica I parametri utilizzati sono i seguenti: 1) Numero medio di alleli per locus (A): A= Nall N loc P= X N con Nall numero totale di alleli e Nloc numero totale di loci. 2) Percentuale di loci polimorfici (P): dove X è il numero di loci polimorfici e N è il totale di loci esaminati. Un locus è considerato polimorfico se presenta più di un allele e se la frequenza dell’allele più comune non supera il 99% (criterio del 99%). Può anche essere adottato il criterio di polimorfismo al 95%, in questo caso la frequenza dell’allele più comune non supera il 95%. Eterozigosi media per locus, osservata (Ho) e attesa . Quest’ultima viene calcolata come: He = − 3) ∑h e N loc in cui, con xi uguale alla frequenza dell’allele i-esimo, he rappresenta la percentuale di eterozigoti attesi ad ogni singolo locus in base all’equilibrio di Hardy-Weinberg; he = ∑ x i 2 Differenziamento genetico fra popolazioni I livelli di divergenza o di identità genetica tra le popolazioni è stato stimato mediante gli indici di distanza genetica standard di Nei (1972) e di distanza della corda di Cavalli Sforza ed Edwards (1967). Per valori relativamente bassi di distanza genetica (D<1), ed assumendo un tasso costante di sostituzioni aminoacidiche per le varie 29 proteine, la distanza genetica secondo Nei risulta correlabile al tempo di divergenza tramite una relazione lineare. Nei (1975, 1987), ha proposto la seguente formula: t= D 2cnλ dove t rappresenta il tempo relativo all’inizio dell’isolamento fra le due popolazioni ancestrali, in seguito al quale si sarebbe verificata la loro evoluzione indipendente; c è la proporzione di sostituzioni aminoacidiche riconoscibili elettroforeticamente; n è il numero medio di aminoacidi per proteina; λ corrisponde al tasso di sostituzione aminoacidica per sito per anno. Una stima approssimativa di tali parametri porta alla formula t = 5·106D (Nei, 1975). Cluster analysis Per rappresentare le relazioni di affinità genetica tra le popolazioni sono stati elaborati dei dendrogrammi (cluster analysis). In particolare è stato usato il metodo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Analysis, Sokal & Sneath, 1963) sulla base della matrice di valori di distanza genetica di Nei (1972) e con il metodo Neighbor Joining (NJ, Saitou and Nei, 1987).a partire dalle distanze della corda di Cavalli Sforza e Edwards, 1967. Per queste elaborazioni e’ stato usato il programma Phylip 3.572 (Felsenstein, 1995). 2.4.2 Analisi delle sequenze Le sequenze sono state corrette e analizzate con il programma Chromas e allineate con il programma ClustalX 1.81 (Jeanmougin et al., 1998). Il numero di transizioni (ts) e transversioni (tv) e’ stato calcolato a mano, mentre il numero di siti polimorfici, la composizione nucleotidica cosi’ come gli alberi di Neighbor Joining (NJ) (Saitou e Nei, 1987), e Massima Parsimonia (MP) (Cavalli-Sforza & Edwards 1967) sono stati calcolati usando il programma MEGA version 2.1 (Kumar et al. 2001). Gli alberi di NJ sono stati ottenuti a partire da una matrice di distanze calcolata con il metodo di 30 Jukes-Cantor (1969) che da’ lo stesso peso a ts e tv. E’ stato osservato che, nel caso in cui si abbia un set di sequenze con una distanza media totale simile o inferiore a 0.05 (nel nostro caso 0.066 per COI e 0.026 per 16S), e’ consigliabile usare Jukes–Cantor in quanto garantisce un livello accurato di stima delle distanze con una minore varianza rispetto a altre formule piu’ complesse per la distanza genetica (Nei & Kumer, 2000). Il metodo della Massima Parsimonia (MP) opera direttamente dalle sequenze dei nucleotidi per la ricostruzione di un albero che contenga il minor numero possibile di cambiamenti evolutivi Prima di operare l’analisi filogenetica con i due metodi sopra descritti, i dati delle sequenze sono stati trattati con la procedura del bootstrap. Tale metodo risponde all’esigenza di ridurre l’errore di campionamento presente nel data set di sequenze, in modo da svincolare il più possibile la stima dal caso particolare dei dati a disposizione. Il metodo del bootstrap crea delle “pseudorepliche” del campione di sequenze iniziale, in modo da ottenere un set di dati multipli e quindi comparare le stime ottenute dai diversi campioni. Partendo da un data set multiplo, ciascuna procedura per l’analisi filogenetica (NJ, MP) ha dato come risultato una serie di alberi; attraverso il metodo del consenso è stato poi ottenuto un solo albero, in cui è stata riportata la frequenza di ogni nodo che fosse presente in almeno metà degli alberi del bootstrap. Sono stati inoltre costruiti dei minimum spanning trees con il metodo della ‘probabilità statistica’ (Templeton et al., 1992), con il Programma TCS (Posada et al., 2000). 31 CAPITOLO 3 RISULTATI 3.1 STATUS ATTUALE DELLE POPOLAZIONI ITALIANE Il primo censimento nazionale delle popolazioni italiane risale alla fine del XIX secolo ad opera dell’allora Ministero dell’Agricoltura (Vinciguerra, 1899). Anche in quel rapporto veniva rimarcato il notevole decremento rispetto a pochi decenni prima a causa di “straordinarie mortalità per cause non bene identificate e probabilmente di natura molteplice, tra cui però principale qualche infezione epidemica”. In Fig.3. i campioni riportati da Vinciguerra vengono confrontati con quelli censiti dal presente studio e con uno studio precedente di Albrecht, 1983. Le popolazioni censite da noi sono evidenziate in rosso, quelle osservate da Vinciguerra sono indicate in nero: i punti interrogativi indicano aree da noi non investigate e pertanto a presenza incerta, mentre le X rappresentano aree censite dove non abbiamo ritrovato gamberi. Nella figura sono inoltre mostrati campioni riportati da Albrecht (1982). Il confronto tra l’analisi distributiva fatta da Vinciguerra (1899) e quella da noi effettuata negli ultimi cinque anni ha evidenziato una notevole identità distributiva delle popolazioni italiane di A. italicus.In entrambe le distribuzioni si osserva una presenza più marcata nei corsi d’acqua pralpini e una bassa presenza in Pianura Padana. Lungo la penisola la sua presenza si mantiene mediamente più elevata nei corsi d’acqua del versante adriatico rispetto a quello tirrenico. Il limite meridionale della distribuzione e’ rappresentato dal confine Calabro-Lucano. In particolare le popolazioni piu’ meridionali di A. italicus da noi osservate sono localizzate nel massiccio del Pollino. 33 Gran parte delle popolazioni sono distribuite lungo i crinali alpini ed appenninici; meno cospicua la presenza in pianura, dove sono state censite pochissime popolazioni. Molte popolazioni della fine dell’800 venivano descritte nei corsi d’acqua principali, oggi virtualmente privi di gamberi residenti. Le popolazioni da noi censite sono state tutte individuate nei piccoli tributari delle principali aste fluviali. In Italia nord-occidentale sono state censite numerose popolazioni nelle provincie di Genova ed Alessandria nell’ambito di studi di una zona di parapatria tra A. pallipes e A. italicus escluse dal presente lavoro; in quest’area il Vinciguerra descriveva una singola popolazione dell’alto Scrivia. Diverse popolazioni da noi investigate lungo la fascia alpina sono di modeste dimensioni e presumibilmente prossime all’estinzione mentre alcune di dimensioni rilevanti sopravvivono ancora in Val d’Ossola e in Canton Ticino. Popolazioni abbondanti sono state osservate nelle stazioni dell’Italia nordorientale, particolarmente in Friuli, lungo il bacino dell’Isonzo, nel Carso Sloveno e Triestino, mentre il campione dalmata era molto ridotto. Un numero discreto di popolazioni è stato rilevato nei corsi d'acqua dell’alto Lazio alcune delle quali relativamente abbondanti. In alcuni di essi, localizzati in aree protette, sono state effettuati dei ripopolamenti nell’ambito di progetti life natura. In Sabina, nel passato ricca di gamberi, la rarefazione del gambero di fiume è stata particolarmente significativa; il bacino del Velino del Turano e del Tronto sono ormai virtualmente privi di popolazioni autoctone, mentre la diffusione delle specie esotiche è in espansione. Nell'Agro reatino è stata rilevata la presenza del gambero della Louisiana (Procambarus clarkii), mentre nei laghi artificiali del Salto e del Turano convivono il gambero turco (Astacus leptodactylus) e il gambero americano Orconectes limosus. Due piccole popolazioni di A. italicus individuate nel 1995 in due affluenti dell'alto Velino si sono estinte nell'arco di due anni. Altre tre popolazioni 34 attualmente oggetto di studio sono state localizzate in aree isolate e scarsamente antropizzate del bacino Tevere-Farfa. Anche in Abruzzo la rarefazione del gambero di fiume è stata particolarmente significativa: fino a pochi decenni fa esso era ampiamente distribuito lungo i principali bacini idrici, in particolare quelli dell'Imele-Salto, dell'Aterno, del Pescara e del Sangro. Scomparse ormai dai corsi principali, le popolazioni superstiti sono limitate a quelli secondari e terziari. Tra le numerose cause di rarefazione la più importante è certamente l'inquinamento dei corpi idrici. Le analisi delle comunità macrobentoniche di numerosi corsi d'acqua abruzzesi hanno rivelato livelli di inquinamento incompatibili con le esigenze ecologiche del gambero di fiume. In numerose occasioni sono state rilevate situazioni di inosservanza delle norme di tutela ambientale quali scarichi abusivi o sistemi di depurazione inadeguati. Un secondo fattore di rilevo è rappresentato dalla gestione delle acque interne. Ad esempio nel corso superiore dell'Imele, dove sopravviveva una discreta popolazione di gambero di fiume sono stati di recente interventi di arginatura consistenti nell’escavazione degli argini e del letto del corso d’acqua e nella totale eliminazione della copertura vegetazionale. Tale intervento ha causato la totale eliminazione della popolazione residente nel tratto interessato e la distruzione dell’habitat del gambero di fiume. L’eliminazione della copertura vegetale e l’allargamento del letto fluviale hanno inoltre provocato un sensibile innalzamento della temperatura dell’acqua passata dalla media estiva di 16°C ai quasi 25°C nel mese di luglio. L’esplorazione di un tratto ancora integro situato più a valle ha rivelato una presenza modesta di gamberi adulti ma una modesta presenza di forme giovanili. Le osservazioni di numerose popolazioni italiane hanno confermato che Austropotamobius italicus predilige corsi d’acqua di piccole e medie dimensioni localizzati in aree integre, poco disturbate e ricche di calcare e argille. Sono state messe in evidenza due principali tipologie di habitat 35 preferenziale: torrenti moderatamente ripidi con fondali rocciosi e ghiaiosi a corso rapido più o meno ricchi di vegetazione acquatica; fossati a corso lento caratterizzati da fondali sabbiosi e limacciosi, piuttosto ricchi di macrofite acquatiche (Acorus calamus, Phragmites communis). Nella prima tipologia i gamberi tendono a stabilirsi nelle pozze, ben riparate dalla vegetazione riparia, dove la corrente è meno intensa nascondendosi tra i sassi o scavando rifugi lungo le sponde argillose. Nella seconda tipologia di habitat acquatico essi prediligono le ampie pozze che si formano lungo le anse ben coperte dalla vegetazione arborea. Qui essi scavano i propri rifugi sulle sponde più ripide. 36 3.2 ANALISI GENETICA A LIVELLO NUCLEARE: LOCI ENZIMATICI Dei 29 loci enzimatici analizzati, 4: Mdh-2, Idh-1, Sod-1, Mpi sono risultati monomorfici per uno stesso allele in tutti i campioni analizzati di Austropotamobius italicus, A. pallipes e A. torrentium. Le frequenze alleliche ai loci variabili sono mostrate in Tab. 7. Solo in tre casi e’ stato osservato uno scarto significativo dall’equilibrio di Hardy-Weinberg a singoli loci, con un deficit di eterozigoti nel campione #36 (Ferrano, Valdarno) per l’Aat-2 (D=0,352) e con un eccesso di eterozigoti nei campioni #19 (Valle Imagna, Prealpi Orobie) per l’Idh-1 (D=0,310) e #25 (Bottazzo, Carso Triestino) per l’Odh (D=0,429). Undici loci mostrano alleli distinti in A. torrentium sia rispetto a A. pallipes che a A. italicus (G3pdh104, Mdh-1127, Odh106, NADHdh104, Aat-298, Pgk99, Pgm-292, Pgm-296, Est-195, PepC86, PepC96, Ca98, Ca108) mentre 6 discriminano A. pallipes dagli altri taxa (con gli alleli caratteristici G3pdh106, Odh85, Aat-2104 Pgm-1105, PepC88, PepB-198). I campioni di A. pallipes sono risultate notevolmente omogenee, mentre nell’ambito di A. torrentium sono stati osservati due gruppi di popolazioni, differenziati per l’Aat-1, Est-2, Ald e Ca. In Tab 7 sono mostrate le frequenze alleliche di due campioni rappresentativi di ciascun gruppo, Tarvisio (Friuli) e Lokve (Croazia). Nell’ambito di A. italicus, 9 loci: Mdh-2, Idh-2, Sod-1, Aat-1, Est-1, PepB-2, Ald, Ca, Mpi, sono risultati monomorfici in tutti i campioni analizzati, mentre 10: G3pdh, Ldh, Idh-1, 6Pgdh, Gapdh, Xdh, NADHdh, Pgm-1, Pgm-2, Est-2, Gpi, hanno mostrato bassi livelli di polimorfismo, con uno stesso allele piu’ frequente in tutte le popolazioni e spesso l’unico presente. Il polimorfismo a questi loci riguardava infatti di volta in volta solo alcuni (o uno solo) dei campioni analizzati, con frequenze generalmente basse; solo nel caso di Idh-1, 6Pgdh, Pgm-2, e Alat la frequenza del secondo allele osservato superava il 30% (Tab.7). I rimanenti loci risultano differenziati tra popolazioni (o gruppi di popolazioni) di 37 A.italicus, spesso mostrando un andamento geografico, come mostrato nelle cartine in Figg. 4-10. Al locus Mdh-1 (Fig.4) l’allele 125 e’ stato osservato solo in Spagna, con frequenze che raggiungono 0,58 in Aragona (#5), mentre tutte le altre popolazioni sono caratterizzate dall’allele 100. All’Odh (Fig.5) si caratterizzano per la presenza dell’allele 108 campioni orientali: del Carso triestino (#25), dei dintorni di Rijeka (#64) e della Dalmazia (#65). Alla Sod-2 (Fig.6), un gruppo di popolazioni del bacino dell’Isonzo (#23, 59-61) si differenzia per avere l’allele 106, invece di 100, come piu’ comune o unico presente. Per il locus Aat-2 (Fig.7) la situazione e’ piu’ complessa; in Spagna prevale l’allele 95 nelle popolazioni del versante mediterraneo e il 102 in quelle atlantiche; quest’ultimo caratterizza una vasta area, con i campioni del Canton Ticino (#8-11), dell’Italia nord-occidentale (#12-31) e centrosettentrionale fino alle Marche (#32-38) e ha frequenze elevate nei campioni del bacino dell’Isonzo (#23, 59-61) e delle Prealpi Giulie (#22); mentre l’allele 92 caratterizza campioni delle Prealpi Orobie (#19) e Bellunesi (#20), Carnia (#21) e Rijeka (#64), prevale lungo le coste adriatiche rispettivamente fino alla Dalmazia (#24, 25, 65), e fino a Gubbio lugo la costa, nonche’ in vari campioni dell’Appennino Abruzzese; infine l’allele 100 prevale nei campioni dell’Italia centro-meridionale (#39-57), e si ritrova anche in campioni dei Pirenei orientali (]#7), della piana del Tagliamento (#24) e del Carso Triestino (#25); Alla Pgk (Fig.8) le popolazioni spagnole sono caratterizzate da una frequenza elevata dell’ allele 94 (>0,44, tranne che in Andalucia, #6) e bassa dell’allele 100 (0-0,22), mentre l’allele 98 supera il 50% nei campioni #1 e #5. Quest’ultimo allele e’ fissato in campioni del Carso Triestino (#25) e Sloveno (#62), a Rijeka (#64), in Istria (#63) e un singolo campione dell’Appennino Emiliano (#32), mentre in genere non supera lo 0,30 nei campioni dell’Italia nord occidentale e del Canton Ticino ed e’ assente nella maggior parte dei 38 campioni dell’Italia centro-meridionale, tranne che in quelli adriatici marchigiani (#39, 42). Al locus PepC (Fig.9) le popolazioni spagnole (#1-6), svizzere (#8-11) e dell’Italia centro-settentrionale-occidentale (#13-18, 26-37) sono caratterizzate dall’allele 90, quelli dell’Italia centro-meridionale e nordorientale, della Slovenia e della Croazia dall’allele 100, mentre alleli privati 112 e 104 sono stati osservati rispettivamente nei campioni del Carso Sloveno (#62) e Rijeka (#64). Al locus PepB-1 (Fig.10) l’allele 100 e’ l’unico presente nelle popolazioni dell’Italia centromeridionale (#39-57) nei campioni del Carso Sloveno (#62) e Rijeka (#64) e in due campioni rispettivamente dell’Appennino Ligure (#30) e dei Pirenei Oientali francesi (#7). In tutti gli altri e’ fissato o prevale l’allele 105. Infine al locus PepB-3 (Fig.11) l’allele 100 e’ l’unico presente tranne che in un gruppo dell’Italia centro-settentrionale (#32-37) dove e’ fissato l’allele 92, e in un gruppo del bacino dell’Isonzo (#23, 59-61), dove e’ fissato l’allele 96. I valori di distanza genetica, calcolati con gli indici di distanza genetica standard di Nei (1972) e di distanza della corda di Cavalli Sforza Edwards (1967) sono riportati in Tab. 8. La distanza genetica media tra A.italicus e A. pallipes (escludendo le popolazioni introgresse identificate in Liguria e Piemonte, Santucci et al., 1997; Bondanelli et al., in prep.) e’ risultata DNei=0,32 (range 0,25-0,41), mentre tra A. italicus e A. torrentium DNei=0,70 (range 0,63-0,81); tra A. pallipes e A. torrentium la media e’ DNei=0,83 (range 0,80-0,87). All’interno di A.italicus i valori di distanza genetica variano da 0 a 0,189, con una media di 0,082. La maggiore omogeneita’ genetica e’ stata osservata per: il gruppo di popolazioni dell’Italia centrale e meridionale e tra questo e due campioni disgiunti, rispettivamente dei Pirenei orientali e dell’Appennino Ligure (DNei=0,003, range 0-0,01); un gruppo dell’Italia nordoccidentale e canton Ticino (DNei=0,008, range 0-0,03); un gruppo del bacino dell’Isonzo (DNei=0,001, range 0-0,002). Valori lievemente superiori sono stati 39 osservati all’interno dei seguenti gruppi: (i) Spagna (DNei=0,02, range 0,0010,03), (ii) Italia nord-orientale, con campioni delle Prealpi Orobie, Bellunesi, e della piana del Tagliamento (DNei=0,01, range 0,01-0,02), (iii) Appennino Tosco-Emiliano (DNei=0,03); (iv) Carso sloveno e Rijeka (DNei=0,02). Le relazioni di affinita’ genetica tra le popolazioni di A.italicus sono mostrate dai dendrogrammi nelle Figg. 12 e 13, ottenuti rispettivamente con il metodo UPGMA dalle distanze di Nei e con il metodo Neighbor Joining dai valori di distanza della corda di Cavalli Sforza ed Edwards. Campioni rappresentativi di A. pallipes e A. torrentium sono stati inclusi come outgroup. Per quanto riguarda A. italicus, I due metodi coincidono nell’indicare tre gruppi principali, rispettivamente comprendente: 1) campioni della Spagna, Canton Ticino, Italia nord-occidentale e Appennino Tosco-Emiliano, con la Spagna piu’ affine a campioni delle prime due regioni; 2), campioni dell’Italia centro-meridionale, che si legano a campioni dalle Prealpi Orobie all’Italia nord-orientale, Carso italiano e Sloveno, Istria, Dalmazia; 3) un gruppo del bacino dell’Isonzo. All’interno di questi tre clusters vi sono alcune differenze di topologia con i due metodi: ad esempio le popolazioni spagnole si legano prima tra loro con l’UPGMA, mentre con il NJ due campioni spagnoli del versante Atlantico si legano prima a un campione emiliano che agli altri spagnoli; nell’ambito del gruppo 2, relativamente eterogeneo, i campioni del Carso sloveno (62) e Rijeka (64) formano un cluster distinto con l’UPGMA mentre si legano a due campioni del Carso Triestino (#25) e dell’Istria (#63) con l’NJ; il campione di Gubbio (#38) si lega a queste ultime con il NJ, e a campioni della piana del Tagliamento con l’UPGMA. I valori di bootstrap sono comunque generalmente piuttosto bassi all’interno dei cluster principali, mentre risultano piu’ elevati tra cluster. I tre cluster non vengono risolti con il NJ, mentre il gruppo del bacino dell’Isonzo risulta il piu’ differenziato con l’UPGMA. I parametri di variabilita’ genetica osservati nelle popolazioni studiate sono riportate in Tab. 9. I valori osservati sono notevolmente bassi. In 40 particolare per A. italicus i valori medi sono A=1,1; P99=8,1; P95=5,9; Ho=0,021; He=0,022). Alcune popolazioni di questa specie sono risultate monomorfe a tutti i 29 loci studiati, soprattutto nell’Italia peninsulare, dall’Emilia alla Calabria (#31, 40, 48, 54, 55); altre, sempre in questa regione, sono polimorfiche solo con il criterio del 99% (#28, 41, 44, 45). Valori di polimorfismo superiori al 20% (con il criterio del 99%) sono stati osservati solo nel campione delle Prealpi Orobie (#19, P99=24,1), e in uno dei Monti Sabini (#P99=20,7) di eterozigosi sempre nel #19 (He=0,049), in alcuni campioni del Carso (#25,43,62, con He tra 0,04 e 0,05) e della Spagna (#3, 4, 6, con He=0,04). In A. pallipes la variabilita’ genetica a livello dei marcatori nucleari analizzati e’ prossima a zero, mentre in A. torrentium i valori sono nel range di quelli osservati in A. italicus (A=1,1, P99=10,3, P95=5,1, Ho=0,014, He=0,017) I valori di FST, che misurano la diversita’ tra popolazioni, sono invece generalmente elevati in A. italicus. Il valore complessivo e’ 0,78. Anche all’interno di gruppi risultati omogenei a livello di distanze genetiche, i valori di FST rimangono piuttosto elevati: per es. FST=0,16 tra il gruppo di popolazioni dell’Italia centro-meridionale, piu’ quelle dei Pirenei orientali e del Piemonte risultate ad esso affini; FST=0,25 per i campioni della Spagna, e 0,16 per quelli dell’Italia nord-occidentale e Canton Ticino (esclusa l’Emilia), mentre FST =0,56 per tutto il cluster comprendente le popolazioni dall’Italia centro-settentrionale alla Spagna evidenziato dai dendrogrammi. Anche per le popolazioni dell’Italia nord-orientale i valori di FST sono in genere elevati: mantenendosi superiori a 0,2. Per il cluster formato da Italia centromeridionale e orientale, Carso, Slovenia e Dalmazia il valore di FST e’ 0,63. Solo per il cluster comprendente i campioni del bacino dell’Isonzo si ottiene un valore basso di FST: 0,036. A questi valori corrispondono livelli molto bassi di flusso genico, generalmente inferiori a 1 (considerata come soglia al di sotto del quale si puo’ avere differenziamento per deriva genetica, in assenza di selezione). Superano tale soglia i gruppi dell’Italia nord-occidentale e del Canton Ticino 41 (Nm=1,32), dell’Italia centro-meridionale(Nm=1,29) e del bacino dell’Isonzo (Nm=6,69). Tab. 7- frequenze alleliche osservate nelle 59 popolazioni studiate di Austropotamobius italicus ai 25 loci variabili. LOCUS G3pdh 94 100 104 106 Ldh 92 95 100 Mdh-1 100 125 127 Idh-1 93 100 6Pgdh 96 100 103 Odh 85 100 106 108 Gapdh 100 110 Xdh 100 110 Nadh-dh 100 102 104 107 Sod-2 92 100 106 110 1 2 3 4 5 6 7 8,9,10 11 12,13 14,15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,95 0,00 0,05 0,00 1,00 0,00 0,00 0,16 0,84 0,00 0,00 0,00 0,96 0,00 0,04 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,72 0,28 0,00 0,70 0,30 0,00 0,69 0,31 0,00 0,78 0,22 0,00 0,42 0,58 0,00 0,82 0,18 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,32 0,68 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,98 0,02 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,02 0,98 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,70 0,00 0,30 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,98 0,00 0,02 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,97 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 Tab. 7 (continua) LOCUS Aat-1 100 104 Aat-2 88 92 95 98 100 102 104 110 Pgk 94 98 99 100 105 107 Pgm-1 97 100 105 Pgm-2 92 96 100 Est-1 95 100 Est-2 92 93 100 103 PepC 86 88 90 96 100 104 112 1 2 3 4 5 6 7 8,9,10 11 12,13 14,15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,38 0,00 0,00 0,63 0,00 0,00 0,00 0,00 0,75 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 0,00 0,82 0,00 0,00 0,18 0,00 0,00 0,00 0,00 0,61 0,00 0,00 0,39 0,00 0,00 0,00 0,16 0,00 0,00 0,63 0,22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,02 0,98 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05 0,95 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,16 0,84 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05 0,95 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,15 0,00 0,00 0,81 0,00 0,00 0,04 0,00 0,38 0,00 0,00 0,00 0,52 0,00 0,11 0,15 0,65 0,00 0,00 0,21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,64 0,00 0,00 0,36 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,97 0,00 0,00 0,00 0,23 0,00 0,00 0,77 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,53 0,17 0,00 0,30 0,00 0,00 0,45 0,20 0,00 0,35 0,00 0,00 0,52 0,40 0,00 0,08 0,00 0,00 0,40 0,10 0,00 0,50 0,00 0,00 0,16 0,84 0,00 0,00 0,00 0,00 0,70 0,09 0,00 0,22 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,94 0,00 0,00 0,35 0,12 0,00 0,53 0,00 0,00 0,20 0,06 0,00 0,74 0,00 0,00 0,28 0,02 0,00 0,70 0,00 0,00 0,26 0,01 0,00 0,73 0,00 0,00 0,25 0,03 0,00 0,72 0,00 0,00 0,26 0,05 0,00 0,69 0,00 0,00 0,20 0,10 0,00 0,70 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,02 0,00 0,98 0,00 0,00 0,00 0,88 0,00 0,10 0,00 0,02 0,10 0,30 0,00 0,35 0,25 0,00 0,10 0,16 0,00 0,74 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,02 0,00 0,98 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,06 0,94 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,90 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00 0,95 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Tab. 7 (continua) LOCUS PepB1 98 100 105 PepB2 100 104 PepB3 92 95 100 102 Ald 94 100 Ca 98 100 108 Gpi 100 103 Alat 90 100 108 110 1 2 3 4 5 6 7 8,9,10 11 12,13 14,15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,06 0,94 0,00 0,00 1,00 0,00 0,02 0,98 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,17 0,83 0,00 0,08 0,92 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,50 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,93 0,07 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,02 0,98 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,54 0,46 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 Tab. 7 (continua) LOCUS G3pdh 94 100 104 106 Ldh 92 95 100 Mdh-1 100 125 127 Idh-1 93 100 6Pgdh 96 100 103 Odh 85 100 106 108 Gapdh 100 110 Xdh 100 110 Nadh-dh 100 102 104 107 Sod-2 92 100 106 110 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 59 60 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,98 0,02 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,98 0,02 0,00 0,00 1,00 0,00 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0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,96 0,05 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,92 0,08 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,83 0,00 0,00 0,17 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,96 0,05 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,02 0,98 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,02 0,98 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 Tab. 7 (continua) LOCUS Aat-1 100 104 Aat-2 88 92 95 98 100 102 104 110 Pgk 94 98 99 100 105 107 Pgm-1 97 100 105 Pgm-2 92 96 100 Est-1 95 100 Est-2 92 93 100 103 PepC 86 88 90 96 100 104 112 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 59 60 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,06 0,94 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,06 0,94 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,97 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,08 0,92 0,00 0,00 0,00 0,92 0,00 0,00 0,08 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,84 0,16 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,27 0,00 0,00 0,73 0,00 0,00 0,00 0,00 0,26 0,00 0,00 0,72 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,95 0,05 0,00 0,00 0,00 0,10 0,00 0,00 0,90 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00 0,00 0,94 0,02 0,00 0,00 0,00 0,29 0,00 0,00 0,71 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,35 0,00 0,00 0,65 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,21 0,00 0,00 0,00 0,71 0,00 0,07 0,00 0,39 0,00 0,00 0,00 0,46 0,00 0,14 0,00 0,97 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,12 0,00 0,89 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,00 0,68 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 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45 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 59 60 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,02 0,98 0,00 0,02 0,98 0,00 0,46 0,54 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,82 0,18 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,82 0,18 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 Tab. 7.(continua) LOCUS G3pdh 94 100 104 106 Ldh 92 95 100 Mdh-1 100 125 127 Idh-1 93 100 6Pgdh 96 100 103 Odh 85 100 106 108 Gapdh 100 110 Xdh 100 110 Nadh-dh 100 102 104 107 Sod-2 92 100 106 110 61 62 63 64 65 66 67 69 70 73 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,99 0,01 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,03 0,00 0,97 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,33 0,67 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,93 0,00 0,07 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,75 0,00 0,25 0,00 0,08 0,00 0,92 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,93 0,00 0,00 0,07 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,08 0,92 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 Tab. 7 (continua) LOCUS Aat-1 100 104 Aat-2 88 92 95 98 100 102 104 110 Pgk 94 98 99 100 105 107 Pgm-1 97 100 105 Pgm-2 92 96 100 Est-1 95 100 Est-2 92 93 100 103 PepC 86 88 90 96 100 104 112 61 62 63 64 65 66 67 69 70 73 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,31 0,00 0,00 0,00 0,69 0,00 0,00 0,09 0,91 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,53 0,00 0,00 0,47 0,00 0,00 0,00 0,00 0,36 0,00 0,00 0,43 0,21 0,00 0,00 0,00 0,72 0,00 0,00 0,28 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,18 0,82 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,94 0,03 0,00 0,97 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,58 0,00 0,42 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,69 0,31 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,75 0,00 0,00 0,25 0,00 0,00 0,00 Tab. 7(continua) LOCUS PepB1 98 100 105 PepB2 100 104 PepB3 92 95 100 102 Ald 94 100 Ca 98 100 108 Gpi 100 103 Alat 90 100 108 110 61 62 63 64 65 66 67 69 70 73 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,03 0,97 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,94 0,00 0,06 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,96 0,05 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 Mdh-1 100 125 Fig. 4. Variazione geografica al locus Mdh-1 in A. italicus Odh 100 108 Fig. 5. Variazione geografica al locus Odh in A. italicus Sod-2 100 106 Fig. 6. Variazione geografica al locus Sod-2 in A. italicus Aat-2 88 92 95 100 102 110 Fig.7. Variazione geografica al locus Aat-2 in A. italicus Pgk 94 98 100 105 Fig. 8. Variazione geografica al locus Pgk in A. italicus Pep-C 90 100 104 112 Fig. 9. Variazione geografica al locus PepC in A. italicus PepB-1 100 105 Fig. 10. Variazione geografica al locus PepB-1 in A. italicus PepB3 92 96 100 Fig.11. Variazione geografica al locus PepB3 in A. italicus 59 A. pallipes 100 51 A. italicus 91 A. torrentium 0.1 66-69 6 28 1 2 26 27 8-16 17 18 29 31 63 3 4 5 32 54 33 34 35, 36 47 7 30 43 66 50 53 49 57 45 44 40 41 39 42 62 64 65 22 20 52 19 38 21 24 55 25 63 23 100 60 59 61 70, 71, 72, 74 73, 75 Fig. 12. Dendrogramma UPGMA sulla base dei valori di distanza genetica di Nei (1972) che mostra le relazioni di affinit genetica in campioni di Austropotamobius italicus (1-65), di A. pallipes (66-69) e di A. torrentium (7075). I numeri sui nodi indicano i valori di bootstrap superiori a 50% (su 100 repliche). Per i codici dei campioni, vedi Tab. 3. 60 A. torrentium 70, 71, 72, 74 73, 75 A. pallipes 66-69 65 19 20 21 22 24 38 25 63 62 64 100 75 A. italicus 53 50 30 43 7 49 45 47 40 57 44 41, 48, 51, 54, 56 39 42 8-16 27 26 28 6 1 2 3 4 5 17 69 18 29 31 32 36 33 34-35 61 23 59 60 Fig. 13. Dendrogramma costruito col metodo Neighbor Joining sulla base dei valori di distanza della corda (Cavalli-Sforza e Edwards, 1967) che mostra le relazioni di affinit genetica in campioni di Austropotamobius italicus (1-65), A. pallipes (6669) e A. torrentium(70-75). I numeri sui nodi indicano i valoridi bootstrap superiori a 50% (su 100 repliche). Per i codici dei campioni, vedi Tab. 3. Tab. 8. Matrice dei valori di distanza genetica tra le popolazioni: la distanza genetica di Cavalli-Sforza (1967) è riportata sopra la diagonale; la distanza di Nei (1972) è riportata sotto la diagonale. Popolazioni 1 1 REDIPOLLOS (E) 2 OROZCO (E) 3 RONCESVALLES (E) 4 STA PAU (E) 5 BECEITE (E) 6 ARROYO (E) 7 LAS ILLAS (F) 8-16 C. TICINO (CH) 17 B. TICINO 18 TRECATE 19 V. IMAGNA 20 BELLUNO 21 AVASINIS 22 VEDRONZA 23 CLODIG 24 STERPO 25 ROSANDRA 26 R. TANARO 27 SAGLIANO 28 CASALI 29 PIANDOLO 30 VISONE 31 OTTONE 32 NIRANO 36 FERRANO 38 GUBBIO 41 FARNESE 40 ACQUAPEND. 47 ORIOLO 43 BORBONA 44 B. VELINO 49 LICENZA 42 CASTELLANO 39 BISIGNANO 48 VALDEVARRI 50 T TAGLIACOZZO 53 ROCCARASO 54 POLLA 55 PATERNO 57 FOCE 62 ODOLINA (SLO) 63 BUZET (HR) 64 RECINA (HR) 65 DONJE P. (HR) -0.001 0.010 0.025 0.034 0.017 0.116 0.018 0.017 0.018 0.088 0.114 0.103 0.103 0.151 0.096 0.082 0.010 0.017 0.010 0.029 0.138 0.029 0.049 0.067 0.113 0.141 0.144 0.150 0.135 0.137 0.138 0.126 0.130 0.144 0.137 0.136 0.144 0.144 0.145 0.121 0.078 0.102 0.131 0.033 -0.007 0.022 0.030 0.020 0.114 0.018 0.017 0.018 0.085 0.111 0.101 0.100 0.149 0.094 0.078 0.009 0.016 0.015 0.027 0.136 0.027 0.045 0.064 0.110 0.138 0.141 0.147 0.133 0.135 0.135 0.123 0.127 0.141 0.135 0.134 0.141 0.141 0.143 0.116 0.074 0.098 0.129 0.096 0.083 -0.005 0.010 0.017 0.111 0.027 0.027 0.027 0.077 0.105 0.095 0.093 0.151 0.087 0.065 0.015 0.024 0.031 0.034 0.129 0.035 0.045 0.071 0.104 0.133 0.135 0.141 0.127 0.129 0.130 0.114 0.122 0.135 0.129 0.127 0.135 0.135 0.136 0.102 0.060 0.087 0.122 0.133 0.123 0.048 -0.005 0.013 0.112 0.038 0.039 0.039 0.075 0.102 0.092 0.090 0.156 0.085 0.065 0.028 0.036 0.043 0.045 0.127 0.046 0.059 0.082 0.101 0.131 0.132 0.139 0.124 0.127 0.127 0.112 0.122 0.132 0.126 0.125 0.132 0.132 0.134 0.103 0.061 0.091 0.120 0.142 0.139 0.073 0.061 -0.024 0.133 0.059 0.060 0.060 0.093 0.123 0.112 0.110 0.179 0.105 0.077 0.046 0.057 0.061 0.067 0.148 0.068 0.073 0.105 0.122 0.152 0.154 0.160 0.145 0.148 0.148 0.131 0.142 0.154 0.147 0.146 0.154 0.154 0.155 0.114 0.072 0.103 0.141 0.127 0.123 0.097 0.088 0.121 -0.103 0.022 0.023 0.023 0.077 0.095 0.085 0.088 0.145 0.078 0.084 0.023 0.025 0.016 0.034 0.119 0.034 0.074 0.070 0.094 0.123 0.125 0.131 0.117 0.120 0.119 0.115 0.117 0.125 0.119 0.117 0.125 0.125 0.126 0.125 0.083 0.112 0.113 0.299 0.290 0.296 0.297 0.324 0.283 -0.085 0.087 0.087 0.057 0.065 0.055 0.048 0.121 0.034 0.069 0.096 0.087 0.117 0.085 0.002 0.085 0.157 0.119 0.029 0.003 0.004 0.008 0.001 0.003 0.003 0.006 0.003 0.004 0.002 0.002 0.004 0.004 0.004 0.063 0.076 0.041 0.075 0.149 0.137 0.164 0.178 0.221 0.137 0.244 -0.000 0.000 0.070 0.082 0.072 0.076 0.118 0.065 0.091 0.006 0.000 0.020 0.003 0.104 0.002 0.063 0.038 0.080 0.106 0.109 0.114 0.101 0.103 0.105 0.107 0.101 0.109 0.103 0.102 0.109 0.109 0.110 0.135 0.092 0.116 0.098 60 IDRIJA (SLO) 61 CEHOVINI (SLO) 59 BREGINJ (SLO) 0.155 0.143 0.148 0.153 0.141 0.145 0.154 0.145 0.150 0.158 0.153 0.158 0.181 0.176 0.182 0.148 0.141 0.147 0.123 0.119 0.125 67 HERAULT (F) 0.299 0.294 0.279 0.279 0.292 0.306 70 TARVISIO 73 LOKVE (HR) 0.701 0.639 0.699 0.638 0.694 0.632 0.696 0.634 0.698 0.636 0.695 0.634 2 3 4 5 6 7 8 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 0.146 0.134 0.162 0.177 0.220 0.135 0.252 0.024 -0.000 0.072 0.083 0.073 0.079 0.119 0.067 0.093 0.006 0.000 0.019 0.003 0.107 0.002 0.063 0.038 0.082 0.109 0.113 0.118 0.104 0.106 0.108 0.109 0.104 0.113 0.106 0.105 0.113 0.113 0.114 0.136 0.094 0.118 0.100 0.147 0.135 0.162 0.177 0.220 0.136 0.252 0.024 0.002 -0.072 0.083 0.073 0.078 0.119 0.067 0.093 0.006 0.000 0.020 0.003 0.106 0.002 0.063 0.038 0.082 0.109 0.112 0.117 0.103 0.106 0.108 0.109 0.103 0.112 0.106 0.104 0.112 0.112 0.113 0.137 0.094 0.118 0.100 0.278 0.267 0.261 0.257 0.282 0.267 0.225 0.252 0.252 0.252 -0.016 0.008 0.035 0.089 0.009 0.023 0.073 0.070 0.097 0.072 0.058 0.072 0.122 0.108 0.015 0.070 0.072 0.074 0.056 0.070 0.068 0.055 0.067 0.072 0.056 0.053 0.072 0.072 0.072 0.066 0.027 0.070 0.040 0.309 0.299 0.297 0.292 0.318 0.285 0.234 0.259 0.259 0.259 0.146 -0.008 0.042 0.092 0.012 0.045 0.092 0.083 0.117 0.080 0.065 0.080 0.154 0.116 0.016 0.078 0.080 0.085 0.063 0.079 0.077 0.069 0.078 0.080 0.062 0.059 0.080 0.080 0.081 0.093 0.051 0.101 0.040 0.299 0.288 0.286 0.281 0.308 0.274 0.212 0.247 0.247 0.247 0.112 0.097 -0.033 0.082 0.004 0.036 0.082 0.073 0.107 0.071 0.055 0.070 0.143 0.106 0.008 0.067 0.069 0.074 0.053 0.068 0.066 0.058 0.067 0.069 0.052 0.049 0.069 0.069 0.070 0.083 0.043 0.090 0.032 0.299 0.287 0.283 0.279 0.304 0.283 0.211 0.254 0.264 0.264 0.183 0.186 0.170 -0.081 0.022 0.041 0.084 0.078 0.107 0.076 0.046 0.077 0.118 0.091 0.039 0.046 0.047 0.052 0.046 0.047 0.047 0.042 0.041 0.047 0.047 0.047 0.047 0.047 0.047 0.110 0.040 0.085 0.051 0.345 0.336 0.341 0.345 0.369 0.335 0.306 0.302 0.301 0.301 0.274 0.263 0.252 0.269 -0.081 0.116 0.129 0.119 0.155 0.117 0.127 0.116 0.152 0.115 0.092 0.134 0.136 0.142 0.124 0.134 0.135 0.125 0.124 0.136 0.125 0.123 0.136 0.136 0.136 0.176 0.120 0.165 0.113 0.298 0.287 0.284 0.279 0.306 0.276 0.170 0.247 0.252 0.252 0.116 0.129 0.084 0.142 0.263 -0.032 0.076 0.067 0.100 0.064 0.034 0.064 0.135 0.099 0.006 0.042 0.044 0.048 0.069 0.043 0.042 0.038 0.042 0.044 0.032 0.030 0.044 0.044 0.044 0.074 0.038 0.071 0.032 0.276 0.269 0.262 0.260 0.274 0.284 0.227 0.281 0.287 0.287 0.156 0.195 0.177 0.167 0.301 0.154 -0.078 0.089 0.100 0.097 0.070 0.098 0.104 0.135 0.041 0.077 0.078 0.084 0.113 0.078 0.076 0.053 0.070 0.078 0.068 0.067 0.078 0.078 0.079 0.048 0.004 0.038 0.043 0.124 0.108 0.130 0.152 0.191 0.148 0.269 0.099 0.096 0.096 0.248 0.273 0.262 0.266 0.314 0.262 0.265 -0.005 0.019 0.010 0.116 0.010 0.047 0.046 0.091 0.119 0.122 0.127 0.103 0.115 0.117 0.110 0.110 0.122 0.115 0.114 0.122 0.122 0.123 0.119 0.077 0.100 0.109 0.136 0.118 0.142 0.160 0.205 0.138 0.255 0.054 0.049 0.048 0.244 0.261 0.249 0.259 0.303 0.251 0.273 0.077 -0.022 0.002 0.106 0.002 0.059 0.038 0.082 0.109 0.112 0.117 0.137 0.106 0.108 0.108 0.103 0.112 0.106 0.104 0.112 0.112 0.113 0.132 0.089 0.114 0.100 0.122 0.111 0.116 0.123 0.111 0.116 0.123 0.111 0.116 0.090 0.090 0.099 0.092 0.093 0.102 0.083 0.083 0.093 0.083 0.081 0.087 0.000 0.001 0.001 0.082 0.081 0.089 0.117 0.117 0.125 0.133 0.121 0.126 0.123 0.111 0.116 0.308 0.315 0.316 0.316 0.299 0.293 0.322 0.321 0.410 0.308 0.260 0.296 0.306 0.775 0.709 0.708 0.647 0.710 0.648 0.710 0.648 0.720 0.657 0.708 0.646 0.718 0.656 0.698 0.636 0.703 0.642 0.708 0.645 0.700 0.638 0.704 0.642 0.707 0.646 Tab. 8 (continua) Popolazioni 28 29 30 31 32 36 38 41 40 47 43 44 49 42 39 48 50 53 54 1 REDIPOLLOS (E) 2 OROZCO (E) 3 RONCESVALLES (E) 4 STA PAU (E) 5 BECEITE (E) 6 ARROYO (E) 7 LAS ILLAS (F) 8-16 C. TICINO (CH) 17 B. TICINO 18 TRECATE 19 V. IMAGNA 20 BELLUNO 21 AVASINIS 22 VEDRONZA 23 CLODIG 24 STERPO 25 ROSANDRA 26 R. TANARO 27 SAGLIANO 28 CASALI 29 PIANDO 30 VISONE 31 OTTONE 32 NIRANO 36 FERRANO 38 GUBBIO 41 FARNESE 40 ACQUAPEND. 47 ORIOLO 43 BORBONA 44 B. VELINO 49 LICENZA 42 CASTELLANO 39 BISIGNANO 48 VALDEVARRI 50 TAGLIACOZZO 53 ROCCARASO 54 POLLA 55 PATERNO 57 FOCE 62 ODOLINA (SLO) 63 BUZET (HR) 64 RECINA (HR) 65 DONJE P. (HR) 60 IDRIJA (SLO) 61 CEHOVINI (SLO) 59 BREGINJ (SLO) 0.109 0.125 0.167 0.185 0.208 0.136 0.282 0.118 0.119 0.121 0.289 0.302 0.292 0.295 0.339 0.291 0.294 0.140 0.135 -0.035 0.140 0.035 0.071 0.072 0.116 0.142 0.145 0.151 0.137 0.139 0.138 0.134 0.134 0.145 0.139 0.138 0.145 0.145 0.147 0.142 0.098 0.123 0.134 0.159 0.147 0.148 0.179 0.160 0.172 0.187 0.229 0.173 0.250 0.080 0.083 0.082 0.246 0.257 0.244 0.251 0.300 0.244 0.277 0.109 0.079 0.174 -0.103 0.001 0.069 0.036 0.079 0.106 0.109 0.114 0.100 0.102 0.105 0.108 0.101 0.109 0.102 0.101 0.109 0.109 0.109 0.142 0.099 0.124 0.097 0.121 0.109 0.152 0.341 0.332 0.331 0.326 0.349 0.320 0.079 0.288 0.297 0.297 0.220 0.224 0.201 0.198 0.315 0.155 0.216 0.309 0.296 0.328 0.288 -0.103 0.177 0.136 0.028 0.002 0.002 0.006 0.000 0.002 0.002 0.005 0.003 0.002 0.000 0.001 0.002 0.002 0.002 0.067 0.076 0.046 0.074 0.128 0.126 0.114 0.179 0.161 0.175 0.189 0.232 0.168 0.251 0.066 0.063 0.061 0.246 0.252 0.239 0.257 0.295 0.244 0.285 0.107 0.068 0.169 0.055 0.290 -0.069 0.035 0.079 0.106 0.109 0.114 0.100 0.103 0.105 0.109 0.101 0.109 0.103 0.101 0.109 0.109 0.110 0.143 0.101 0.125 0.096 0.119 0.108 0.133 0.206 0.199 0.204 0.220 0.239 0.244 0.329 0.227 0.229 0.229 0.304 0.338 0.329 0.301 0.332 0.321 0.293 0.197 0.210 0.236 0.222 0.359 0.227 -0.033 0.153 0.179 0.182 0.189 0.174 0.176 0.177 0.151 0.159 0.182 0.177 0.175 0.182 0.182 0.184 0.142 0.098 0.123 0.171 0.156 0.145 0.113 0.248 0.235 0.245 0.254 0.287 0.239 0.286 0.179 0.182 0.182 0.296 0.302 0.291 0.282 0.296 0.288 0.322 0.202 0.184 0.237 0.176 0.319 0.171 0.152 -0.114 0.139 0.142 0.147 0.134 0.135 0.138 0.136 0.128 0.142 0.136 0.135 0.142 0.142 0.143 0.181 0.136 0.161 0.132 0.118 0.108 0.150 0.313 0.303 0.301 0.296 0.322 0.289 0.158 0.260 0.264 0.264 0.142 0.136 0.102 0.174 0.269 0.088 0.175 0.278 0.265 0.303 0.259 0.141 0.256 0.338 0.298 -0.040 0.041 0.046 0.027 0.040 0.039 0.032 0.039 0.041 0.026 0.023 0.041 0.041 0.042 0.060 0.050 0.063 0.039 0.093 0.093 0.112 0.332 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-0.002 0.002 0.005 0.003 0.003 0.000 0.000 0.003 0.003 0.003 0.065 0.075 0.045 0.073 0.126 0.124 0.147 0.323 0.313 0.313 0.311 0.336 0.303 0.070 0.265 0.275 0.275 0.244 0.253 0.232 0.206 0.322 0.183 0.237 0.289 0.277 0.307 0.265 0.072 0.268 0.341 0.298 0.179 0.025 0.036 0.086 0.068 -0.000 0.007 0.002 0.000 0.003 0.004 0.000 0.000 0.000 0.079 0.082 0.050 0.083 0.136 0.133 0.130 0.324 0.316 0.317 0.314 0.339 0.303 0.071 0.271 0.281 0.280 0.237 0.245 0.224 0.206 0.322 0.177 0.231 0.295 0.283 0.307 0.275 0.069 0.279 0.349 0.308 0.170 0.061 0.062 0.101 0.063 0.057 -0.006 0.002 0.001 0.003 0.004 0.001 0.001 0.001 0.076 0.080 0.048 0.082 0.136 0.133 0.138 0.330 0.320 0.316 0.312 0.332 0.320 0.118 0.301 0.309 0.308 0.213 0.239 0.217 0.178 0.322 0.169 0.189 0.305 0.301 0.332 0.297 0.093 0.303 0.339 0.327 0.164 0.113 0.111 0.138 0.096 0.116 0.113 -0.003 0.007 0.005 0.005 0.007 0.007 0.008 0.047 0.057 0.027 0.079 0.127 0.125 0.139 0.318 0.308 0.308 0.309 0.333 0.309 0.096 0.275 0.284 0.284 0.243 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0.061 0.074 0.044 0.070 0.124 0.123 0.132 0.341 0.331 0.330 0.325 0.349 0.319 0.091 0.286 0.296 0.296 0.245 0.252 0.231 0.203 0.327 0.181 0.234 0.309 0.298 0.326 0.286 0.063 0.290 0.358 0.317 0.177 0.025 0.000 0.083 0.071 0.036 0.062 0.111 0.081 0.000 0.075 0.074 -0.000 0.000 0.081 0.083 0.051 0.084 0.138 0.135 0.130 67 HERAULT (F) 0.321 0.315 0.314 0.323 0.321 0.369 0.314 0.321 0.323 0.316 0.315 0.320 0.320 0.297 0.313 0.323 0.317 0.315 0.323 70 TARVISIO 73 LOKVE (HR) 0.715 0.653 0.710 0.648 0.783 0.717 0.716 0.655 0.713 0.652 0.715 0.653 0.733 0.670 0.789 0.722 0.790 0.724 0.813 0.744 0.781 0.715 0.787 0.721 0.781 0.722 0.769 0.703 0.777 0.711 0.790 0.724 0.787 0.720 0.782 0.716 0.790 0.724 Tabella 8 (continua) Popolazioni 55 57 62 63 64 65 60 61 59 48 49 50 1 REDIPOLLOS (E) 2 OROZCO (E) 3 RONCESVALLES (E) 4 STA PAU (E) 5 BECEITE (E) 6 ARROYO (E) 7 LAS ILLAS (F) 8-16 C. TICINO (CH) 17 B. TICINO 18 TRECATE 19 V. IMAGNA 20 BELLUNO 21 AVASINIS 22 VEDRONZA 23 CLODIG 24 STERPO 25 ROSANDRA 26 R. TANARO 27 SAGLIANO 28 CASALI 29 IGGIO 30 GROGNARDO 31 OTTONE 32 NIRANO 36 FERRANO 38 GUBBIO 41 FARNESE 40 ACQUAPEND. 47 ORIOLO 43 BORBONA 44 B. VELINO 49 LICENZA 42 V. CASTELLANA 39 BISIGNANO 48 VALDEVARRI 50 TAGLIACOZZO 53 ROCCARASO 54 POLLA 55 PATERNO 57 FOCE 62 ODOLINA (SLO) 63 BUZET (HR) 64 RIJEKA (HR) 65 DONJE P. (HR) 60 IDRIJA (SLO) 61 CEHOVINI (SLO) 59 BREGINJ (SLO) 67 HERAULT (F) 70 TARVISIO 73 LOKVE (HR) 0.341 0.331 0.330 0.325 0.349 0.319 0.091 0.286 0.296 0.296 0.245 0.252 0.231 0.203 0.327 0.181 0.234 0.309 0.298 0.326 0.286 0.063 0.290 0.358 0.317 0.177 0.025 0.000 0.083 0.071 0.036 0.062 0.111 0.081 0.000 0.075 0.074 0.000 -0.000 0.081 0.083 0.051 0.084 0.138 0.135 0.148 0.323 0.790 0.724 0.344 0.335 0.333 0.328 0.352 0.322 0.102 0.290 0.300 0.300 0.250 0.256 0.235 0.208 0.330 0.187 0.239 0.312 0.301 0.329 0.289 0.078 0.293 0.361 0.320 0.183 0.053 0.046 0.095 0.073 0.058 0.070 0.120 0.093 0.046 0.088 0.087 0.046 0.046 -0.082 0.084 0.052 0.085 0.138 0.135 0.141 0.321 0.784 0.718 0.322 0.319 0.313 0.312 0.320 0.336 0.244 0.344 0.344 0.344 0.230 0.278 0.257 0.290 0.363 0.240 0.204 0.321 0.331 0.344 0.341 0.238 0.344 0.344 0.377 0.234 0.262 0.262 0.275 0.236 0.263 0.255 0.206 0.249 0.262 0.236 0.230 0.262 0.262 0.265 -0.054 0.021 0.114 0.177 0.177 0.141 0.270 0.793 0.725 0.263 0.260 0.253 0.252 0.261 0.280 0.250 0.283 0.290 0.290 0.169 0.207 0.193 0.168 0.307 0.174 0.087 0.262 0.275 0.283 0.281 0.240 0.290 0.282 0.327 0.202 0.255 0.254 0.268 0.241 0.257 0.252 0.211 0.244 0.254 0.241 0.237 0.254 0.254 0.259 0.222 -0.044 0.068 0.121 0.120 0.187 0.268 0.708 0.646 0.299 0.296 0.294 0.299 0.309 0.321 0.199 0.317 0.322 0.322 0.249 0.290 0.273 0.261 0.353 0.238 0.176 0.297 0.309 0.317 0.314 0.205 0.322 0.316 0.351 0.229 0.212 0.217 0.229 0.201 0.213 0.212 0.169 0.192 0.217 0.205 0.202 0.217 0.217 0.222 0.172 0.202 -0.097 0.167 0.163 0.128 0.251 0.762 0.696 0.329 0.320 0.318 0.313 0.338 0.307 0.230 0.277 0.283 0.283 0.192 0.178 0.160 0.189 0.291 0.156 0.162 0.296 0.284 0.318 0.276 0.218 0.276 0.351 0.316 0.167 0.238 0.238 0.252 0.218 0.240 0.234 0.233 0.249 0.238 0.217 0.213 0.238 0.238 0.242 0.286 0.221 0.262 -0.114 0.113 0.171 0.312 0.708 0.646 0.353 0.345 0.349 0.352 0.376 0.343 0.314 0.311 0.311 0.311 0.281 0.272 0.261 0.277 0.022 0.271 0.308 0.323 0.312 0.348 0.309 0.322 0.305 0.341 0.306 0.277 0.328 0.334 0.341 0.318 0.329 0.330 0.329 0.325 0.334 0.322 0.318 0.334 0.334 0.337 0.369 0.315 0.361 0.299 -0.002 0.122 0.412 0.706 0.644 0.336 0.326 0.332 0.338 0.363 0.327 0.299 0.291 0.291 0.290 0.270 0.260 0.249 0.268 0.044 0.259 0.297 0.303 0.292 0.330 0.289 0.311 0.284 0.323 0.286 0.266 0.314 0.322 0.328 0.033 0.315 0.317 0.318 0.310 0.322 0.311 0.307 0.322 0.322 0.325 0.360 0.304 0.348 0.288 0.060 -0.002 0.408 0.700 0.639 0.347 0.338 0.344 0.349 0.374 0.339 0.313 0.304 0.304 0.303 0.289 0.280 0.269 0.282 0.032 0.278 0.314 0.316 0.305 0.341 0.302 0.326 0.297 0.334 0.299 0.285 0.327 0.334 0.340 0.320 0.328 0.330 0.333 0.323 0.334 0.326 0.323 0.334 0.334 0.337 0.375 0.320 0.361 0.305 0.030 0.048 -0.415 0.709 0.647 0.457 0.455 0.451 0.451 0.456 0.467 0.473 0.473 0.473 0.473 0.458 0.452 0.474 0.470 0.524 0.470 0.444 0.456 0.456 0.473 0.468 0.467 0.473 0.473 0.502 0.475 0.473 0.473 0.474 0.473 0.473 0.475 0.460 0.466 0.473 0.474 0.473 0.473 0.473 0.474 0.448 0.442 0.443 0.473 0.529 0.521 0.529 -0.870 0.798 0.643 0.643 0.643 0.643 0.643 0.643 0.664 0.643 0.643 0.643 0.648 0.643 0.644 0.643 0.639 0.640 0.644 0.643 0.643 0.643 0.643 0.664 0.643 0.643 0.643 0.649 0.664 0.664 0.669 0.661 0.664 0.662 0.664 0.664 0.664 0.665 0.664 0.664 0.664 0.659 0.666 0.643 0.664 0.643 0.643 0.637 0.643 0.685 -0.148 0.626 0.626 0.626 0.626 0.626 0.626 0.648 0.626 0.626 0.626 0.631 0.626 0.627 0.626 0.622 0.623 0.627 0.626 0.626 0.626 0.626 0.648 0.626 0.626 0.626 0.632 0.648 0.648 0.653 0.645 0.648 0.647 0.648 0.648 0.648 0.649 0.648 0.648 0.648 0.643 0.650 0.626 0.648 0.627 0.626 0.620 0.626 0.669 0.334 -- 64 Tab. 9. Variabilità genetica delle 87 popolazioni studiate. A = numero medio di alleli per locus; P = percentuale di loci polimorfici con i criteri del P99 e del P95; Ho = eterozigosi media osservata; He = eterozigosi media attesa. Per i codici dei campioni, vedi Tab 2. Tra parentesi sono indicati i valori di deviazione standard. POPOLAZIONE A.italicus 1. Redipollos 2. Orozco 3. Roncesvalles 4. Sta Pau 5. Beceite 6. Arroyo 7. Las Illas 8-10. Canton Ticino 12-15. Val d’Ossola 16. Casalzuigno 17. B. Ticino 18. Trecate 19. Valle Imagna 20. S. Gregorio A. 21. Avasinis 22. Vedronza 23. Clodig 24. Sterpo 25. Bottazzo 26. R. Tanaro 27. Sagliano 28. Casali 29. Piandolo A 1.1 (0.0) 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 1.2 (0.1) 1.2 (0.1) 1.1 (0.0) 1.1 (0.0) 1.1 (0.0) 1.0 (0.0) 1.0 (0.0) 1.2 (0.1) 1.0 (0.0) 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 1.2 (0.1) 1.2 (0.1) 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 1.0 (0.0) 1.1 (0.1) P99 P95 Ho He 6.9 6.9 6.9 6.9 10.3 10.3 10.3 10.3 10.3 10.3 13.8 10.3 13.8 10.3 6.9 3.4 6.9 3.4 6.9 3.4 3.4 3.4 3.4 3.4 24.1 17.2 3.4 3.4 10.3 6.9 10.3 10.3 6.9 3.4 13.8 10.3 13.8 13.8 3.4 3.4 6.9 6.9 3.4 0.0 10.3 3.4 0.034 (0.024) 0.034 (0.024) 0.030 (0.018) 0.035 (0.022) 0.038 (0.021) 0.052 (0.028) 0.025 (0.015) 0.016 (0.014) 0.016 (0.014) 0.016 (0.014) 0.015 (0.015) 0.017 (0.017) 0.048 (0.023) 0.020 (0.020) 0.010 (0.006) 0.027 (0.015) 0.018 (0.016) 0.034 (0.020) 0.048 (0.026) 0.021 (0.021) 0.020 (0.017) 0.003 (0.003) 0.012 (0.009) 0.033 (0.023) 0.034 (0.024) 0.046 (0.026) 0.042 (0.024) 0.037 (0.021) 0.045 (0.025) 0.031 (0.020) 0.016 (0.013) 0.016 (0.013) 0.016 (0.013) 0.014 (0.014) 0.014 (0.014) 0.049 (0.023) 0.018 (0.018) 0.010 (0.006) 0.039 (0.023) 0.022 (0.020) 0.034 (0.021) 0.044 (0.023) 0.026 (0.026) 0.018 (0.015) 0.003 (0.003) 0.013 (0.009) (continua) 65 Tab. 9 (continua) POPOLAZIONE 30. Grognardo 31. Ottone 32. Nirano 34. Badia di Moscheta 35. Ronta 36. Ferrano 37. Papiano di Stia 38. Gubbio 39. Bisignano 40. Acquapendente 41. Farnese 42. Valle Castellana 43. Borbona 44. Borgo Velino 45. Campotosto 46. Oriolo R. 48. Valdevarri 49. Licenza 50. Tagliacozzo 53. Roccaraso 54. Polla 55. Paterno 56. Pantano 57. Foce A P99 P95 Ho He 1.1 (0.0) 1.0 (0.0) 1.1 (0.0) 1.1 (0.0) 1.1 (0.0) 1.1 (0.0) 1.1 (0.0) 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 1.0 (0.0) 1.0 (0.0) 1.1 (0.1) 1.2 (0.1) 1.1 (0.0) 1.1 (0.0) 1.1 (0.1) 1.0 (0.0) 1.2 (0.1) 1.1 (0.0) 1.0 (0.0) 1.0 (0.0) 1.0 (0.0) 1.0 (0.0) 1.1 (0.1) 6.9 3.4 0.0 0.0 6.9 3.4 6.9 3.4 6.9 3.4 6.9 3.4 6.9 3.4 10.3 10.3 10.3 10.3 0.0 0.0 3.4 0.0 13.8 10.3 13.8 3.4 6.9 0.0 6.9 0.0 10.3 6.9 0.0 0.0 20.7 6.9 6.9 6.9 3.4 3.4 0.0 0.0 0.0 0.0 3.4 3.4 10.3 3.4 0.016 (0.014) 0.000 (0.000) 0.006 (0.005) 0.004 (0.003) 0.004 (0.003) 0.004 (0.003) 0.004 (0.003) 0.037 (0.023) 0.027 (0.016) 0.000 (0.000) 0.003 (0.003) 0.041 (0.021) 0.017 (0.013) 0.006 (0.004) 0.034 (0.025) 0.022 (0.015) 0.000 (0.000) 0.019 (0.009) 0.020 (0.015) 0.014 (0.014) 0.000 (0.000) 0.000 (0.000) 0.005 (0.000) 0.010 (0.006) 0.015 (0.013) 0.000 (0.000) 0.006 (0.004) 0.006 (0.005) 0.006 (0.005) 0.006 (0.005) 0.006 (0.005) 0.034 (0.021) 0.027 (0.015) 0.000 (0.000) 0.003 (0.003) 0.038 (0.020) 0.018 (0.014) 0.006 (0.004) 0.030 (0.021) 0.023 (0.017) 0.000 (0.000) 0.018 (0.008) 0.020 (0.015) 0.016 (0.016) 0.000 (0.000) 0.000 (0.000) 0.005 (0.000) 0.010 (0.006) (continua) 66 Tab. 9 (continua) POPOLAZIONE 59. Breginj 60. Idrija 61. Cehovini 62. Odolina 42. Buzet 43. Recina 44. Donje Postinje media A P99 P95 Ho He 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 1.1 (0.0) 1.2 (0.1) 1.0 (0.0) 1.2 (0.1) 1.1 (0.1) 3.4 3.4 3.4 3.4 6.9 6.9 17.2 13.8 3.4 3.4 13.8 13.8 10.3 6.9 0.020 (0.020) 0.025 (0.025) 0.027 (0.022) 0.039 (0.021) 0.018 (0.018) 0.040 (0.020) 0.016 (0.012) 0.016 (0.016) 0.022 (0.022) 0.022 (0.017) 0.043 (0.023) 0.018 (0.018) 0.057 (0.030) 0.021 (0.015) 1,1 8,1 5,9 0,021 0,022 1.0 (0.0) 1.0 (0.0) 1.0 (0.0) 0.0 0.0 0.0 0.0 3.4 3.4 0.000 (0.000) 0.000 (0.000) 0.004 (0.004) 0.000 (0.000) 0.000 (0.000) 0.004 (0.004) 1,0 1,3 1,3 0,001 0,001 1.1 (0.1) 1.1 (0.1) 10.3 6.9 10.3 3.4 0.014 (0.008) 0.015 (0.011) 0.018 (0.012) 0.017 (0.013) 10,3 5,1 0,014 0,017 A.pallipes 69. Wenson 71. Herault 80. Castelbianco media A.torrentium 84. Tarvisio 87. Lokve media 1,1 67 3.3 ANALISI GENETICA A LIVELLO MITOCONDRIALE 3.3.1 – Citocromo-ossidasi I E’ stato sequenziato un frammento di 414 paia di basi per la subunita’ I del gene mitocondriale della Citocromo Ossidasi (COI). Sono stati osservati 21 aplotipi diversi, di cui 18 in A. italicus (codificati come COI-A – COIQ), 1 in A. pallipes (COI-R), e 3 in A. torrentium (COI-S – COI-U), per un totale di 83 siti variabili, di cui 70 filogeneticamente informativi e 23 presenti in un solo aplotipo. Il frammento sequenziato comprendeva il 37,1% di T, il 17,2% di C, il 23,3% di A e il 22,% di G. Le sequenze sono mostrate in Tab. 10. Solo cinque delle 83 sostituzioni osservate determinavano un cambiamento aminoacidico, di cui tre osservate solo in A. torrentium, una in A. italicus e una in entrambe le specie. Delle sostituzioni osservate il numero medio di transizioni (calcolato sulla base di tutte le possibili coppie di aplotipi) e’ 12 (di cui solo una in prima posizione) e di transversioni e’ 1 (in terza posizione). Il rapporto transizioni/transversioni osservato e’ di R=16,7 che è un valore relativamente alto. Questa osservazione suggerisce un differenziamento recente delle varie linee evolutive. All’interno della specie A. italicus sono stati trovati 17 aplotipi diversi con 45 posizioni variabili, di cui 37 presenti in almeno due genotipi. La loro distribuzione geografica e’ riportata in Fig. 14. Il numero medio di transizioni e’ 9. Le distanze genetiche calcolate secondo vari metodi con algoritmi di diversa complessita’ danno valori medi molto simili (Jukes-Cantor 0.06 vs. Tamura-Nei 0.058) come atteso nel caso di sequenze poco differenziate. Per questo motivo nella costruzione dell’ albero Neighbor-Joining e’ stato utilizzata la matrice di distanze di Jukes-Cantor i cui valori, data la maggior semplicità dell’algoritmo, hanno una varianza minore. In Tab. 11 è riportata la matrice delle distanze genetiche tra aplotipi calcolata con il metodo di Tamura-Nei (sopra la diagonale) e quello di Jukes-Cantor (sotto la diagonale). 68 Nelle Figg. 15 e 16 sono riportati i dendrogrammi costruiti con i metodi Neighbor Joining (NP) e massima parsimonia (MP) rispettivamente. Da un’analisi degli alberi e’ risultata chiara una separazione netta tra A. torrentium, A. pallipes e A. italicus. Nell’ambito di A. italicus si evidenzia una eterogeneita’, con almeno tre cluster principali evidenziati da entrambi i metodi: il cluster (1) raggruppa gli aplotipi COI-A - COI-C e comprende i campioni provenienti dalla Spagna (#1-3, 5-6, COI-A), dall’Appennino ToscoEmiliano (#32 e 37, COI-A), dall’Italia Nord Occidentale (#12, 16, 26, 31, COI-B; #14, COI-C) e dal Canton Ticino (#8, 9, 11, COI-B); il cluster (2), con gli aplotipi COI-D – COI-F, comprende i campioni del Carso Sloveno (#62, COI-D), di Rijeka (#64, COI-D,COI-E), del Carso triestino (#25,COI-D) e il campione delle Pealpi Orobie (#19, COI-F); il cluster (3), il piu’ eterogeneo geograficamente, comprende almeno tre sottogruppi: (i) i campioni dell’Italia centrale e meridionale (#42, 46, COI-G, #56 COI-H; #38, COI-I), dell’Appennino Ligure (#30 COI-G), dei Pirenei orientali (#7, COI-G) e un campione istriano (#63, COI-J), (ii) i campioni del confine italo-sloveno lungo il bacino dell’Isonzo (#23, 59, 60, COI-K); (iii) i campioni friulani lungo la piana del Tagliamento (#22, COI-N: #24, COI-N e COI-P; #21, COI-O) il campione austriaco (#58, COI-Q) e, piu’ staccati, un campione della Dalmazia (#65, COI-L) e del Carso Sloveno (#61, COI-M). I valori di bootstrap dopo 500 repliche mostrano che i tre gruppi principali hanno valori superiori a 80 (significa che quei nodi sono presenti nell’80% delle repliche) con entrambi i metodi, le relazioni tra i gruppi, invece, cambiano e in particolare il gruppo 2 si lega a 1 con il NJ (Bs 54) e a 3 con la MP (Bs 65). Il risultato discordante tra i due metodi sembra indicare una difficolta’ nel risolvere i rapporti filogenetici tra i tre gruppi. Per quanto riguarda la topologia all’interno dei gruppi, vi e’ una discordanza all’interno del cluster 3, con i campioni del Carso sloveno (#61, COI-M), quelli del bacino dell’Isonzo (#23, 59, 60, COI-K) e quello della Dalmazia (#65, COI-L) che non vengono risolti nell’albero MP. 69 I valori medi di distanza d all’interno dei gruppi, calcolati con la formula di Jukes-Cantor per la COI, mostrano che il gruppo 3 (d 0,0213) e’ piu’ differenziato al suo interno dei gruppi 2 (d 0,0164 o d 0.0024 escludendo VIM) e 1 (d 0,0032), come e’ da attendersi data la maggior eterogeneità geografica dei campioni che lo compongono. Le relazioni di affinita’ tra gli aplotipi osservati in A. italicus sono anche state analizzate mediante un metodo di “parsimonia statistica” (Templeton et al., 1992); i network ottenuti con un limite di confidenza del 95% connettevano aplotipi che differivano per un massimo di 8 mutazioni; sono stati così ottenuti tre cladogrammi distinti, corrispondenti ai tre cluster principali evidenziati sopra, in quanto differivano tra loro per piu’ di 8 step. Il singolo aplotipo delle Prealpi Orobie, che differiva per piu’ posizioni contigue, non e’ stato inserito in nessuno dei network ottenuti. I minimum spanning trees ottenuti per i tre gruppi principali sono mostrati in Fig. 17. Ogni linea rappresenta una singola sostituzione; gli zeri rappresentano aplotipi mancanti. Gli aplotipi terminali sono derivati da quelli piu’ interni. Nell’ambito del gruppo 1, si evidenzia la posizione centrale (cioe’ piu’ ancestrale) dell’aplotipo COI-B (distribuito nei campioni dell’Italia nordoccidentale e del Canton Ticino) rispetto sia all’aplotipo COI-A (osservato in Spagna e in Italia centro-settentrionale), sia l’aplotipo COI-C, osservato in un campione dell’Italia centrosettentrionale (#14). Il gruppo 2 comprende solo due aplotipi COI-D, il piu’ diffuso (Carso Triestino #62, e Sloveno #25, Rijeka, #65), e COI-E (trovato a Rijeka insieme a COI-D), separati da una singola sostituzione; si puo’ considerare derivato l’aplotipo COI-E, trovato in un singolo campione. Il gruppo 3 si conferma eterogeneo. Gli aplotipi piu’ vicini all’ipotetico antenato comune (rappresentato da aplotipi centrali mancanti) sono quelli della Dalmazia (COI-L), del Bacino dell’Isonzo (COI-K) e, relativamente piu’ staccato, un singolo campione del Carso Sloveno (#61 COI-K). Posizioni piu’ esterne (e quindi piu’ derivate) hanno da una parte l’aplotipo osservato nel 70 campione istriano (#63, COI-J) e quelli dell’Italia centro-meridionale, con COI G (#42, 46) centrale rispetto sia a COI-H (#56) che a COI-I (#38); dall’altra il gruppo di aplotipi osservati in campioni della piana del Tagliamento, COI-N – COI-Q, con COI-N (osservato nel campione #22 delle Prealpi Giulie) centrale rispetto a COI-O (#21, 22 ); da quest’ultimo derivano l’aplotipo COI-P (trovato nel campione #22 insieme a COI-O) e l’aplotipo COI-Q, osservato nel campione austriaco. Dato l’elevato costo delle reazioni di sequenza, per poter analizzare un maggior numero di campioni e’ stata condotta un’analisi su un set di 3 enzimi di restrizione, scelti in modo da discriminare i principali aplotipi. In Tab. 12 sono riportate le posizioni di taglio e gli 11 aplotipi evidenziati nell’ambito di A. italicus con questo approccio. La loro distribuzione geografica e’ riportata in Fig. 14, insieme a quelli ottenuti mediante sequenziamento. Alcuni aplotipi di enzimi di restrizione (indicati come RE seguiti da una lettera minuscola) includono piu’ aplotipi di sequenza(indicati come COI); in particolare, l’aplotipo REd non distingue tra COI-D e COI-E; l’aplotipo REg non distingue tra COI-G, COI-H, COI-I, COI-J; l’aplotipo REk include COI-K e COI-M. Tenendo conto di queste limitazioni, si puo’ comunque vedere che REa e’ presente in tutti i campioni analizzati della Spagna e dell’Italia centro-settentrionale, e in alcuni individui del campione di Las Illas, nei Pirenei orientali, dove la maggior parte degli esemplari presentava aplotipo REg. L’aplotipo REb prevale nei campioni del Canton Ticino e in quelli dell’Italia nord-occidentale; in questi ultimi e’ stato osservato anche l’aplotipo REc, coesistente con REb in una stazione (#15). L’aplotipo REd e’ stato osservato anche nel campione delle Prealpi Bellunesi (#20). Tab. 10. Aplotipi osservati per una regione di 414 bp codificante per la citocromo ossidasi I in: Austrapotamobius italicus (A-Q), A. pallipes (R), e A. torrentium (S, T). COI-A COI-B COI-C COI-D COI-E COI-F COI-G COI-H COI-I COI-J COI-K COI-L COI-M COI-N COI-O COI-P COI-Q COI-R COI-S COI-T COI-U ACATGAGATTTTGATTACTTCCGTTTTCTTTAACTCTATTATTAACTAGGGGGTTAGTGGAGAGGGGAGTTGGGACAGGGTGAACTGTCTACCCCCCTTTAGCATCAGCTATTGCTCACGCAGGGGCGTCTGTGGACCTGGGGA .................................................................................................C.............................................. .................................................................................................C.............................................. .............G..G...............................................A..........................T..T.............................T........A.....A.... .............G..G...............................................A..........................T..T.............................T........A.....A.... ................................................................A..........................T..T............................................A.... .............G........A...........C................................G.......................T..T................................A...........A.... .............G........A...........C......C.........................G.......................T..T................................A...........A.... .............G........A...........CT...............................G.......................T..T................................A...........A.... .............G........A............................................G........G..............T..T................................A...........A.... .............G........A............................................G........G.................T............................................A.... .............G........A............................................G.....A..G..............T..T................................................. ..........C..G........A............................................G.....A..G..............T..T............................................A.... ..........C..G........A............................................G.....A..G..............T..T..C.........................................A.... ..........C..G........A............................................G.....A..G..............T..T..C...................................T.....A.... ..........C..G........A............................................G.....A..G..............T..T..C...................................T.....A.... ..........C..G........A............................................G.....A.................T..T..C...................................T.....A.... .T.....G..............A............T.....C.......A..............A..G.....C.....A........T..T..G...C................C....................T....... .......G........G.....A............T.................A....A...........G.....C...........T..T.....CC.G.....T...........T.....A..C.....A...T...... .......G........G.....A............T.................A....A...........G.....C...........T..T.....CC.G.....T...........T.....A..C.....A...T...... .T..A..G..............A............T.................A.G..A...........G..T..C..T...........T.....C........T.................A..C.....A..TT.A.... COI-A COI-B COI-C COI-D COI-E COI-F COI-G COI-H COI-I COI-J COI-K COI-L COI-M COI-N COI-O COI-P COI-Q COI-R COI-S COI-T COI-U TTTTTTCACTTCATTTAGCGGGGGTATCTTCAATTTTAGGGGCGGTAAATTTTATAACTACAGCTATTAATATACGAAGGGTAGGGATAACCTTAGATCGAATACCTCTTTTTGTTTGATCCGTATTTATTACGGCAGTTCTTT ................................................................................................................................................ .............C.................................................................................................................................. ...................A...........................................................A.........................................T...................... ...................A...........................................................A.........................................T...................... ...................A.....................................................G...G...CG......................................T...................... .............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C.... .............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C.... .............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C.... .............C........................................................C...........G..A..G.....G..........................T..............G..C.... .............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C.... .............C........................................................C........A..G.....G...C.G..........................T..............G..C.... ......................................................................C........A..G.....G.....G..........................T..............G..C.... .............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T.................C.... .............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T.................C.... .............C...........G............................................C........A..G.....G.....G..........................T.................C.... .............C........................................................C........A..G.....G.....G..........................T.................C.... .........................T.....................................................A...........T.............................T...........A........C. ....C....................T.....................................G.........G..GG....G..A.....T.................C...........T...........A..G....... ....C..............A.....T...............................................G..GG....G..A.....T.................C...........T...........A..G....... ....C....................T..................................................GG.T..G..A.....T.............................T...........A..G.....C. COI-A COI-B COI-C COI-D COI-E COI-F COI-G COI-H COI-I COI-J COI-K COI-L COI-M COI-N COI-O COI-P COI-Q COI-R COI-S COI-T COI-U TACTTTTGTCTCTACCTGTATTAGCAGGTGCTATTACTATATTATTAACAGATCGTAATTTAAATACTTCATTTTTTGATCCTGCTGGGGGAGGAGACCCGGTTTTATATCAACACTTATTTTGGT .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .......A.................................C..............................................A..G.......................T.......... .......A.................................C..............................................A..G.................C.....T.......... .......A.................................C..............................................A..G.................C.....T.......... .......A.....G.........................................C.............................G.......................C.....T.......... .......A.....G.........................................C.............................G.......................C.....T.......... .......A.....G.........................................C.............................G.......................C.....T.......... .......A...............................................C.............................G.......................C.....T.......... .......A.............................................................................G........G..............C.....T.......... .......A.............................................................................A........G..............C.....T.......... .......A................................................................................A....................C.....T.......... .......A...T.........................................................................A........G..............C.....T.......... .......A...T.........................................................................A........G..............C.....T.......... .......A...T.........................................................................A..T.....G..............C.....T.......... .......A...T.........................................................................A.......................C.....T.......... .......A........C...........G..........................G......................................G.....A..............T.......... .......A..AT....C........G...........C................................G..C..........................AA.......C..G..T.......... .......A..AT....C........G...........C................................G..C..........................AA.......C..G..T.......... .......A..GT.......G...............................................C....................A..G..G..T..TA..C....C.....T.......... CO I DdeI+XspI+AccI a k b l c n d o f p g B A C B A A Q F K N O P M D N A D D,E I G J G G A L G A H A Fig. 14. Distribuzione geografica degli aplotipi osservati mediante enzimi di restrizione (a-p) e mediante sequenziamento (aplotipi COI A-Q). Tabella 11 Matrice delle distanze genetiche tra aplotipi della COI calcolate con il metodo di Tamura-Nei (sopra la diagonale) e JukesCantor (sotto la diagonale) per A. italicus (COI-A – COI-Q), A. pallipes (COI-R) e A. torrentium (COI-S – COI-U) Aplotipi COI-A COI-B COI-C COI-D COI-E COI-F COI-G COI-H COI-I COI-J COI-K COI-L COI-M COI-N COI-O COI-P COI-Q COI-R COI-S COI-T COI-U COI-A - 0.002 0.005 0.040 0.043 0.040 0.059 0.062 0.051 0.062 0.056 0.056 0.054 0.062 0.064 0.070 0.059 0.075 0.121 0.122 0.127 COI-B 0.002 - 0.002 0.043 0.046 0.043 0.062 0.064 0.054 0.064 0.059 0.059 0.057 0.059 0.062 0.067 0.056 0.078 0.118 0.119 0.124 COI-C 0.005 0.002 - 0.046 0.048 0.046 0.059 0.062 0.051 0.062 0.056 0.056 0.059 0.056 0.059 0.064 0.053 0.081 0.121 0.122 0.127 COI-D 0.040 0.042 0.045 - 0.002 0.025 0.059 0.062 0.057 0.062 0.062 0.062 0.049 0.062 0.062 0.064 0.056 0.083 0.131 0.125 0.120 COI-E 0.042 0.045 0.047 0.002 - 0.022 0.057 0.059 0.054 0.059 0.060 0.060 0.046 0.059 0.059 0.062 0.053 0.086 0.128 0.122 0.117 COI-F 0.040 0.042 0.045 0.025 0.022 - 0.060 0.062 0.057 0.062 0.057 0.063 0.049 0.062 0.065 0.067 0.059 0.089 0.121 0.116 0.114 COI-G 0.058 0.060 0.058 0.058 0.055 0.058 - 0.002 0.017 0.002 0.012 0.025 0.025 0.030 0.032 0.038 0.027 0.095 0.140 0.140 0.136 COI-H 0.060 0.063 0.060 0.060 0.058 0.060 0.002 - 0.020 0.005 0.015 0.027 0.027 0.033 0.035 0.040 0.030 0.092 0.143 0.143 0.139 COI-I 0.060 0.063 0.060 0.060 0.058 0.060 0.002 0.005 - 0.020 0.015 0.012 0.017 0.017 0.020 0.025 0.025 0.089 0.137 0.137 0.126 COI-J 0.055 0.058 0.055 0.060 0.058 0.055 0.012 0.015 0.015 - 0.015 0.027 0.027 0.033 0.035 0.040 0.030 0.092 0.137 0.137 0.133 COI-K 0.050 0.053 0.050 0.055 0.053 0.055 0.017 0.020 0.020 0.015 - 0.022 0.022 0.027 0.030 0.035 0.030 0.098 0.127 0.127 0.126 COI-L 0.055 0.058 0.055 0.060 0.058 0.060 0.025 0.027 0.027 0.022 0.012 - 0.017 0.015 0.017 0.022 0.022 0.086 0.137 0.137 0.129 COI-M 0.053 0.055 0.058 0.047 0.045 0.047 0.025 0.027 0.027 0.022 0.017 0.017 - 0.017 0.020 0.022 0.020 0.089 0.134 0.135 0.120 COI-N 0.060 0.058 0.055 0.060 0.058 0.060 0.030 0.032 0.032 0.027 0.017 0.015 0.017 - 0.002 0.007 0.007 0.092 0.137 0.138 0.123 COI-O 0.063 0.060 0.058 0.060 0.058 0.063 0.032 0.035 0.035 0.030 0.020 0.017 0.020 0.002 - 0.005 0.005 0.095 0.137 0.137 0.123 COI-P 0.068 0.066 0.063 0.063 0.060 0.066 0.037 0.040 0.040 0.035 0.025 0.022 0.022 0.007 0.005 - 0.010 0.097 0.140 0.140 0.123 COI-Q 0.058 0.055 0.053 0.055 0.053 0.058 0.027 0.030 0.030 0.030 0.025 0.022 0.020 0.007 0.005 0.010 - 0.095 0.134 0.134 0.126 COI-R 0.074 0.076 0.079 0.082 0.084 0.087 0.092 0.090 0.090 0.095 0.087 0.084 0.087 0.090 0.092 0.095 0.092 - 0.124 0.124 0.117 COI-S 0.117 0.115 0.117 0.126 0.123 0.117 0.135 0.137 0.132 0.123 0.132 0.132 0.129 0.132 0.132 0.135 0.129 0.120 - 0.005 0.083 COI-T 0.117 0.115 0.117 0.120 0.117 0.112 0.135 0.137 0.132 0.123 0.132 0.132 0.129 0.132 0.132 0.135 0.129 0.120 0.005 - 0.084 COI-U 0.123 0.120 0.123 0.117 0.115 0.112 0.132 0.135 0.129 0.123 0.123 0.126 0.117 0.120 0.120 0.120 0.123 0.115 0.082 0.082 - 74 COI-0 (21) COI-NJ COI-P (24) COI-Q (58) 92 COI-N (22, 24) COI-L (65) ! COI-M (61) 99 COI-K (23, 50, 60) COI-J (63) 55 COI-I (38) 90 A. italicus 98 95 70 COI-H (56) COI-G (7, 30, 42, 46) COI-A (1, 2, 3, 5, 6, 32, 37) 100 COI-B (8, 9, 11, 12, 16, 27, 31) COI-C (14) 54 COI-F (19) COI-D (62, 64, 25) 92 99 A. pallipes COI-E (64) COI-R (66, 67,68, 69) COI-U 71, 72, 73, 75 A. torrentium COI-T (74) 99 100 COI-S (70) 0.01 Fig. 15. Dendrogramma costruito con il metodo Neighbor-Joining sulla base delle distanze di Jukes-Kantor per una regione di 414 bp di mtDNA codificante per la subunita' I della Citocromo ossidasi (COI) che mostra le affinita' genetiche tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius italicus (COI-A -- COI-Q), A. pallipes (COI-R) e A. torrentium (COI-S -- COI-U). Per le sigle vedi Tab. 2. Sopra i nodi sono indicati i valori di bootstrap superiori al 50% dopo 500 repliche. 75 64 COI-MP 89 COI-0 (21) COI-P (24) COI-Q (58) COI-N (22, 24) COI-L (65) ! COI-K (23, 50, 60) 98 COI-J (63) COI-I (38) 74 92 56 COI-H (56) COI-G (7, 30, 42, 46) COI-M (61) A. italicus COI-F 19 82 83 97 COI-D (25, 62, 64) COI-E (64) COI-A (1,2,3,5,6,32,37) COI-B (8,9,11,12,16,27,31) 98 72 A. pallipes COI-C (14) COI-R (66, 67, 68, 69) 99 A. torrentium 99 COI-S (70) COI-T (74) COI-U (71,72,73,75) Fig. 16. Dendrogramma costruito con il metodo della Massima Parsimonia per una regione di 414 bp di mtDNA codificante per la subunita' I della Citocromo ossidasi (COI) che mostra le affinia' genetiche tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius italicus (COI-A -- COI-Q), A. pallipes (COI-R) e A. torrentium (COI-S -- COI-U). Per le sigle vedi Tab. 2. Sopra i nodi sono indicati i valori di bootstrap superiori al 50% dopo 500 repliche. 76 COI-B COI-C COI-D COI-E COI-A COI-M ! COI-J COI-P COI-K COI-I COI-N COI-G COI-O COI-H COI-L COI-Q Fig. 17. Minimum spanning tree ottenuto con il metodo della "parsimonia statistica" (Templeton et al., 1992) tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius italicus una regione di mtDNA codificante per la COI, . Le linee indicano una singola sostituzione; gli zeri aplotipi mancanti. Per le sigle, vedi Tab.10. Tab. 12. Aplotipi osservati sulla base dei siti di taglio di tre enzimi di restrizione Xsp I, Dde I, Acc I su una sequenza di 414 bp del gene mitocondriale per la citocromo ossidasi uno (COI) in Austropotamotius italicus (REa-p). 0 = assenza del sito di taglio; 1 = presenza del sito di taglio. POSIZIONE DEI SITI DI TAGLIO (bp) Xsp I Aplotipi Dde I Acc I 47 100 139 99 159 237 89 134 REa 1 0 0 0 0 1 1 0 REb 1 0 0 1 0 1 1 0 REc 1 0 0 1 1 1 1 0 REd 1 0 1 0 0 1 0 1 REf 1 0 1 0 0 1 0 0 REg 1 0 1 0 1 0 0 0 REk 1 0 1 0 1 0 1 0 REl 1 0 0 0 1 0 0 0 REn 1 0 1 1 1 0 0 0 REo 1 0 1 1 1 0 1 0 REp 1 0 1 1 0 0 0 0 78 3.3.2 – Subunita’ 16S del RNA ribosomiale Per il gene mitocondriale della subunita’ 16S del RNA risosomiale e’ stato sequenziato un frammento di 511 paia di basi, su un numero minore di campioni rispetto alla COI. Sono stati osservati 15 aplotipi diversi, per un totale di 62 siti variabili di cui 30 filogeneticamente informativi e 32 presenti in un solo aplotipo. La loro sequenza e’ riportata in Tab.13. Di questi, 12 sono stati osservati in A. italicus (16SA-16S-L), due in A. pallipes (16S-M, 16S-N) e uno nell’unico esemplare di A. torrentium analizzato (COI-O). Il frammento sequenziato comprendeva il 34,4 % di T, il 20,5% di C, il 34.1 % di A e l 11% di G. Questi valori mostrano una netta preponderanza dei nucleotidi A e T, gia’ osservata nel DNA mitocondriale di molti invertebrati. Sono state osservate 50 transizioni e 15 transversioni, con un rapporto transizioni/transversioni R di 4,4 che e’ di molto inferiore a quello osservato per la citocromo ossidasi. La matrice delle distanze genetiche calcolate con i metodi di JukesCantor e Tamura-Nei è riportata in Tab 14. Nelle Figg. 18 e 19 sono riportati i dendrogrammi costruiti con il metodo Neighbor Joining (sulla base delle distanze di Jukes-Cantor riportate in Tab.14) e massima parsimonia rispettivamente. Le tre specie A. torrentium, A. pallipes e A. italicus formano tre cluster ben differenziati, con una separazione piu’ antica di A. torrentium rispetto alle altre due. Nell’ambito di A. italicus sono evidenti i tre gruppi gia’ osservati con la citocromo ossidasi. Anche in questo caso i campioni dei gruppi 2 (Slovenia e Croazia occidentale, Carso triestino, Prealpi Bergamasche) e 3 (con i sottogruppi: i Italia centrale e meridionale, un campione istriano, uno dal Piemonte e uno della Francia sud-occidentale, ii campioni del confine italo-sloveno lungo il bacino dell’Isonzo, iii campioni friulani lungo il corso del Tagliamento hanno un progenitore in comune piu’ recente rispetto al gruppo 1 (Appennino Tosco-Emiliano, Italia Nord Occidentale, Canton Ticino e Spagna). 79 Il metodo di massima parsimonia ha prodotto 117 alberi con lo stesso numero di passaggi evolutivi o “step” e con diversi valori di bootstrap da cui e’ stato ricavato un albero di consenso riportato in figura 19. L’albero di consenso (in cui sono riportati solo i nodi con valori di bootstrap superiori al 50%) di massima parsimonia, ottenuto con il 16S, mostra un basso livello di risoluzione per i nodi piu’ esterni, cioe’ per i fenomeni evolutivi avvenuti piu’ recentemente fenomeno che e’ stato osservato anche con la COI. I valori medi di distanza d all’interno dei gruppi, calcolati con la formula di Jukes-Cantor per il 16S, mostrano che il gruppo 1 (d 0,0058) e’ il piu’ differenziato seguito dal 3 (d 0,0035) e 2 (d 0,0020). Questo risultati contrastano da quelli osservati per la COI soprattutto per il maggiore differenziamento del gruppo 1 in cui sono stati saggiati sostanzialmente gli stessi campioni con i due marcatori. E’ stato inoltre costruito un minimum spanning tree con il metodo della ‘parsimonia statistica’ (Templeton et al., 1992), mostrata in Fig. 20. E’ stato ottenuto un singolo network con un limite di confidenza del 95%, questo connetteva tutti gli aplotipi, che differivano per un massimo di 9 mutazioni. Dei tre clusters evidenziati nelle analisi precedenti, il cluster 3 risulta piu’ vicino all’ipotetico antenato comune, differendo per un solo step dall’aplotipo mancante centrale; per i cluster 2 e 3 e’ necessario ipotizzare 5 step. Essendo questa regione piu’ conservativa, le relazioni nell’ambito del cluster 3 non sono risolte chiaramente. Tab. 13. Aplotipi osservati per una regione di 511 bp codificante per l’rRNA 16S mitocondriale in: Austrapotamobius italicus (A-L), A. pallipes (M, N), e A. torrentium (O). 16S-A 16S-B 16S-C 16S-D 16S-E 16S-F 16S-G 16S-H 16S-I 16S-J 16S-K 16S-L 16S-M 16S-N 16S-O AAAATTTTAAAGGTCGAACAGACCTTCTATTATAGTTTCTGCTCCATAAAGAACTTTTAATTCAACATCGAGGTCGCAAACTCTCCTGTTGATAAGAACTCTTAAAGAAAATTACGCTGTTATCCCTAAAGTAACTTAACC ...........................................................T................................................................................. ............................................................................................................................................. ..................................................................................T......C................................................... ..................................................................................T......C................................................... ...................................................................................C.T.A.C................................................... ...................................................................................C.T...C................................................... ..................................................................................T..T...C................................................... ..................................................................................T..T...C................................................... ..................................................................................T..T...C................................................... ..................................................................................T..T...C................................................... ..................................................................................T..T...C................................................... ....A.......................G........................................................T...C................................................... ....A.......................G........................................................T...C................................................... ............................T...............T........T............................T..T...C................A................................T. 16S-A 16S-B 16S-C 16S-D 16S-E 16S-F 16S-G 16S-H 16S-I 16S-J 16S-K 16S-L 16S-M 16S-N 16S-O TTCTTTCCCTAATTAGGATCTTTTACTCAAACACCTCTGTAAAAAAAAAGAAACAGTTATCTTTTATTATATTCCTATCACCCCAATAAAATATTTAAAAATAGCCTTCTCATACAAAATTAATTAATATTTTTAAAATAT ............................................................................................................................................. .........................T..............................................................................T.................................... 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............................................................................................................................................. ............................................................................................................................................. ............................................................................................................................................. ............................................................................................................................................. ...............................G............................................................................................................. ...............................G............................................................................................................. ............................C..G............................................................................................................. 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16S-B 16S-C 16S-D 16S-E 16S-F 16S-G 16S-H 16S-I 16S-J 16S-K 16S-L 16S-M 16S-N 16S-O CTACCTTAGCACGGTCATAATACCGCGGCCTTTTAAATCTCAATGGGCAGGTTAGACTTTATATACCTCTCATATAGACATGTTTTTG ........................................................................................ ........................................................................................ ........................................................................................ ........................................................................................ .........................................................C.............................. .........................................................C.............................. ........................................................................................ ........................................................................................ ........................................................................................ ........................................................................................ ........................................................................................ .................................................................T...................... .................................................................T...................... .................................C...................................................... Tab. 14. Matrice delle distanze genetiche tra gli aplotipi del gene 16S calcolate secondo il metodo di TamuraNei (sopra la diagonale) e Jukes-Cantor (sotto la diagonale) per A. italicus (16S-A - 16S-L), A. pallipes (16S-M e 16S-N) e A. torrentium (16S-O). Aplotipi 16S-A 16S-B 16S-C 16S-D 16S-E 16S-F 16S-G 16S-H 16S-I 16S-J 16S-K 16S-L 16S-M 16S-N 16S-O 16S-A - 0,002 0,004 0,008 0,006 0,028 0,026 0,022 0,024 0,022 0,022 0,022 0,041 0,041 0,094 16S-B 0,002 - 0,006 0,010 0,008 0,030 0,028 0,024 0,026 0,024 0,024 0,024 0,043 0,043 0,097 16S-C 0,004 0,006 - 0,012 0,010 0,033 0,031 0,026 0,029 0,026 0,026 0,026 0,043 0,043 0,097 16S-D 0,008 0,010 0,012 - 0,002 0,028 0,026 0,018 0,020 0,018 0,018 0,018 0,041 0,041 0,090 16S-E 0,006 0,008 0,010 0,002 - 0,026 0,024 0,016 0,018 0,016 0,016 0,016 0,039 0,039 0,087 16S-F 0,028 0,030 0,032 0,028 0,026 - 0,002 0,018 0,020 0,018 0,018 0,018 0,041 0,041 0,092 16S-G 0,026 0,028 0,030 0,026 0,024 0,002 - 0,016 0,018 0,016 0,016 0,016 0,039 0,039 0,090 16S-H 0,022 0,024 0,026 0,018 0,016 0,018 0,016 - 0,006 0,000 0,004 0,004 0,032 0,032 0,080 16S-I 0,022 0,024 0,026 0,018 0,016 0,018 0,016 0,000 - 0,006 0,002 0,002 0,034 0,034 0,083 16S-J 0,024 0,026 0,028 0,020 0,018 0,020 0,018 0,006 0,006 - 0,004 0,004 0,032 0,032 0,080 16S-K 0,022 0,024 0,026 0,018 0,016 0,018 0,016 0,004 0,004 0,002 - 0,004 0,037 0,037 0,080 16S-L 0,022 0,024 0,026 0,018 0,016 0,018 0,016 0,004 0,004 0,002 0,004 - 0,032 0,032 0,085 16S-M 0,040 0,042 0,042 0,040 0,038 0,040 0,038 0,032 0,032 0,034 0,036 0,032 - 0,000 0,083 16S-N 0,040 0,042 0,042 0,040 0,038 0,040 0,038 0,032 0,032 0,034 0,036 0,032 0,000 - 0,083 16S-O 0,092 0,094 0,094 0,087 0,085 0,090 0,087 0,079 0,079 0,081 0,079 0,083 0,081 0,081 - 82 55 67 16S-NJ 50 16S-L (21, 22, 24) 16S-K (65) 71 ! 16S-J (23, 59) 16S-I (30) 85 16S-H (39, 41, 42, 57) 16S-G (25) A. italicus 99 95 16S-E (12) 77 98 A. pallipes A. torrentium 16S-F (62) 16S-D (28) 16S-C (3) 95 16S-A (1, 5) 65 11S-B (6) 16S-M (68) 100 16S-N (69) 16S-O (72) 0,01 Fig.18. Dendrogramma costruito con il metodo Neighbor-Joining per un regione di 511bp codificante per l'RNA 16S mitocondriale, che mostra le affinita' genetiche tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius italicus (16S-A -- 16S-L), A.pallipes (16S-M, 16S-N) e A.torrentium (16S-O). 83 16S-J (23, 59) 16S-L (21, 22, 24) 54 16S-MP ! 16S-K (65) 16S-I (30) 51 58 16S-H (39, 41, 42, 57) 16S-G (25) A. italicus 99 94 51 16S-F (62) 16S-E (12) 16S-D (28) 95 16S-A (1,5) 91 16S-C (3) 11S-B (6) A. pallipes 16S-M (68) 99 A. torrentium 16S-N (69) 16S-O (72) Fig. 19. Dendrogramma costruito con il metodo della Massima Parsimonia per una regione di 511bp codificante per l'RNA 16S mitocondriale, che mostra le affinita' genetiche tra gli aplotipi osservati in Austropotamobius italicus (16S-A -- 16S-L), A.pallipes (16S-M, 16S-N) e A.torrentium (16S-O). 84 16S-E 16S-D 16S-A 16S-B 16S-I 16S-L 16S-H ! 16S-J 16S-K 16S-G 16S-F Fig. 20. Minimum spanning tree ottenuto con il metodo della "parsimonia s t a t i s t i c a " (T e m p l e t o n e t a l. , 1 9 9 2 ) t r a g l i a p l o t i p i o s s e r v a t i i n Austropotamobius italicus per l'RNA16S mitocondriale. Le linee indicano una singola sostituzione; gli zeri aplotipi mancanti. Per le sigle, vedi Tab 13. 85 3.4 ALLEVAMENTI SPERIMENTALI E RIPOPOLAMENTI Sono stati effettuati dei test di allevamento sperimentale di campioni di A.italicus provenienti da aree geografiche diverse, caratterizzati geneticamente, presso le strutture dello Stabilimento Ittiogenico di Roma al fine di verificarne l’allevabilità in condizioni artificiali e mettere a punto le condizioni ottimali. Gli esemplari catturati in natura venivano stabulati in vasche di vetroresina di 100x100x40 cm alimentate da un flusso continuo di acqua di conduttura (ACEA) alla temperatura costante di 12°C. Gli animali venivano alimentati con una dieta mista costituita principalmente da pesci d’acqua dolce (coregone) e di estuario (eperlano), carote semibollite e ortica. Un’importante integrazione dietetica era rappresentata dai detriti e fauna di fondo quali foglie e macroinvertebrati prelevati dagli stessi torrenti. I test effettuati nel corso di due anni successivi hanno confermato l’estrema vulnerabilità del gambero di fiume a variazioni anche minime dei parametri chimico-fisici e biologici dell’acqua. La mortalita’ si manifestava improvvisamente dopo tre o quattro mesi nelle singole vasche con decorso più o meno rapido. L’assenza di strutture zooprofilattiche competenti in patologia dei crostacei non ha purtroppo consentito di individuare con certezza le cause di tale mortalita’. Le cause scatenanti potevano essere individuate nel malfunzionamento del sistema di declorazione e filtraggio dell’acqua che, indebolendo progressivamente gli animali, potrebbe aver favorito l’insorgenza di patologie legate ad organismi opportunisti. Una seconda ipotesi potrebbe essere la presenza di alcuni esemplari di gamberi alloctoni già infetti che avrebbero contagiato quelli autoctoni. A favore della prima ipotesi e’ l’assenza di mortalita’ in un nuovo set di allevamenti attualmente in corso, iniziato alcuni mesi fa dopo revisione dell’impianto di depurazione dell’acqua. Gli accoppiamenti avvenivano regolarmente in autunno con una percentuale di femmine fecondate pari a circa il 90%. A fecondazione avvenuta le femmine venivano spostate e stabulate in vasche separate e la 86 schiusa si aveva tra i 90 e i 120 giorni successivi. I gamberetti venivano quindi separati dalle madri dopo circa dieci giorni dalla nascita. Nel corso del primo mese la mortalità tra i gamberetti era molto elevata e la stima di sopravvivenza a 60 giorni non superava il 30%. La mortalità era attribuibile principalmente alla difficoltà a completare il processo di muta e al cannibalismo; la disponibilità di spazio sufficiente e rifugi sono pertanto importanti per l’ottenimento della massima efficienza produttiva di progenie. Esperimenti di incubazione delle uova in dispositivi di incubazione artificiale (bottiglie di Zoug) hanno evidenziato una discreta percentuale di schiusa soltanto in quelle ad avanzato stadio di sviluppo (circa due mesi); il principale fattore limite per l’incubazione artificiale è rappresentato dall’insorgenza di infezioni micotiche (saprolegnosi) che possono essere combattute con il costante monitoraggio delle uova eliminando quelle infettate, e trattamenti periodici con cloruro di sodio. Nell’ambito di un progetto pilota finanziato dalla Regione Abruzzo finalizzato al ripopolamento di alcuni corsi d’acqua del Parco Regionale del Sirente-Velino, sono stati avviati ad allevamento presso le strutture dell’ex incubatoio provinciale del Vetoio de L’Aquila un centinaio di riproduttori raccolti in diversi corsi d’acqua abruzzesi e laziali. L’impianto sorge in corrispondenza di una risorgiva che alimenta una serie di vasche e piccoli stagni. L’acqua presenta una temperatura quasi costante (9-12°C) nell’arco dell’anno e un indice biotico di 1a Classe. Gli animali, in rapporto di un maschio ogni tre femmine, sono stati in parte liberati negli stagni ed in parte incubati in vasche di cemento collocate all’interno e all’esterno dell’incubatoio. Lo scopo è di procedere con forme di allevamento di tipo misto: da un lato in un habitat molto simile a quello naturale, sebbene poco controllabile, che potrebbe dare utili indicazioni sulla dinamica di accrescimento naturale della popolazione introdotta; dall’altro l’allevamento controllato in maniera da poter seguire il livello di acclimatazione degli adulti, le fasi di fecondazione e 87 sviluppo delle uova mirati alla produzione di progenie da destinare ai ripopolamenti. I risultati di questi esperimenti sono ancora preliminari, essendo trascorsi solo pochi mesi dall’immissione degli esemplari. Tuttavia appaiono molto promettenti, in quanto la mortalita’ e’ finora assente. In questa fase del periodo riproduttivo (che durera’ fino a gennaio) e’ stata gia’ ottenuta una buona percentuale (circa 50%) di femmine ovigere. 88 CAPITOLO 4 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Il censimento da noi condotto sulle popolazioni di Austropotamobius italicus hanno mostrato che, almeno per l’Italia dove e’ possibile il confronto, l’area complessiva di distribuzione e’ rimasta sostanzialmente sovrapponibile rispetto a quella evidenziata alla fine dell’800 (Vinciguerra, 1899). Si conferma infatti una presenza di A. italicus piu’ marcata nei corsi d’acqua prealpini e alpini e in quelli dei versanti appenninici adriatici rispetto a quelli tirrenici. Il limite meridionale della distribuzione e’ stato confermato nel massiccio del Pollino. Una differenza marcata rispetto alla fine dell’800 riguarda la virtuale assenza di gamberi autoctoni dalla maggior parte dei corsi d’acqua principali: le popolazioni da noi censite sono state tutte individuate nei piccoli tributari delle principali aste fluviali. Ad esempio per l’Italia centrale il bacino del Velino, del Turano e del Tronto sono ormai virtualmente privi di A. italicus, mentre la diffusione delle specie esotiche è in espansione. Due piccole popolazioni di A. italicus individuate nel 1995 in due affluenti dell'alto Velino si sono estinte nell'arco di due anni. Anche in Abruzzo la rarefazione di A. italicus è stata particolarmente significativa: fino a pochi decenni fa esso era ampiamente distribuito lungo i principali bacini idrici, in particolare quelli dell'Imele-Salto, dell'Aterno, del Pescara e del Sangro, mentre attualmente sono completamente scomparse dai corsi principali, e sopravvivono solo in alcuni corsi d’acqua secondari e terziari. L’indagine condotta mediante marcatori molecolari ha confermato ed esteso i risultati da noi precedentemente ottenuti sulla base di soli marcatori allozimici (Santucci et al., 1997). La separazione di A. italicus da A. pallipes e A.torrentium, il cui isolamento riproduttivo e’ stato verificato in natura dall’assenza di ibridi di F1 (Santucci et al., 1997; Bondanelli et al., in prep) e’ stata confermata anche a livello dei marcatori mitocondriali esaminati. La 89 distinzione specifica del taxon berndhauseri proposta da Largiader et al. (2000) non trova conferma dal presente studio. Infatti i campioni del Canton Ticino, della Val d’Ossola e delle Prealpi Lombarde, che secondo Largiader et al. (2000) sarebbero da attribuire a A. berndhauseri, risultano affini sia a livello nucleare che mitocondriale a campioni di una’area piu’ vasta dell’Italia nord-occidentale, nonche’ a campioni dell’Italia centrosettentrionale e della Spagna, attribuiti a A. italicus. Tali dati concordano con Albrecht (1982) che su base morfologica includeva le popolazioni del Canton Ticino e della Lombardia nella varieta’ lombardicus. Nell’ambito di A. italicus, viene confermata l’eterogeneita’ genetica evidenziata sia a livello di marcatori allozimici (Santucci et al., 1997) che di RFLP e sequenze mitocondriali (Grandjean et al., 2000). In Fig. 21 viene messo a confronto il quadro schematico complessivo evidenziato per questa specie a livello nucleare, sulla base di 29 loci enzimatici, e citosplasmatico, sulla base di due regioni del DNA mitocondriale codificanti per la COI e per l’RNA 16S (cf dendrogrammi NJ e MP delle Figg. 14, 15, 19, 20). I due metodi concordano nell’identificare 5 gruppi di affinita’, che si raggruppano in 3 cluster principali; sono state tuttavia osservate alcune discordanze, che verranno qui di seguito analizzate. 1) popolazioni del Canton Ticino, Italia nord-occidentale, centro- settentrionale e della Spagna Vengono poste in un cluster distinto, nettamente separato dagli altri, sia dai marcatori nucleari che mitocondriali. Nell’ambito dell’Italia con entrambi gli approcci si evidenziano due sottogruppi. I campioni dell’Italia nord-occidentale e del Canton Ticino formano un sottogruppo molto omogeneo (DNei media 0,008), che come distribuzione geografica corriponde alla varieta’ lombardicus descritta da Albrecht (1982). A questo gruppo appartengono le popolazioni del Piemonte e della Liguria, non inserite in questo lavoro, che hanno mostrato fenomeni di introgressione con A. pallipes (Santucci et al., 1997; Bondanelli et al., in prep.). Il gruppo dell’Italia centro-settentrionale, 90 mtDNA allozymes Fig. 21 . Rappresentazione riassuntiva dei principali gruppi di affinita' genetica evidenziati in Austropotamobius italicus a livello di marcaori nucleari e mitocondriali. 91 presenta popolazioni piu’ eterogenee e frammentate (DNei media=0,03). Per quanto riguarda la Spagna, per la COI e il 16S i campioni spagnoli sono risultati geneticamente molto omogenei e affini ai campioni dell’Italia centro-settentrionale; a livello di allozimi e’ stata osservata una notevole variabilita’ genetica, soprattutto per la Pgk e l’Aat-2, con alleli privati sia per Aat-2 che per l’Mdh-1 (DNei media=0,02). I campioni piu’ differenziati sono quelli dell’Andalusia e della Spagna mediterranea rispetto ai campioni atlantici, che risultano molto affini a popolazioni dell’Italia nord-occidentale. Questi dati confermano l’affinita’ dei campioni spagnoli con campioni italiani di A. italicus precedentemente osservata da Santucci et al. (1997) a livello di allozimi e da Grandjean et al. (2000, 2001) su RFLP di mtDNA totale e su sequenze del mtDNA 16S. A livello morfologico le popolazioni spagnole vengono attribuite alla sottospecie “lusitanicus” da Bott (1950, 1972) e Karaman (1962), mentre Albrecht (1982) li include insieme all’Italia centrale e meridionale nella varieta’ italicus per l’elevata variabilita’ morfologica osservata. Tali dati sembrano escludere che i campioni spagnoli derivino tutti da introduzioni recenti, come suggerito ad esempio da Albrecht (1982) e Laurent (1988). Per spiegare la maggiore variabilita’ evidenziata a livello di allozimi e di mtDNA rispetto ai supposti campioni di origine bisognerebbe infatti supporre che questa variabilita’ sia stata completamente persa in Italia in un periodo successivo alle introduzioni in Spagna. Si puo’ invece ipotizzare che in Spagna vi fossero popolazioni autoctone (il cui segnale si ritrova negli alleli privati che ancora si osservano in questa regione) il cui pool genico si sia in gran parte rimescolato con quello di popolazioni occidentali italiane di A. italicus. Tale entita’ poteva corrispondere a A. i. lusitanicus. L’attuale distribuzione disgiunta di A. italicus non permette di distinguere tra introduzioni recenti in Spagna ad opera dell’uomo e 92 flusso genico meridionale naturale anche se tra i popolazioni due attraverso fenomeni non si la Francia escludono reciprocamente. La Francia meridionale e’ attualmente occupata da A. pallipes e l’unico campione di A. italicus del sud della Francia (Pirenei orientali) e’ risultato composto circa al 5% da esemplari affini ai vicini campioni spagnoli, e al 95% da esemplari affini a quelli dell’Italia centro-meridionale. Anche in questo caso potrebbe trattarsi di trasporto passivo. Una popolazione di tipo italicus citata da Laurent e Suscillon (1962) nei dintorni di Avignone non e’ stata successivamente ritrovata. 2) Popolazioni dell’Italia centro-meridionale Sono risultate geneticamente omogenee a livello di marcatori mitocondriali; a livello nucleare solo l’Aat-2 differenzia il campione di Gubbio e in misura minore alcuni campioni del versante adriatico, per la presenza di un allele tipico di campioni nordorientali. Del tutto omogenee rispetto a questo gruppo, sia a livello di allozimi che di mtDNA, sono risultate due popolazioni rispettivamente dei Pirenei orientali, sopra citata e dell’Appennino Ligure. Anche in questo caso la distribuzione disgiunta non permette di distinguere tra una situazione relitta di una passata distribuzione piu’ ampia (per es. strettamente costiera) e introduzioni recenti. 3) Popolazioni del Bacino dell’Isonzo Anche questo gruppo risulta geneticamente omogeneo e distinto dagli altri a livello di DNA mitocondriale e, soprattutto, a livello di allozimi, dove con l’UPGMA rappresentano il clade piu’ ancestrale (DNei media=0,13 dagli altri). Queste popolazioni risultano ben caratterizzate a livello genetico da campioni situati a pochi chilometri in linea d’aria, che vanno a far parte del bacino della Piana del Tagliamento (DNei media=0,17) 93 4) Popolazioni della Piana del Tagliamento Formano un clade distinto per l’mtDNA insieme al campione disgiunto austriaco, caratterizzato solo a questo livello, e risultano relativamente affini al campione della Dalmazia, mentre a livello di allozimi formano un gruppo piu’ ampio (con Dalmazia, Marche, Prealpi Orobie e Bellunesi e Carnia); a livello morfologico gli esemplari austriaci (stessa localita’) sono stati attribuiti alla varieta’ carinthiacus; (Albrecht, 1981, 1982) e elevati a sottospecie da Grandjean et al (2000) sulla base del mtDNA. 5) Popolazioni del Carso, Italiano, Sloveno e Fiumano (Rijeka) Ben distinte, soprattutto a livello di mtDNA, dove formano un clade insieme a campioni della Carnia e delle Prealpi Orobie e Bellunesi: a livello di allozimi pur formando un sottogruppo distinto rientrano in un cluster con le popolazioni della Piana del Tagliamento e dell’Italia centromeridionale. Popolazioni del Trentino (geograficamente prossime alle Prealpi Bellunesi) erano state attribuite da Albrecht (1982) alla varieta’ trentinicus). Le popolazioni orientali di A. italicus mostrano livelli maggiori di variabilita’ e di eterogeneita’ genetica rispetto a quelle occidentali. Tale dato, insieme alla posizione generalmente centrale di queste popolazioni con i diversi metodi di clustering indica che esse costituiscono verosimilmente un gruppo piu’ ancestrale rispetto alle altre e un possibile centro di diffusione, da un rifugio Adriato-Mediterraneo (secondo la definizione di Keith, 1998). Da questo sarebbe derivato dapprima il gruppo piu’ occidentale (rappresentato dalle popolazioni dell’Italia nord-occidentale e centro-settentrionale, del Canton Ticino e della Spagna), che puo’ essersi isolato in un rifugio del bacino occidentale del mediterraneo durante una fase glaciale pleistocenica. Uno dei periodi di piu’ drastici cambiamenti climatici negli ultimi 3 milioni di anni si e’ verificato intorno a 700,000 anni fa e avrebbe portato al primo importante isolamento dei principali sistemi fluviali che formano gli attuali 94 bacini idrografici (Webb & Bartlein, 1992; Andersen & Borns, 1994; Villinger, 1986). Pur nell’impossibilita’ di calibrare un orologio molecolare, in particolare per l’mtDNA, la distanza genetica osservata a livello di allozimi per il gruppo occidentale di A. italicus (DNei=0,12) corrisponde a tale datazione con l’algoritmo di Nei (1987). Il gruppo dell’Italia nord-occidentale si sarebbe separato solo successivamente da quello nord-adriatico. E’ noto che i bacini del Po, della Slovenia e della Croazia sono stati tutti interconnessi durante le fasi di massimi interglaciali (Bianco, 1990). La relativa omogeneita’ genetica, osservata in un’area geografica relativamente ampia suggerisce un’espansione piuttosto rapida (Ibrahim et al., 1996). Ripetuti eventi di isolamento geografico nei diversi sistemi fluviali (accompagnati da riduzioni numeriche, con fenomeni di deriva genetica), e di successiva espansione legate a cambiamenti climatici pleistocenici, possono spiegare il marcato differenziamento delle popolazioni nordadriatiche e le discordanze osservate in quest’area. Ad esempio, la distribuzione piu’ ampia del pool genico corrispondente al gruppo geografico della piana del Tagliamento osservata a livello di allozimi rispetto all’mtDNA farebbe pensare a una espansione di questo gruppo nelle aree circostanti (sia ad ovest, verso le Prealpi , a sud verso le Marche e ad est verso l’Istria e la Dalmazia). Una colonizzazione da parte prevalentemente dei maschi (di cui sono note le Arrignon, maggiori capacita’ di dispersione rispetto alle femmine, 1991) spiegherebbe l’assenza di introgressione a livello mitocondriale, che manterrebbe il segnale delle popolazioni preesistenti. Tale asimmetria nei pattern di introgressione tra marcatori nucleari e mitocondriali e’ stata recentemente messa in evidenza nello studio di una zona di parapatria tra A. pallipes e A. italicus (Bondanelli et al., in prep.). I gruppi di affinita’ genetica evidenziati nel presente lavoro nell’ambito di A.italicus rappresentano “unita’ evolutivamente significative” (ESU) da salvaguardare. Per la maggior parte tali gruppi corrispondono alle ‘varieta’ identificate da Albrecht, 1982 (che pur includeva Austropotamobius nel 95 genere Astacus). La varieta’ carsicus, descritta dell’Erzegovina e Dalmazia meridionale (Albrecht, 1982) e la sua identita’ con popolazioni del Carso (il nostro gruppo 5), ipotizzata da Grandjean et al (2000) senza confronti diretti, rimane da verificare. La situazione evidenziata in Austropotamobius mostra un notevole parallelismo con quella evidenziata in altri organismi europei d’acqua dolce, come la trota (Salmo trutta, Bernatchez et al, 2000) e la tartaruga Emys orbicularis (Lenk et al., 1999). e mostra un ruolo importante, nel creare e strutturare la diversita’ genetica, dei fattori storici legati a rifugi multipli mediterranei e adriatici durante le glaciazioni pleistoceniche e ad alterni processi di isolamento ed espansione. Come in Austropotamobius, anche in Salmo trutta e’ stato evidenziato un gradiente longitudinale da est a ovest di riduzione della strutturazione delle popolazioni, con livelli molto piu’ elevati di frammentazione nelle popolazioni adriatiche rispetto a quelle piu’ occidentali, che suggerisce fenomeni di espansione dell’areale relativamente recenti in queste ultime. A questo quadro gia’ complesso si aggiungono le conseguenze dell’attivita’ antropica, da una parte con introduzioni non controllate a scopi commerciali, dall’altra con i drastici e recenti fenomeni di frammentazione e relittazione delle popolazioni legati all’alterazione degli habitat e ai problemi di sovrappesca, di epidemie da patogeni introdotti e di competizione con specie alloctone. Il fenomeno e’ particolarmente evidente in alcune popolazioni dell’Italia centrale e settentionale, in cui a valori molto bassi di variabilita’ genetica si accompagnano alleli privati ad elevata frequenza. La ormai scarsa presenza del gambero di fiume in numerose aree dove un tempo era relativamente abbondante, insieme alla bassa variabilita’ genetica messa in evidenza con i marcatori utilizzati in gran parte dell’areale di distribuzione di A. italicus, indica la necessita’ di misure di reintroduzione e restocking per questa specie. Il presente studio fornisce una mappa della struttura genetica delle popolazioni, e suggerisce, nell’ambito di ciascun gruppo evidenziato, le aree risultate piu’ a rischio di estinzione e quelle con la maggiore diversita’ genetica. Le popolazioni piu’ abbondanti sono state 96 osservate in stazioni dell’Italia nordorientale, particolarmente in Friuli, lungo il bacino dell’Isonzo, nel Carso Sloveno e Triestino; in alcune stazioni dell’Alto Lazio, in parte situate in aree protette; in campioni della Spagna mediterranea e dei Pirenei orientali. Spesso (ma non sempre, come ad esempio per l’Italia centrale) tali popolazioni sono anche quelle con i maggiori livelli di variabilita’ genetica. Tali popolazioni possono rappresentare “reservoirs” di diversita’ genetica. Qualsiasi intervento in natura deve, tuttavia, tener conto della struttura filogeografica evidenziata nel presente lavoro. Prima di interventi in natura, appare indispensabile verificare in situazioni sperimentali controllate il successo riproduttivo degli incroci che si intendono effettuare allo scopo di evitare fenomeni di outbreeding depression. Tali allevamenti andrebbero mantenuti per piu’ di una generazione. I risultati degli allevamenti sperimentali effettuati indicano situazioni come quella seminaturale dell’ex incubatoio provinciale dell’Aquila una struttura ottimale per realizzare tali esperimenti. 97 BIBLIOGRAFIA Aldrovandi, U., 1642. De animalibus exanguibus reliquis quatuor. Lib. II, De Crustatis, IV: de gammaro, seu Astaco fluviatili, S. 44-47, Bologna. Albrecht, H., von Hagen, H. O. 1981: Differential weighting of electrophoretic data in crayfish and fiddler crabs (Decapoda, Astacidae and Ocypodydae). Comp. Biochem. Physiol. 70B: 393-399. Albrecht, H., 1982. Das System der europäischen Flusskrebse (Decapoda, Astacidae): Vorschlag und Begründung. Mitt. hamb. zool. Mus. Inst. 79: 187-210. 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