Original article - Blood Transfusion

Original article
Platelet gel: assays of three growth factors
Anna Rughetti1, Rita Gallo2, Gaetano Caloprisco3, Alessio Borean3, Stefano Necozione4,
Luigi Dell’Orso1, Pietro Leocata2, Carlo Rivellini5, Donatella Di Marzio1,
Donatella Di Natale1, Letizia Lepore1, Albina Lupo1, Edoardo Alesse2
1
UO di Immunoematologia e Trasfusionale, Ospedale San Salvatore, ASL n° 4, L’Aquila
Dipartimento di Medicina Sperimentale, Università di L’Aquila
3
Unità Operativa Autonoma di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, Ospedale San Martino, Belluno, Italia
4
Dipartimento di Medicina Interna e Sanità Pubblica, Università di L’Aquila
5
Cattedra di Chirurgia Vascolare, Dipartimento di Scienze Chirurgiche, Università di L’Aquila, Italia
2
Abstract
Introduzione
Background Platelet gel is used to promote and
accelerate tissue repair through the effect of platelet
growth factors released at the site of a lesion.
Aims The aim of this study was to quantify the
concentrations of platelet-derived growth factor-AB
(PDGF-AB), insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and
β1 (TGF-β
β1) in clinically
transforming growth factor-β
used preparations in order to evaluate any correlation with
platelet count and to determine their therapeutic ranges.
Materials and methods Eighty samples, comprising
mixtures of platelet concentrates and cryoprecipitates, 54
autologous and 26 homologous from patients or donors,
were studied; 46 were produced at the Service of
Immunohaematology and Transfusion (SIT) of L'Aquila
using multiple bags, and 34 were produced at the SIT of
Belluno by apheresis. The assays were performed using
Quantikine® R&D Systems kits on supernatants of samples
stored at –80 °C, thawed and centrifuged; the concentration
of PDGF-AB was also evaluated after activation with
thrombin and calcium. The statistical analysis of the
results was performed using Student's t test for paired
data and Spearman's correlation.
Results The concentration of platelets in the samples
was 7.8-fold higher than baseline. The levels of PDGF-AB
β1 in the supernatants of the thawed samples
and TGF-β
were about 4 times higher than the reference values (in
serum): r=0.54 and p<0.0001 for PDGF-AB; r=0.50 and
Le piastrine elaborano, immagazzinano e rilasciano, se
attivate, numerosi fattori di crescita (growth factors o GFs)
capaci di stimolare la replicazione delle cellule mesenchimali,
come fibroblasti, osteoblasti e cellule endoteliali e di
esercitare un'azione chemiotattica verso macrofagi, monociti
e polimorfonucleati. Pertanto, rilasciati localmente, i GFs
innescano e promuovono processi di rigenerazione
tessutale1-3. Il Gel Piastrinico (GP) è un emocomponente
per uso topico, prevalentemente autologo, costituito da
crioprecipitato4 e da piastrine "iperconcentrate"4: l'effetto
riparativo e rigenerativo del GP è affidato all'attivazione di
queste e alla conseguente liberazione in loco di GFs in
esse contenuti. Al fine di verificarne le supposte proprietà
riparative, nello studio riportato è stato eseguito il dosaggio
di 3 importanti fattori di crescita piastrinici su 80 campioni
costituiti da un mix di piastrine iperconcentrate (PRP) e
crioprecipitato (CRIO). I GFs studiati sono: PDGF-AB
(Platelet-Derived growth factor-AB), TGF-β1
(Transforming growth factor-β1) e IGF-I (Insulin-like
growth factor I). Sono stati considerati i tre suddetti GFs
per il dosaggio sui campioni poiché sono quelli più
frequentemente citati in letteratura nonché per le minori
difficoltà di reperimento dei relativi kit.
Received: 20 May 2005 - Revision accepted: 2 September 2005
Correspondence:
Dott.ssa Anna Rughetti
UO di Immunoematologia e Trasfusionale
Ospedale San Salvatore
Piazzale P. Stefanini, 67100 Coppitto, L'Aquila - Italia
E-mail: [email protected]
92
Materiali e metodi
Sono stati testati 80 campioni di mix PRP + CRIO, 54
autologhi e 26 omologhi. Di questi, 46 sono stati prodotti
presso l'Unità Operativa (UO) di Immunoematologia e
Trasfusionale di L'Aquila e 34 presso l'UO di
Immunoematologia e Medicina Trasfusionale di Belluno.
I campioni su cui eseguire le determinazioni sono stati
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
Platelet gel: assay of 3 growth factors
β1. A stronger correlation between the
p<0.0001 for TGF-β
two variables in the samples was found after activation
with calcium and batroxobin, with a statistically significant
difference between concentrations of PDGF before and
after activation (p=0.0106). The concentration of IGF-I was
not related to the platelet count (r=-0.09; p=0.39).
Conclusions A good correlation was found between
platelet concentration and the levels of PDGF-AB and
β 1, but not with IGF-1; statistically significantly
TGF-β
higher levels of PDGF-AB were found after activation and
centrifugation of the samples.
Key words: platelet gel, PDGF-AB, TGF-β1, IGF-1
Introduction
Platelets produce, store and release, if activated,
numerous growth factors capable of stimulating the
replication of mesenchymal cells, such as fibroblasts,
osteoblasts and endothelial cells, as well as exerting a
chemotactic effect towards macrophages, monocytes and
polymorphonuclear leucocytes. Thus, when released
locally, growth factors trigger and promote processes of
tissue repair1-3. Platelet gel is a blood component,
prevalently autologous, for topical use. It is formed of a
cryoprecipitate4 and "hyperconcentrated" platelets4: the
reparative and regenerative effects of platelet gel are based
on the activation of the platelets and the consequent local
release of the growth factors contained in them. In order to
verify these reparative properties, we assayed the
concentrations of three important growth factors in 80
samples formed of a mixture of hyperconcentrated platelets
(PRP) and cryoprecipitate. The growth factors assayed were
platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB),
transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and insulin-like
growth factor-1 (IGF-1). We chose to focus on these three
growth factors, because they are the ones most frequently
mentioned in the literature and also the ones for which the
relative assay kits are easiest to obtain.
Materials and methods
Eighty samples of a mixture of PRP + cryoprecipitate,
54 autologous and 26 homologous, were tested. Of these,
46 were produced at the Service of Immunohaematology
and Transfusion Medicine (SIT) of L'Aquila and 34 at the
SIT of Belluno.
The samples on which the assays were conducted were
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
preparati utilizzando concentrati leuco-piastrinici prodotti
con due differenti modalità.
A- Metodo 1, utilizzato dal SIT di l'Aquila5
Vengono raccolti 380-450mL di sangue intero con sacca
multipla (tripla o quadrupla); in caso di GP autologo viene
mantenuto pervio l'accesso venoso con soluzione
fisiologica mediante il campionatore annesso alla sacca di
raccolta e, dopo aver recuperato plasma e strato
leucopiastrinico, gli eritrociti concentrati (EC) possono
essere reinfusi al paziente. Per il frazionamento, si procede
ad una prima centrifugazione della sacca per 10 minuti a 22
°C con centrifuga Heraeus Cryofuge 6000i (AHSI SpA,
Massa Martana, PG, Italia), rcf 927, Speed 1700, ottenendo
Plasma Ricco di Piastrine (PRP) ed EC; il PRP così ottenuto
viene, quindi, sottoposto ad una seconda centrifugazione,
6 minuti a 22 °C, rcf 3931, Speed 3500, allo scopo di produrre
un concentrato piastrinico (CP) e plasma povero di piastrine
(PPP).
Le piastrine, alla fine, vengono iperconcentrate in
10-15mL di plasma.
Dal PPP, congelato rapidamente a –80 °C
immediatamente dopo il frazionamento, si ottiene il
crioprecipitato (CRIO) in 10-20mL di plasma.
Il CRIO viene prodotto mediante sifonamento6.
Successivamente, il CP viene unito al CRIO utilizzando un
connettore sterile TSCD® (Terumo Sterile Tubing Welder,
Terumo Italia, Roma). Dopo aver miscelato accuratamente
i due emocomponenti fra loro e dopo aver praticato più
volte lo streepping sul tubicino annesso, viene staccato
un segmento di questo per i controlli di qualità: emocromo,
utilizzando il contaglobuli ADVIA 120 – BAYER (Bayer
Diagnostici srl, Milano, Italia); dosaggio del fibrinogeno,
utilizzando metodo Clauss con sistemi di coagulazione IL
(Instrumentation Laboratory SpA, Milano, Italia); dosaggio
dei GFs (vedi oltre).
Il GP ottenuto può essere utilizzato fresco o conservato
a ≤40 °C in aliquote allestite sterilmente7.
Per ogni unità di mix PRP + CRIO prodotta, suddivisa o
no in aliquote, è stato conservato a –80 °C un campione di
alcuni mL adeguatamente etichettato da utilizzare per il
dosaggio dei GFs.
B- Metodo 2, utilizzato dal SIT di Belluno8
Ogni paziente/donatore è stato sottoposto a prelievo
multicomponente mediante separatore cellulare
Haemonetics MCS3+® (Haemonetics Corp., Braintree, MA,
USA). Impiegando un circuito per la raccolta di cellule
93
A Rughetti et al.
prepared using white cell and platelet concentrates
prepared in two different ways.
A- Method 1, used by the SIT of L'Aquila5
Whole blood (380-450mL) was collected in multiple (triple
or quadruple) bags; in the case of production of autologous
platelet gel, the venous access was maintained patent by an
infusion of physiological saline through the sampler
connected to the collection bag and, after having recovered
the plasma and the layer of platelets and leucocytes, the red
cell concentrate could be reinfused into the patient.
The fractionation was carried out by a first centrifugation
of the bag for 10 minutes at 22 °C using a Heraeus Cryofuge
6000i centrifuge (AHSI SpA, Massa Martana, PG, Italy), rcf
927, speed 1700, to obtain platelet-rich plasma (PRP) and red
cell concentrate; the PRP thus obtained was then subjected
to a second centrifugation for 6 minutes at 22 °C, rcf 3931,
speed 3500, in order to produce the platelet concentrate and
platelet-poor plasma. Finally, the platelets were
hyperconcentrated in 10-15mL of plasma.
The cryoprecipitate in 10-20mL di plasma was obtained
from the platelet-poor plasma, frozen rapidly to –80 °C,
immediately after fractionation. The cryoprecipitate was
produced by syphoning6. Subsequently the platelet
concentrate was combined with the cryoprecipitate using
a sterile connector (TSCD®; Terumo Sterile Tubing Welder,
Terumo Italia, Rome).
After having mixed the two blood components carefully
and "stripped" the connecting tube, a part of the tube was
detached for quality control tests: a complete blood count,
using an ADVIA 120 automated blood counter (Bayer
Diagnostici srl, Milan, Italy); fibrinogen assay, using
Clauss' method with IL coagulation systems
(Instrumentation Laboratory SpA, Milan, Italy); and assays
of the growth factors (see below).
The platelet gel obtained could be used fresh or stored
at ≤40 °C in sterilely prepared aliquots7.
From each unit of PRP + cryoprecipitate mixture
produced, subdivided or not into aliquots, a suitably
labelled sample of a few millilitres was stored at –80 °C for
the growth factor assays.
B- Method 2, used by the SIT of Belluno8
Multiple blood components were harvested from each
patient or donor using a Haemonetics MCS3+® cell
separator (Haemonetics Corp., Braintree, MA, USA). The
blood components necessary for the platelet gel (leucocyte
and platelet concentrate and plasma) were obtained by
94
staminali (Cod. 971E) e un protocollo modificato, sono stati
ottenuti gli emocomponenti base del gel (concentrato
leucopiastrinico e plasma). Il plasma è stato immediatamente
congelato a –80 °C e, quindi, scongelato a +4 °C per 18 ore
per ottenere il crioprecipitato. Allo scopo di verificare le
rese della procedura multicomponente, le caratteristiche
degli emocomponenti prodotti sono state monitorate con
controlli di qualità. I concentrati leucopiastrinici sono stati
valutati primariamente per il contenuto di piastrine (plt) e
leucociti/µL con contaglobuli Technicon H3 RTCTM (Bayer
Corp, Tarrytown, NY, USA), mentre il CRIO per il contenuto
di fibrinogeno/unità con CA-6000 (Sismex Corp,
Wakinohoama-Kaigandori, Kobe, Giappone). Il
concentrato leucopiastrinico è stato successivamente
miscelato con il CRIO a pari volume per arricchirlo di
fibrinogeno, Fattore VIII, Fattore von Willebrand, Fattore
XIII e di fibronectina. La miscelazione è stata eseguita
mediante connessione sterile delle due sacche con il
saldatore TSCD®. Il concentrato arricchito è stato, quindi,
aliquotato sterilmente in unità di volume variabile utilizzando
sacche quadruple (Maco Pharma, Tucoing, Francia). La
suddivisione in aliquote ha permesso di avere a
disposizione, calibrando opportunamente il volume in
funzione dell'estensione della lesione, l'emocomponente per
applicazioni seriate nel tempo, limitando in tal modo il
numero di procedure aferetiche. Il prodotto così ottenuto è
stato applicato entro cinque giorni dal prelievo oppure
stoccato a ≤40 °C e applicato successivamente in forma di
lisato di piastrine arricchito di crioprecipitato. Per ogni
unità di emocomponente (PRP + CRIO) prodotta è stato
conservato a –80 °C un piccolo campione da utilizzare per
il dosaggio dei GFs.
C- Dosaggio dei GFs
Per procedere al dosaggio dei GFs, i campioni
conservati allo scopo sono stati scongelati a temperatura
ambiente, quindi centrifugati per 30 minuti a 14.000 rpm a
+4 °C mediante una microcentrifuga Beckman Microfuge R
(HiTechTrader, Mount Holly, NJ, USA), per eliminare residui
e stromi cellulari. Il sovranatante così ottenuto è stato
utilizzato diluito 1:500 per l'esecuzione dei test.
Il conteggio piastrinico mediante esame
emocromocitometrico è stato effettuato:
1- su sangue intero del donatore/paziente prima di ogni
procedura donazionale,
2- sui campioni di GP (PRP + CRIO) prima dell'attivazione
con Batroxobina (Botropase, Ravizza Farmaceutici SpA,
Muggiò, MI, Italia) e Calcio gluconato al 10% (Monico
SpA, Venezia/Mestre, Italia),
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
Platelet gel: assay of 3 growth factors
using a circuit for the collection of stem cells (Cod. 971E)
and a modified protocol. The plasma was immediately frozen
to –80 °C and then thawed at +4 °C for 18 hours to obtain
the cyroprecipitate. In order to determine the yield of the
multicomponent procedure, quality control tests were
performed on the blood components produced. The
leucocyte/platelet concentrates were primarily evaluated
for platelet count and number of leucocytes/µL using a
Technicon H3 RTCTM cell counter (Bayer Corp, Tarrytown,
NY, USA), while the cryoprecipitate was tested for
fibrinogen content/unit with a CA-6000 (Sismex Corp,
Wakinohoama-Kaigandori, Kobe, Japan). The leucocyte/
platelet concentrate was subsequently mixed with an equal
volume of cryoprecipitate to enrich its fibrinogen, factor
VIII, von Willebrand factor, factor XIII and fibronectin
content. The mixture was constituted through a sterile
connection between the two bags using a TSCD® connector.
The enriched concentrate was then sterilely divided into
various volumes using quadruple bags (Maco Pharma,
Tucoing, France). This division provided different volumes
of the blood component, chosen according to the size of
the lesion to be treated. These aliquots were then available
for serial use, thus limiting the number of apheresis
procedures necessary. The product obtained was used
within five days of collection or stored at ≤40 °C and applied
subsequently in the form of platelet lysate enriched with
cryoprecipitate. For each unit of blood component (PRP +
cryoprecipitate) produced, a small sample was stored at a
–80 °C for the growth factor assays.
C- Growth factor assays
In order to carry out the growth factor assays, the
samples conserved for this purpose were thawed at room
temperature and then centrifuged for 30 minutes at 14,000
rpm at +4 °C in a Beckman Microfuge R (HiTechTrader,
Mount Holly, NJ, USA), to eliminate cell stroma and
residues. The supernatant obtained in this way was diluted
1:500 for the tests. The platelet count, evaluated by a cell
counter, was performed:
1- on whole blood from the donor or patient before each
donation;
2- on samples of platelet gel (PRP + cryoprecipitate) before
activation with batroxobin (Botropase, Ravizza
Farmaceutici SpA, Muggiò, MI, Italy) and calcium
gluconate 10% (Monico SpA, Venezia/Mestre, Italy),
3- on some of the samples of the PRP + cryoprecipitate
mixture after the first freezing and thermal shock
treatment, with the aim of determining the number of
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
3- su parte dei campioni di mix PRP + CRIO, dopo il primo
scongelamento e dopo shock termico, al solo fine di
valutare il numero di piastrine integre residue dopo ogni
congelamento/scongelamento. Lo shock termico è stato
eseguito con la tecnica del freeze and thaw: si è
proceduto, cioè, per tre volte al congelamento/
scongelamento dei campioni mediante passaggi
repentini da ghiaccio secco a +37 °C. L'emocromo è
stato eseguito dopo miscelamento dei campioni a
temperatura ambiente per 2 ore9 su agitatore LPR3
(Melco Engineering Corp, Glendale, CA, USA: le curve
di distribuzione delle cellule del sangue ed il volume
piastrinico medio sono stati utilizzati come criteri di
attendibilità dell'esame.
Per il dosaggio dei fattori di crescita sono stati utilizzati
kit Quantikine® R&D Systems (SPACE Import-Export srl,
Milano, Italia) per test quantitativi basati su tecnica
immunoenzimatica tipo sandwich. Sono state impiegate
micropiastre sensibilizzate con anticorpo monoclonale
specifico per PDGF-AB e IGF-I, e recettore solubile tipo II
per TGF-β1; il fattore di crescita presente si lega in maniera
specifica all'anticorpo o al recettore corrispondente. Il
complesso antigene/anticorpo viene riconosciuto da un
anticorpo secondario policlonale coniugato con
perossidasi. Dopo l'aggiunta del substrato, la
concentrazione relativa dei fattori di crescita, proporzionale
alla densità ottica, è stata valutata in rapporto a una curva
standard mediante spettrofotometro, secondo le istruzioni
del produttore.
Su 36/80 campioni di GP (PRP + CRIO) ancora
disponibili, in proporzioni equivalenti tra i due gruppi, è
stata eseguita una seconda determinazione del PDGF-AB,
previa attivazione con Batroxobina e Calcio gluconato in
ragione di 1/10, a +20 °C per 1 ora. I campioni sono stati,
quindi, centrifugati e testati con le modalità sopra descritte.
Il confronto statistico tra la concentrazione di piastrine
e i livelli dei GFs nei campioni di GP è stato effettuato
mediante il test t di Student per dati appaiati; la valutazione
della associazione tra variabili (numero di piastrine e
concentrazione di GF) è stata effettuata con la correlazione
di Spearman.
I risultati medi delle concentrazioni di GFs sono stati
correlati alla concentrazione piastrinica media dei campioni
testati e alla superficie supporto dell'attivazione, al fine di
quantizzare, seppure in modo estremamente indicativo, la
concentrazione di GF per cm2 di superficie e per individuare
ranges terapeutici dell'emocomponente "gel piastrinico":
allo scopo a L'Aquila è stato utilizzato come supporto per
l'attivazione di 5mL di prodotto una matrice spugnosa di 28
cm2 (Promogran, Wound Management, Johnson &
95
A Rughetti et al.
intact platelets remaining after each cycle of freezing/
thawing. The thermal shock was performed using the
freeze and thaw technique: the samples were frozen
then thawed three times, by swift application of dry ice
at +37 °C. The blood count was carried out after mixing
the samples at room temperature for 2 hours9 on an
LPR3 agitator (Melco Engineering Corp, Glendale, CA,
USA): the distribution curves of the blood cells and
the mean platelet volume were used as criteria to
demonstrate the reliability of the test.
The growth factors were quantitatively assayed using
Quantikine® kits from R&D Systems (SPACE Import-Export
Srl, Milan, Italy), which are based on a sandwich
immunoenzymatic method. Microplates coated with
monoclonal antibodies specific for PDGF-AB and IGF-I,
and soluble type II receptor for TGF-β1 were used; any
growth factor present binds specifically to the
corresponding antibody or receptor. The antigen/antibody
complex is recognized by a secondary polyclonal antibody
conjugated with peroxidase. After addition of the substrate,
the relative concentration of the growth factors, which is
proportional to the optical density of the system, is
evaluated by spectrophotometry in relation to a standard
curve, as described by the kit's manufacturer.
On 36 of the 80 samples of platelet gel (PRP +
cryoprecipitate) still available, in equal proportions from
Belluno and L'Aquila, a second assay of PDGF-AB was
performed, following activation with batroxobin and calcium
gluconate, in a ratio of 1/10, at +20 °C for 1 hour. The samples
were then centrifuged and tested, as described above.
The statistical comparisons between the platelet
concentrations and the levels of growth factors in the
samples of platelet gel were performed using Student's t
test for paired data; the association between variables
(platelet count and concentration of growth factors) was
evaluated with Spearman's correlation. The mean
concentrations of the growth factors were correlated with
the mean platelet concentration in the samples and at the
surface of the activation support in order to quantify, albeit
only very indicatively, the concentration of growth factor
per cm2 of surface and to determine therapeutic ranges for
the platelet gel blood component. The support used at
L'Aquila for this purpose to activate 5mL of product was a
28 cm2 sponge matrix (Promogran, Wound Management,
Johnson & Johnson, Gargrave, Skipton, UK). The
activation support used at Belluno was Hyalofill-F (FAB,
Fidia Advanced Byopolimers – FIDIA s.r.l., Abano Terme,
Padova, Italy), which is available in sheets of 25 and 100
cm2 . In these experiments, 1.8 mL of product was used on
the 25 cm2 sheets.
96
Johnson, Gargrave, Skipton, UK). Analogamente a Belluno
è stato impiegato come supporto Hyalofill-F (FAB, Fidia
Advanced Byopolimers, FIDIA S.r.l., Abano Terme,
Padova, Italia), disponibile in foglietti da 25 e da 100 cm2 ,
utilizzando 1,8 mL di prodotto su preparati da 25 cm2 .
Risultati
In tabella I sono riportate le concentrazioni piastriniche
dei singoli gruppi di L'Aquila e di Belluno e del totale dei
campioni, prima (emocromo del paziente/donatore) e dopo
concentrazione sul mix (PRP + CRIO), evidenziando una
concentrazione media di piastrine di 2.185,5x103/µL, circa
7,8 volte la concentrazione basale. In questa tabella sono
riportate anche le concentrazioni finali di leucociti.
In tabella II vengono riportati i valori delle
concentrazioni dei tre GFs (PDGF-AB, TGF-β1, IGF-I), testati
sul sovranatante dei campioni scongelati e centrifugati,
contenenti, come già detto, piastrine concentrate, leucociti
e crioprecipitato: il dosaggio dei GFs è stato eseguito sui
campioni così costituti, in quanto rappresentativi dei
prodotti utilizzati nella clinica. A causa del notevole costo
dei kit diagnostici utilizzati nonché della discutibile utilità
pratica, non si è proceduto ad un saggio sui singoli
costituenti (plasma, crioprecipitato o altro).
I dati sono relativi al numero totale dei campioni e ai
due singoli gruppi di L'Aquila (metodo 1) e di Belluno
(metodo 2).
Come range viene utilizzato quello di riferimento su
siero, poiché si presume che in esso, a causa dell'avvenuta
coagulazione con conseguente completa liberazione dei
GFs contenuti nelle piastrine, si raggiunga la massima
concentrazione degli stessi su sangue intero; non vengono,
invece, riportati valori di riferimento su PRP, poiché non
contemplati nei kit diagnostici, e dove, d'altro canto, ci si
attende di trovare valori in proporzione maggiori in relazione
alla concentrazione delle piastrine.
L'analisi statistica (Tabella III) evidenzia una
correlazione buona ma non elevata, sebbene statisticamente
significativa, tra la concentrazione di piastrine nei
campioni di GP testati e i livelli di PGDF-AB (r=0,54;
p<0,0001) e TGF-β1 (r=0,50; p<0,0001), ma non con i livelli
di IGF-I (r=-0,09; p=0,39).
Il dosaggio del PDGF-AB eseguito sui campioni
pretrattati con calcio gluconato al 10% e batroxobina è
risultato significativamente più elevato (Tabella IV),
aumentato di circa 5,5 volte rispetto ai valori di riferimento
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
Platelet gel: assay of 3 growth factors
Table I - Mean number of platelets and leucocytes x103 /µL before and after concentration
Origin
Patient/Donor
µL (mean ± SD)
n° Plt x 103/µ
Final product (PRP+Cryo)
µL (mean ± SD)
n° Plt x 10 3/µ
Final product (PRP+Cryo)
µL (mean ± SD)
n° WBC x 103/µ
264.43±69.92
296.00±112.32
280.21±91.11
2,054.00±1021.00
2,317.00±796.33
2,185.50±935.98
20.83±14.96
13.39±3.85
17.11±12.00
SIT L'Aquila (method 1)
SIT Belluno (method 2)
All samples
Abbreviations: Plt = platelets; WBC = white blood cells; PRP = platelet-rich plasma; Cryo = cryoprecipitate; SD = standard deviation
Table II - Results of the platelet growth factor assays performed on 80 samples of platelet gels thawed and centrifuged, but not
activated by calcium gluconate and batroxobin
Growth Factors
Mean reference values in serum
N°
Mean found±SD
PDGF - AB (pg/mL)
20,100 (platelet-poor plasma: 250)
80
46
34
All samples: 71,029±46,811
Method 1 (AQ): 58,169±35,983
Method 2 (BL): 91,985±54,976
TGF- β1 (ng/mL)
48.6 (platelet-poor plasma: 2.2)
80
46
34
All samples: 177.54±117
Method 1 (AQ): 152.7±125
Method 2 (BL): 210.4±119
IGF-1 (ng/mL)
105 (platelet-poor plasma: 90)
80
46
34
All samples: 61.2±81
Method 1 (AQ): 61.71±104
Method 2 (BL): 60.46±27
Abbreviations: PDGF=platelet-derived growth factor; TGF-β1 = transforming growth factor-β1; IGF-1 = Insulin-like growth factor-1;
N° = number of samples; SD = standard deviation; AQ = samples from L'Aquila; BL = samples from Belluno
Results
Table I reports the platelet concentrations of all the
samples and of the groups of samples divided according
to whether they were produced in L'Aquila or Belluno,
before (blood count of the patient or donor) and after
concentration in the PRP + cryoprecipitate mixture.
The mean platelet concentration in the mixture (2,185.5
x 103/µL) was about 7.8 times higher than the basal
concentration.
The final concentrations of white blood cells are
shown in the same table.
Table II shows the concentrations of the three growth
factors (PDGF-AB, TGF-β1, IGF-I), measured in the
supernatants of the thawed and centrifuged samples
containing the platelet concentrates, leucocytes and
cryoprecipitate: the assays of the growth factors were
performed on samples thus constituted, since in this form
they are representative of the products used in clinical
practice.
We did not assay the single constituents (plasma,
cryoprecipitate or other) because of the high cost of the
diagnostic kits and the uncertain practical usefulness of
the results.
The data are reported for all the samples together and
for the samples divided according to whether they were
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
su siero. Sono state calcolate le concentrazioni di GFs
utilizzati nella clinica in base al volume di prodotto per cm2
di matrice di supporto per l'attivazione: a scopo indicativo,
in tabella V vengono presentati i soli dati relativi al PDGFAB, dopo attivazione con calcio gluconato e batroxobina
del mix PRP + CRIO (110.215,44pg/mL), in relazione anche
alla concentrazione media di piastrine, poiché maggiormente
rappresentativi del prodotto terapeutico.
Discussione
I risultati evidenziano una buona correlazione tra numero
di piastrine e PDGF-AB e TGF-β1, ma non con IGF-I.
I valori di PDGF-AB riscontrati sono significativamente
più elevati rispetto a quelli di riferimento su siero e risultano
aumentati di circa 4 volte; quelli relativi al TGF-β1 risultano
aumentati di circa 3,6 volte; quelli dell'IGF-I non mostrano,
invece, variazioni di rilievo rispetto ai valori di riferimento
su siero (Tabella II e Tabella III).
Poiché da risultati preliminari, ottenuti mediante l'analisi
di correlazione di Spearman, non è stato individuato l'atteso
rapporto tra dosaggio dei fattori di crescita e
concentrazione di piastrine, è stato nuovamente eseguito
il conteggio piastrinico sui campioni scongelati di mix PRP
+ CRIO e si è visto che, nonostante il congelamento del
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A Rughetti et al.
Table III - Correlation between the platelet concentration in samples of platelet gel (not activated with batroxobin and calcium
gluconate) and the growth factor concentrations
Variables
Statistical tests
Spearman's correlation coefficient (r)
Student's t test for paired data (p)
0.54
0.50
-0.09
<0.0001
<0.0001
0.39
PGDF-AB/Plt concentration
TGF-β1/Plt concentration
IGF-1/Plt concentration
Abbreviations: Plt = platelets
Table IV - Results of the PDGF-AB assay on 36 samples tested before and after activation with batroxobin and calcium gluconate 10%
GF
N°
Mean reference value in serum
Pre-activation ± SD
Post-activation ± SD
p
PDGF-AB
36
20,100 pg/mL (in plasma: 250)
83,350.14 ± 53,736.40
11.0215.44 ± 65,869.30
0.0106
Abbreviations: GF = growth factor; N° = number of samples; SD = standard deviation; p = Student's t test for paired data
Table V - Examples of mean concentration of PDGF-AB per cm2 of surface after activation with batroxobin and calcium gluconate
Volume of product
(PRP + Cryo)
Support used
for the activation
µL
n° Plt x 103/µ
Mean conc. of
Plt (PRP + Cryo)
Mean conc. of
PDGF-AB (pg/mL)
Mean conc. of
PDGF-AB (pg/cm 2)
5mL
1.8mL
Promogran (28 cm2 )
Hyalofill (25 cm2)
2,185.50
110,215.44
19,681.3
7,935.5
Abbreviations: Conc. = concentration; Plt = platelets.
produced in L'Aquila (method 1) or Belluno (method 2).
The reference ranges used are those for the concentrations
in serum, since it is assumed that the concentrations
present in the serum will be maximum, because of the
coagulation and consequent complete release of the growth
factors from the platelets in the whole blood; reference
values for PRP are not reported, because these are not
foreseen in the diagnostic kits and, in any case, the
proportions would be higher in relation to the concentration
of platelets.
As shown in Table III, the statistical analysis revealed
a correlation, which, although statistically significant, was
not strong, between the concentration of platelets in the
samples of platelet gel tested and the levels of PGDF-AB
(r=0.54; p<0.0001) and TGF-β1 (r=0.50; p<0.0001), but not
of IGF-1 (r=-0.09; p=0.39).
The concentration of PDGF-AB found in samples
pretreated with batroxobin and calcium gluconate 10% was
significantly higher (Table IV), being about 5.5 times greater
than the reference concentration in serum.
The concentrations of growth factors used clinically
were measured, based on the volume of product per cm2 of
support matrix for activation: table V presents, merely as
an indicative example, the data related to PDGF-AB, after
activating the PRP + cryoprecipitate mixture with batroxobin
98
campione a –80 °C, rimaneva integro un notevole numero
di piastrine, dell'ordine di circa il 30%. Successivi
congelamenti/scongelamenti dei campioni hanno
evidenziato un numero decrescente di piastrine integre
all'aumentare del numero di cicli di trattamento.
Tali dati implicano una sottostima della concentrazione
dei fattori di crescita dovuta al mancato rilascio degli stessi
da parte delle piastrine ancora integre.
Per ovviare a tale inconveniente, e per avere, quindi, il
maggior rilascio di GFs, si è deciso di ripetere i dosaggi sui
36 campioni ancora disponibili dopo attivazione con calcio
gluconato e batroxobina, nelle stesse condizioni e con le
stesse modalità impiegate per l'attivazione del GP per uso
clinico, ipotizzando un coinvolgimento di tutte le piastrine
nel rilascio dei GFs dopo attivazione.
Il rilascio immediato e massiccio dei GFs potrebbe non
essere più utile di una liberazione parziale ma prolungata
nel tempo, anche se sono stati descritti meccanismi di
rigenerazione tessutale in cui i GFs liberati innescano degli
eventi a cascata con richiamo e attivazione di macrofagi e
fibroblasti, che rilasciano a loro volta GFs ed altre citochine
con autosostegno del meccanismo3,8.
In via preliminare sono stati ripetuti i dosaggi del solo
PDGF-AB; è tuttora in corso di valutazione l'opportunità di
ripetere il test anche per l'IGF-I e per il TGF-β1 su campioni
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
Platelet gel: assay of 3 growth factors
and calcium gluconate (110,215.44 pg/mL), and also the
mean concentration of platelets, since this is most
representative of the therapeutic product.
Discussion
The results show a good correlation between the
number of platelets and PDGF-AB and TGF-β1
concentrations, but not with IGF-1.
The values of PDGF-AB were about 4 times higher than
those in reference serum, which was a statistically
significant increase; the values of TGF-β1 were about 3.6
times higher, whereas those of IGF-1 were not significantly
different from the reference values in serum (Tables II
and III).
Since the preliminary results, obtained by Spearman's
correlation analysis, did not demonstrate the expected
relationship between levels of growth factors and platelet
concentration, the platelet count was repeated on thawed
samples of PRP + cryoprecipitate mixtures.
It was seen that, despite freezing the sample to –80 °C,
a considerable number of platelets (approximately 30%)
remained intact.
Successive cycles of freezing and thawing the samples
showed that the number of intact platelets decreased as
the number of treatment cycles increased.
This finding implies that growth factor concentrations
were underestimated because the still intact platelets had
not released all their growth factors.
In order to overcome this problem and obtain greater
release of growth factors, 36 samples still available were
activated with calcium gluconate and batroxobin under the
same conditions and with the same methods as those used
for activating the platelet gel for clinical use, with the
hypothesis that all the platelets would their release growth
factors after activation.
The growth factor assays were repeated after this
activation.
Immediate and massive release of growth factors may,
in fact, not be as useful as a partial but protracted release,
although there are descriptions of tissue regeneration
mechanisms in which the growth factors released trigger a
cascade of events with attraction and activation of
macrophages and fibroblasts which, in their turn, release
growth factors and other cytokines in a self-sustaining
manner3,8.
As a preliminary approach, only the assays of PDGFAB were repeated; the value of repeating the tests for
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
attivati. Dai risultati si può osservare che tutti i fattori di
crescita, eccetto l'IGF-I, sono mediamente più elevati nei
campioni provenienti da Belluno rispetto a quelli di
L'Aquila. È doveroso a tale proposito osservare che già in
partenza (Tabella I) il numero di piastrine risulta più elevato
nei campioni di Belluno (emocromo del paziente/donatore)
e che i campioni di GP sono stati prodotti mediante
separatore cellulare con maggiori possibilità di
standardizzazione della resa piastrinica.
È anche possibile osservare una maggiore
concentrazione di fattori di crescita nei campioni di GP testati
dopo attivazione con calcio gluconato e batroxobina
(Tabella IV).
Analogamente, in un lavoro del 2004, è stato evidenziato
un significativo aumento del rilascio di GFs addizionando
cloruro di calcio e trombina a concentrati piastrinici, anche
se, a differenza del presente studio, è stata studiata la cinetica
di numerosi GFs su colture di cinque campioni di concentrati
piastrinici e dove, però, non è stato testato l'IGF-I9.
In relazione alla individuazione di ranges terapeutici di
GFs liberati dal GP nella sede di lesione, si può dire soltanto,
al momento attuale, che con le concentrazioni medie
ottenute (Tabella V), sia il gruppo di Belluno, sia quello di
L'Aquila, hanno riscontrato un'efficacia clinica
statisticamente significativa nel trattamento delle ulcere
cutanee croniche10,11. Inoltre l'impiego di supporti per
l'attivazione del prodotto consente di conformare il foglietto
alla lesione e di ottimizzare la quantità di emocomponente.
Per l'IGF-I la ditta produttrice del kit indica valori
estremamente simili tra siero e plasma; contrariamente alle
aspettative, in entrambi i gruppi di campioni, è stata
evidenziata una concentrazione addirittura inferiore al range
di riferimento (Tabelle II e III).
L'IGF-I, tuttavia, potrebbe subire una degradazione più
rapida rispetto ad altri GFs9 o non essere prodotto
direttamente dalle piastrine bensì dai fibroblasti mediante
un meccanismo di attivazione a cascata innescata dal GP,
così come evidenziato da altri12.
Nonostante le difficoltà preanalitiche, dovute al fatto
che il GP è un tipo di campione biologico non ancora
contemplato dalle ditte produttrici nei kit per il dosaggio
dei growth factors piastrinici (in cui vengono considerati
come campioni soltanto plasma o siero), sembra esserci
una buona correlazione tra livelli di PDGF-AB e TGF-β1 e
concentrazione di piastrine (Tabella III).
Uno studio comparabile, eseguito con gli stessi kit su
PRP (plasma ricco di piastrine), ha evidenziato risultati del
tutto simili13.
99
A Rughetti et al.
IGF-1 and TGF-β1 on activated samples is still under
discussion. It can be seen from the results that, on
average, the concentrations of the growth factors, with
the exception of IGF-1, were higher in samples from
Belluno than in samples from L'Aquila. It is essential to
point out that the platelet count (blood counts of patients
or donors) was higher in samples from Belluno already
from the start (Table I) and that the samples of platelet
gel were produced with a cell separator giving greater
possibility of standardizing the platelet yield.
It can also be seen that the concentrations of growth
factors were higher in the samples of platelet gel tested
after activation with calcium gluconate and batroxobin
(Table IV). These results are similar to those of a study
published in 2004, which reported a significant increase
in the release of growth factors after addition of calcium
chloride and thrombin to platelet concentrates although,
unlike the present study, the kinetics of the numerous
growth factors were studied on cultures of five samples
of platelet concentrates and IGF-1 was not assayed9.
As far as concerns determining therapeutic ranges
of growth factors released from the platelet gel in the
site of the lesion, it can only be said that, at present, the
mean concentrations obtained (Table V), by both the
Belluno group and that at L'Aquila, produced statistically
significant clinical effects in the treatment of chronic
skin ulcers10,11. Furthermore, the sheets used as product
activation supports can be shaped to match the lesion and
thus optimise the amount of the blood component applied.
The company producing the kit to assay IGF-1
reported extremely similar values for the concentration
of this growth factor in both serum and plasma; in
contrast to expectations, we found that the
concentration of IGF-1 in both groups of samples was
below the reference range (Tables II and III).
It is possible that IGF-1 could be degraded more rapidly
than the other growth factors9 or it might not be produced
directly by the platelets but rather by the fibroblasts
through a activation mechanism involving a cascade
triggered by the platelet gel, as indicated by other
researchers12. Despite the pre-analytic difficulties resulting
from the fact that platelet gel is a biological sample not
yet considered by companies that produce kits for
assaying platelet growth factors (the kits are designed
only for plasma and serum samples), there seems to be a
good correlation between the levels of PDGF-AB and TGFβ1 and the platelet concentration (Table III).
A comparable study, carried out with the same kits on
platelet-rich plasma, produced very similar results13.
100
Conclusioni
Lo studio effettuato evidenzia elevati livelli di PDGFAB e TGF-β1 nei campioni di GP testati, che, per il PDGFAB, previa attivazione con calcio gluconato al 10% e
batroxobina, hanno evidenziato livelli significativamente
più elevati rispetto ai campioni non attivati.
È interessante pensare di mettere a punto una metodica
nel trattamento preanalitico del GP, quale quella utilizzata
in questo studio, per ottenere la massima liberazione dei
fattori di crescita piastrinici con maggiore standardizzazione
e attendibilità dei dosaggi. È, invece, opportuno studiare
meglio, o con modalità alternative, l'IGF-I, "misurato" a livelli
molto bassi sui campioni di GP e/o estendere lo studio a
colture di fibroblasti.
Riassunto
Premessa. Il gel piastrinico viene utilizzato per
promuovere ed accelerare la riparazione tessutale
mediata dai fattori di crescita piastrinici, liberati nella
sede di lesione.
Obiettivi. Quantificare la concentrazione di PDGFAB, IGF-I e TGF-β1 in preparazioni ad uso clinico per
valutarne la correlazione con il conteggio piastrinico e
per individuare ranges terapeutici degli stessi.
Materiali e metodi. Sono stati analizzati 80 campioni
costituiti da un mix di piastrine iperconcentrate e da
crioprecipitato, 54 autologhi e 26 omologhi, da pazienti/
donatori; 46 sono stati prodotti presso il SIT di L'Aquila
mediante sacca multipla, 34 presso il SIT di Belluno
mediante aferesi. I dosaggi sono stati eseguiti con kit
Quantikine® R&D Systems sul sovranatante di campioni
conservati a –80 °C, scongelati e centrifugati; la
concentrazione di PDGF-AB è stata valutata anche dopo
attivazione con trombina e calcio.
L'analisi statistica dei risultati è stata effettuata
mediante test t di Student per dati appaiati e correlazione
di Spearman.
Risultati. La concentrazione piastrinica sui campioni
è risultata di 7,8 volte quella basale. I dosaggi di
PDGF-AB e di TGF-β1 sul sovranatante dei campioni
scongelati sono risultati aumentati di circa 4 volte rispetto
ai valori di riferimento (siero): r=0,54 e p<0,0001 per
PDGF-AB; r=0,50 e p<0,0001 per TGF-β1.
È stata evidenziata maggiore correlazione tra le due
variabili nei campioni dopo attivazione con calcio e
batroxobina, con una differenza statisticamente
Blood Transfus 2006; 4: 92-101
Platelet gel: assay of 3 growth factors
Conclusions
This study shows that the levels of PDGF-AB and TGFβ1 were high in the samples of platelet gel tested and that
the concentration of PDGF-AB was significantly higher
following activation of the mixture with batroxobin and
calcium gluconate 10% than in non-activated samples.
It is interesting to consider defining a method that could
be used in the pre-analytic treatment of platelet gel, such
as the method described in this study, to obtain the
maximum release of platelet growth factors with greater
standardization and reliability of the assays.
Furthermore, it would be worth finding better or different
ways of studying IGF-1, found at very low levels in the
samples of platelet gel, and/or extend the study to fibroblast
cultures.
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Blood Transfus 2006; 4: 92-101
significativa tra concentrazioni di PDGF prima e dopo
attivazione (p=0,0106). La concentrazione di IGF-I non
è risultata correlata alla concentrazione delle piastrine
(r=-0,09; p=0,39).
Conclusioni. È stata riscontrata buona correlazione
tra concentrazione di piastrine e livelli di PDGF-AB e
TGF-β1, ma non di IGF-I; livelli superiori e statisticamente
significativi di PDGF-AB sono stati rilevati dopo
attivazione e centrifugazione dei campioni.
Parole-chiave: gel piastrinico, PDGF-AB, TGF-β1, IGF-I
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